معلومة

8.10: التشابك وغزو الخيوط الفردية - علم الأحياء

8.10: التشابك وغزو الخيوط الفردية - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

اقتران جزيئي الحمض النووي المعاد توحيدهما (المشبك) و غزو ​​واحد ساحل من الدوبلكس البادئ إلى الدوبلكس الآخر يتم تحفيزهما بواسطة البروتين متعدد الوظائف ريكا. ينتج عن هذا الغزو للحمض النووي المزدوج بواسطة الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل استبدال أحد خيوط الدوبلكس الأصلي بالحبل الغازي ، ويتم إزاحة الشريط المستبدل من الاتجاه المزدوج. ومن ثم يمكن أيضًا استدعاء هذا التفاعل ساحل الاستيعاب أو تبادل حبلا. لدى RecA العديد من الأنشطة ، بما في ذلك تحفيز وظيفة البروتياز لـ LexA و UmuD (انظر الفصل 7) ، وربط وطلاء الحمض النووي أحادي السلسلة ، وتحفيز الاقتران المتماثل بين الحمض النووي أحادي السلسلة والمزدوج ، واستيعاب الحمض النووي أحادي السلسلة في مزدوج ، و تحفيز التحلل المائي لـ ATP في وجود DNA (أي أنه ATPase يعتمد على الحمض النووي). مطلوب في جميع المسارات الثلاثة لإعادة التركيب. على سبيل المثال ، يمكن استيعاب جزيء الحمض النووي بنهاية مفردة 3 'تم إنشاؤها بواسطة إنزيم RecBCD في منطقة متماثلة من مزدوج آخر ، يتم تحفيزها بواسطة RecA وتتطلب التحلل المائي لـ ATP (الشكل 8.14).

الشكل 8.14.يمكن للخيط الفردي من الحمض النووي بنهاية 3 'الحرة ، الذي تم إنشاؤه بواسطة إنزيم RecBCD ، غزو جزيء DNA مزدوج متماثل في تفاعل يروج له RecA. موقع تشي قريب من الطرف 3 من الخيط الفردي. يظهر جزيء الحمض النووي الغازي بخط رفيع أزرق لكل خيط. الجزيء المستهدف عبارة عن دائرة مزدوجة ، تظهر كخط رمادي سميك لكل خيط. مطلوب ATP لهذا التفاعل ، ويتحلل إلى ADP والفوسفات.

تحدث عملية الاستيعاب أحادي الخيط في ثلاث خطوات ، كما هو موضح في الشكل 8.15. أولاً ، تتبلمر RecA على DNA أحادي السلسلة في وجود ATP لتشكيل خيوط ما قبل المشبكي. يقع الشريط الفردي للحمض النووي داخل أخدود عميق لبروتين RecA ، والعديد من جزيئات RecA-ATP تغلف الحمض النووي أحادي السلسلة. يغطي جزيء واحد من بروتين RecA 3 إلى 5 نيوكليوتيدات من الحمض النووي أحادي الجديلة. يتم تمديد النيوكليوتيدات محوريًا بحيث تكون متباعدة بنحو 5 أنجستروم في الحمض النووي أحادي السلسلة ، أي حوالي 1.5 مرة أطول مما كانت عليه في حالة عدم وجود RecA-ATP.

بعد ذلك ، يتم محاذاة الشعيرة قبل المشبكية مع المناطق المتماثلة في الحمض النووي المزدوج. يتم تثبيت طول كبير من الخيوط الثلاثة معًا بواسطة polumer من جزيئات RecA-ATP. تشكل الضفيرة المزدوجة والمفردة المحاذاة أ المفصل المصاب بجنون العظمة، مما يعني أن الخصلة المفردة لا تتشابك مع الخصلة المزدوجة في هذه المرحلة. يمتد الحمض النووي المزدوج ، مثل الحمض النووي أحادي السلسلة ، إلى حوالي 1.5 مرة أطول من الحمض النووي ذي الشكل B الطبيعي (18.6 نقطة أساس لكل دورة). يُعتقد أن هذا الامتداد مهم في الاقتران المتماثل.

أخيرًا ، يتم تبادل الخيوط من لتشكيل ملف المفصل الوبائي. في هذه المرحلة ، يتم الآن تشابك الخيط الفردي الغازي مع الخيط التكميلي في الازدواج ، ويتم الآن تهجير خيط واحد للغزو المزدوج. في بكتريا قولونية، يحدث التبادل في اتجاه 5 'إلى 3' بالنسبة إلى الخيط المفرد ويتطلب تحلل ATP المائي. في المقابل ، يتسبب متماثل الخميرة ، Rad51 ، في غزو الخيط المفرد بقطبية معاكسة ، أي 3 'إلى 5'. وبالتالي فإن اتجاه هذه القطبية ليس سمة محفوظة عالميًا لآليات إعادة التركيب.

نتاج الاستيعاب الخيطي هو مضاعف مزدوج حيث كان أحد خيوط الدوبلكس هو الحمض النووي الأصلي أحادي الجديلة. يتم تهجير الخيط الآخر للوحدة الأصلية على الوجهين.

الشكل 8.15. دور RecA في استيعاب الحمض النووي أحادي الجديلة. يظهر جزيء الحمض النووي بنهاية 3 بوصات بخط أزرق سميك لكل خيط. تشير A و B و C إلى تسلسل DNA معين. يظهر مزدوج متماثل بخطوط حمراء رفيعة لكل خصلة ، مع a و b و c متماثل مع A و B و C على التوالي. RecA هو شكل بيضاوي برتقالي-بني. لها شكل (شكل) مختلف عندما تكون ATP (الدائرة الخضراء) منضمة. يولد نشاط ATPase لـ RecA ADP (دائرة حمراء) وتشكيلًا متغيرًا لـ RecA ، والذي ينفصل عند استيعاب الخيط الفردي. يدخل الخيط الفردي إلى الوجهين بقطبية 5 إلى 3 (بالنسبة لاتجاه الخيط الفردي الغازي).

تم الكشف عن العديد من تفاصيل نشاط RecA بواسطة في المختبرالمقايسات لاستيعاب حبلا واحد ، أو تبادل حبلا. يجب أن تفي ركائز الحمض النووي الخاصة بتبادل الخيوط المحفزة بواسطة RecA بثلاثة متطلبات. يجب أن تكون هناك منطقة من الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل والتي يمكن لـ RecA أن ترتبط بها وتتبلمر ، ويجب أن يكون للجزيئين اللذين يخضعان لتبادل الخيوط منطقة تماثل ، ويجب أن تكون هناك نهاية خالية داخل منطقة التماثل. يمكن التغلب على الشرط الأخير من خلال توفير إيزوميراز توبويزوميراز.

أحد هذه الاختبارات هو تحويل DNA دائري أحادي السلسلة إلى دائرة مزدوجة (الشكل 8.16). ركائز هذا التفاعل عبارة عن دنا دائري أحادي السلسلة وخطي مزدوج متماثل. يتم خلطها معًا في وجود RecA و ATP. تقوم العديد من جزيئات RecA-ATP بتغطية الدائرة المفردة التي تقطعت بها السبل لتشكيل خيوط ما قبل المشبك للبروتين النووي ، كما نوقش أعلاه. أثناء التشابك ، يبدأ التلدين بنهاية 3 'من الخيط المكمّل للدائرة المفردة التي تقطعت بهم السبل. وهكذا يغزو الخيط الفردي قطبية 5 إلى 3 (بالإشارة إلى قطبيته). ينتج عن إزاحة السلك ، مدفوعًا بالتحلل المائي ATP لفصل RecA ، تكوين دائرة مقطوعة (كان أحدها هو الدائرة الأصلية أحادية الجديلة) وخيطًا واحدًا خطيًا من الحمض النووي.

الشكل 8.16. اختبار في المختبر للاستيعاب أحادي الخيط المحفز بواسطة RecA plus ATP. يؤدي تبادل السلك بين دائرة غازية أحادية الجديلة (خط أزرق سميك) وحمض نووي خطي مزدوج (خطوط حمراء رفيعة) ، بوساطة RecA plus ATP ، إلى دائرة مزدوجة مقطوعة وحمض نووي خطي أحادي الجديلة مغطى بربط أحادي السلسلة البروتين ، أو SSB. المنطقتان B و C متماثلتان للمنطقة b و c على التوالي ؛ يتم عرضها كعلامات ولكن الحمض النووي بأكمله في كلا الجزيئين متماثل. يساعد SSB على تحفيز هذا التفاعل من خلال مساعدة RecA على التغلب على البنية الثانوية في الحمض النووي أحادي الجديلة.

يمارس

حاول ربط هذا في المختبر فحص الخطوات في نموذج الكسر المزدوج لإعادة التركيب. ما هي الخطوة (الخطوات) في النموذج التي يحاكيها هذا؟ ما المطلوب أيضًا للوصول إلى المفاصل المؤتلفة (تقاطعات هوليدي)؟

هيكل E. القولونيةتم حل RecA المرتبط بـ ADP ، المونومر والبوليمر ، عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية. كما هو مبين في الشكل 8.17 ، يحتوي المجال المركزي على موقع ارتباط لـ ATP و ADP ، ويفترض أنه موقع ربط الحمض النووي أحادي الجديلة ومزدوج الجديلة. المجالات الممتدة بعيدًا عن المنطقة المركزية تشارك في بلمرة بروتينات RecA وفي التفاعلات بين ألياف ما قبل المشبكي.

الشكل 8.17. نظرة ثابتة للبنية ثلاثية الأبعاد لـ RecA ، كما حددها R.M Story و T. A. Steitz (1992) "هيكل مركب recA protein-ADP" Nature 355: 374-376. تظهر حلزونات ألفا على شكل أسطوانات خضراء مع التفاف العمود الفقري الببتيد حولها. صفائح بيتا عبارة عن أسهم صفراء بنية ، ومناطق أخرى من العمود الفقري للببتيد زرقاء. يظهر ADP كمخطط سلكي ، مع ذرات C رمادية ، N ذرات بيضاء ، ذرات O حمراء وذرات P برتقالية. تم الحصول على الإحداثيات الذرية من خادم MMDB في NCBI وتم تقديمها في CN3D. يتم عرض لقطة شاشة لعرض واحد. تتوفر ملفات للعرض الافتراضي ثلاثي الأبعاد على موقع الدورة التدريبية على الويب. (CC BY-SA 3.0 ؛ Emw).

البروتينات متماثلة لـ E. القولونية تم العثور على RecA في الخميرة (Rad51 و Dmc1) وفي الفئران (Rad51). بالنظر إلى عالمية إعادة التركيب ، فمن المحتمل أن توجد متماثلات في جميع الأنواع تقريبًا. الطفرات في E. القولونية يقلل الجين recA إعادة التركيب الاقتراني بما يصل إلى 10000 ضعف ، لذلك من الواضح أن RecA يلعب دورًا مركزيًا في إعادة التركيب. ومع ذلك ، فإن الطفرات الفارغة في recA نكون ليس مميتة ، ولا طفرات لاغية في متماثلات الخميرة RAD51 و DMC1. في المقابل ، الفئران متماثلة اللواقح لطفرة خروج المغلوب في راد 51 يموت الجين في مرحلة مبكرة جدًا من التطور ، في مرحلة الخلايا الأربع. يشير هذا إلى أنه في الفئران ، يلعب متماثل RecA هذا دورًا جديدًا في النسخ المتماثل أو الإصلاح ، بالإضافة إلى دوره في إعادة التركيب على الأرجح.


ميجانوكليز I-SceI

Su-qi Zou و. بنج هو ، في التجديد العصبي ، 2015

4.3 تقنية جديدة لمعالجة الجينات

المفتاح لبناء خطوط معدلة وراثيا هو زيادة نسبة التألق واستقرار الوراثة. فى السنوات الاخيرة، تول 2 ينقل- و أنا SceI لقد حسنت تقنية التحوير بوساطة الميغانوكلياز بشكل كبير من الكفاءة المعدلة وراثيًا في أسماك الزرد [210-214]. الانتماء إلى عائلة القبعات (المتشرد من ذبابة الفاكهة, مكيف من الذرة و تام 3 من snapdragon) ، فإن تول 2 تم العثور على عنصر قابل للتحويل في جينوم أسماك الميداكا ، لاتيبس اوريزيا [215]. لم يتم العثور عليه في جينوم الزرد. حدد فريق Kawakami عضوًا مستقلاً في تول 2 عنصر يشفر جين ترانسبوزيز وظيفي ويمكن أن يحفز التحول في كل من سلالة جرثومة الزرد والخلايا الجذعية الجنينية للفأر. بعيد جدا، تول 2 هو ناقل الدنا الطبيعي الوحيد من عضو مستقل محدد في الفقاريات [210-214].

الميغانوكلياز أنا SceI، ترميز نوكلياز داخلي موجه ، هو intron معزول عن الخميرة خميرة الخميرة [216]. لا يوجد سوى 18 نقطة أساس أنا SceI موقع التعرف على التسلسل العشوائي 7 × 10 10 نقطة أساس ، لذلك نادرًا ما يوجد في جينوم الفقاريات (على سبيل المثال ، جينوم ميداكا 7 × 10 8-بي بي) [217،218]. ومع ذلك ، فإن أنا SceI الميغانوكلياز ، بخلاف التكامل بوساطة نوكلياز التقييد ، لا يقطع الحمض النووي الجيني ، ولكنه يهضم الحمض النووي المحقون فقط. الحقن المشترك لل أنا SceI الميغانوكلياز والجين المراسل يعززان بشكل كبير التعبير الجيني (المعتمد على المحفز) في F0 ويزيدان الكفاءة المعدلة وراثيًا [217-220].


8.10: التشابك وغزو الخيوط الفردية - علم الأحياء

بروتين RecT الإشريكية القولونيةهو بروتين يقترن بالحمض النووي مطلوبًا لأحداث إعادة التركيب المستقلة عن RecA التي يروج لها مسار RecE. تم العثور على بروتين RecT يرتبط بكل من الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) والحمض النووي المزدوج (dsDNA) في غياب Mg 2+. في وجود Mg 2+ ، تم تثبيط ارتباط RecT بـ dsDNA بشكل كبير ، بينما تم تثبيط الارتباط بـ ssDNA إلى حد صغير فقط. عززت RecT نقل أليغنوكليوتيد أحادي الجديلة إلى مزدوج متماثل فائق الالتفاف لتشكيل حلقة D (الإزاحة). حدث تكوين الحلقة D في غياب Mg 2+ وعند 1 m Mg 2+ ولكن تم تثبيطه بزيادة تركيزات Mg 2+ ولم يتطلب عامل مساعد عالي الطاقة. تم التوسط في نقل السلك بواسطة مركب بروتين نووي RecT-ssDNA يتفاعل مع الحمض النووي المزدوج العاري وتم منعه عن طريق تكوين مجمعات البروتين النووي RecT-dsDNA. أخيرًا ، توسطت RecT في تكوين جزيئات مشتركة بين DNA فائق الالتفاف وركيزة dsDNA خطية ذات ذيول متجانسة 3′ أحادية الجديلة. تشير هذه النتائج معًا إلى أن RecT ليس بروتينًا مزعزعًا للاستقرار الحلزوني يعزز تفاعل إعادة التجديد ، بل هو نوع جديد من بروتين الاقتران القادر على تعزيز إعادة التركيب من خلال آلية غزو خيوط الحمض النووي. تتوافق هذه النتائج مع الملاحظة التي تفيد بأن RecE (نوكلياز خارجي VIII) و RecT يمكنهما تعزيز إصلاح كسر حبلا مزدوج مستقل عن RecA في بكتريا قولونية.


الملخص

التفاعل المركزي في إعادة التركيب المتماثل هو المشابك ، والذي ينطوي على غزو الحمض النووي المزدوج بواسطة خيط واحد متماثل. الوسيط الرئيسي في هذه العملية هو خيوط ما قبل المشبكي ، وهو مركب بروتين-دنا يتكون من "حبلا ترانسفيراز" مبلمر على طول الخيط المفرد الغازي. في هذا التقرير ، يتم استكشاف تنظيم وآلية تجميع الفتيل قبل المشبكي T4 العاثيات. تشارك ثلاثة بروتينات T4 ، مشفرة بواسطة uvsX و uvsY و 32 جينًا ، في هذه العملية. تم إثبات أن سلسلة محددة جيدًا من الأحداث التي تتضمن تفاعلات متعددة بين البروتين والحمض النووي والبروتين والبروتين مطلوبة للتوسط في الانتقال من معقد الجين 32-DNA الأولي إلى خيوط ناضجة قبل المشبكية حيث يكون بروتين UvsX و UvsY على اتصال مع الحمض النووي وبعضها البعض ، بينما تتم إزالة معظم أو كل بروتين الجين 32 من المركب.

لمن ينبغي أن تعالج المراسلات. الفاكس: 512-471-5680 البريد الإلكتروني: [email & # 160protected]


إعادة التركيب: التعريف والآلية والأنواع | علم الاحياء المجهري

في هذه المقالة سوف نناقش حول: - 1. تعريف إعادة التركيب 2. آلية إعادة التركيب 3. أنواع.

تعريف إعادة التركيب:

تتمثل أهم ميزات الكائنات الحية في التكيف في البيئة والحفاظ على تسلسل الحمض النووي الخاص بها في توليد الخلايا للأجيال مع القليل من التعديلات. يعتمد بقاء الكائنات الحية على المدى الطويل على الاختلافات الجينية ، وهي ميزة أساسية يمكن من خلالها للكائن أن يتكيف مع بيئة تتغير بمرور الوقت.

يحدث هذا التباين بين الكائنات الحية من خلال قدرة الحمض النووي على الخضوع لإعادة الترتيب الجيني مما يؤدي إلى تغيير بسيط في تركيبة الجينات. تحدث إعادة ترتيب الحمض النووي من خلال إعادة التركيب الجيني.

وبالتالي ، فإن إعادة التركيب هي عملية تكوين كروموسوم مؤتلف جديد من خلال دمج المادة الوراثية من كائنين. تظهر المؤتلفات الجديدة تغييرات في الصفات المظهرية.

تُظهر معظم حقيقيات النوى دورة حياة جنسية كاملة بما في ذلك الانقسام الاختزالي ، وهو حدث مهم يولد تركيبات أليلية جديدة عن طريق إعادة التركيب. أصبح ممكنًا من خلال التبادل الكروموسومي الناتج عن العبور بين الكروموسومين المتماثلين اللذين يحتويان على متواليات جينية متطابقة.

تم إنجاز الكثير من العمل على علم الوراثة حقيقية النواة حتى عام 1945 الذي وضع أساس علم الوراثة الكلاسيكي. تم إجراء العمل على علم الوراثة البكتيرية بين عامي 1945 و 1965 والذي طور فهم الجينات الميكروبية على المستوى الجزيئي.

آلية إعادة التركيب:

في الأساس ، هناك ثلاث نظريات ، الكسر ولم الشمل ، الكسر والنسخ واختيار النسخ الكامل الذي يشرح آلية إعادة التركيب (الشكل 8.23).

(ط) الكسر ولم الشمل:

اثنين من الازدواج المتماثل للكروموسوم وضع في شكل أزواج فواصل بين الجين أ و ب ، و أ + و ب + (الشكل 8.23 ​​أ). تنضم المقاطع المكسورة بالعرض وتنتج مواد مؤتلفة تحتوي على قطعة a و b + و a + و b. هذا النوع من إعادة التركيب لا يتطلب تخليق DNA جديد. تم استخدام هذا المفهوم لشرح إعادة التركيب الجيني.

(2) الكسر والنسخ:

حلزون واحد من الكروموسوم المتماثل المزدوج (ab و a + b +) ينقسم بين a و b (الشكل 8.23 ​​ب). يتم استبدال الجزء "ب" بمقطع مركب حديثًا منسوخًا من b + وإرفاقه بقسم. وهكذا تحتوي المؤتلفات على و ab + و a + b +.

(3) خيار النسخ الكامل:

في عام 1931 ، اقترح بيلنج هذه النظرية لإعادة تركيب الكروموسوم في الحيوانات العليا. ومع ذلك ، فقد تم استجوابها من قبل العديد من العمال. لذلك ، لها أهمية تاريخية فقط.

وفقًا لهذه النظرية ، يعمل جزء من خيط أبوي واحد من الكروموسوم المتماثل كقالب لتركيب نسخة من جزيء الحمض النووي الخاص به. تنتقل عملية النسخ إلى السلسلة الأبوية الأخرى. وهكذا ، تحتوي المؤتلفات على بعض المعلومات الجينية لجدول أبوي واحد وبعض الخيط الآخر (الشكل 8.23 ​​ج).

أنواع إعادة التركيب:

تحدث أنواع كثيرة من إعادة التركيب في الكائنات الحية الدقيقة.

يتم تصنيف هذه بشكل أساسي في المجموعات الثلاث التالية:

(2) إعادة التركيب غير المتبادل ، و

(3) إعادة التركيب الخاصة بالموقع.

(ط) إعادة التركيب العام:

يحدث إعادة التركيب العام فقط بين الخيوط التكميلية لجزيئي DNA متماثل. استعرض سميث (1989) إعادة التركيب المتماثل في بدائيات النوى. تسترشد إعادة التركيب العام في الإشريكية القولونية بتفاعلات الاقتران القاعدية بين الخيوط التكميلية لجزيئي دنا متماثل.

ينكسر اللولب المزدوج لجزيئي الحمض النووي وينضم الطرفان المكسوران إلى شركائهما المعاكسين ليجتمعوا مرة أخرى لتشكيل حلزون مزدوج. يمكن أن يحدث موقع التبادل في أي مكان في تسلسل النوكليوتيدات المتجانسة حيث يصبح خيط من جزيء DNA واحد قاعدة مقترنة بالحبل الثاني لإنتاج مضاعف مضاعف بين حلزوني مزدوج فقط (الشكل 8.24).

في حالة الانقسام المزدوج ، لا يتم تغيير تسلسل النيوكليوتيدات في موقع التبادل بسبب الانقسام والانضمام إلى الأحداث. ومع ذلك ، يمكن أن تحتوي المفاصل غير المتجانسة على عدد صغير من أزواج القاعدة غير المتطابقة.

يُعرف إعادة التركيب العام أيضًا باسم إعادة التركيب المتماثل لأنه يتطلب صبغيات متماثلة. يتم إجراء إعادة التركيب العام في البكتيريا والفيروسات بواسطة منتجات جينات rec مثل بروتين RecA. يعتبر بروتين RecA مهمًا جدًا لإصلاح الحمض النووي ، وبالتالي فهو إعادة تركيب يعتمد على إعادة التركيب.

نموذج هوليداي لإعادة التركيب العام:

قدم Holliday (1974) نموذجًا لإظهار إعادة التركيب العام (الشكل 8.25). وفقًا لهذا النموذج ، يحدث إعادة التركيب في خمس خطوات مثل كسر الخصلة ، وتزاوج الخصلة ، وغزو / استيعاب الخيوط ، وتشكيل chiasma (العبور) ، والكسر وإعادة التوحيد وإصلاح عدم التطابق.

الشكل 8.25: نموذج هوليداي لإعادة التركيب العام المتبادل.

يحدث إعادة التركيب العام من خلال العبور عن طريق الاقتران بين الخيوط الفردية التكميلية من الحمض النووي المزدوج (أ). تخضع منطقتان متماثلتان من الحلزون المزدوج للحمض النووي لتفاعل متبادل.

تحتوي المنطقة المتجانسة على تسلسل طويل من الاقتران الأساسي التكميلي بين خيط من واحدة أو اثنتين من الحلزون المزدوج الأصلي وحبل مكمل من الآخر. ومع ذلك ، فمن غير المعروف كيف تتعرف المنطقة المتجانسة من الحمض النووي على بعضها البعض.

تم إعطاء قائمة بجينات إعادة التركيب ووظائفها في الجدول 8.2. بروتينات RecBCD لجينات recBCD أو recJ مطلوبة لإعادة التركيب في E. coli. يدخل هذا البروتين الحمض النووي من أحد طرفي اللولب المزدوج ، ويسافر على طول الحمض النووي في الحلزون المزدوج ، بمعدل حوالي 300 نيوكليوتيد في الثانية.

يخلق حلقة من ssDNA على طول الحمض النووي المتنقل (ب). يستخدم الطاقة المشتقة من التحلل المائي لجزيئات ATP. موقع التعرف الخاص (أ) تسلسل من ثمانية نيوكليوتيدات منتشرة في جميع أنحاء كروموسوم الإشريكية القولونية (ب) يتم تقطيعه في الحلقة المتنقلة للحمض النووي المكون من بروتين RecBCD.

الجدول 8.2: جينات إعادة التركيب (rec) ووظائفها.

(ب) اقتران حبلا:

تعمل بروتينات RecBCD بمثابة هليكاز الحمض النووي لأن هذه البروتينات تتحلل بالماء وتتحرك على طول حلزون الحمض النووي. وبالتالي ، ينتج عن بروتينات RecBCD تكوين شعيرات مفردة مجدولة في موقع التعرف الذي ينزاح من اللولب (ج). يؤدي هذا إلى بدء تفاعل الاقتران الأساسي بين التسلسلين التكميليين للحلزون المزدوج للحمض النووي.

(ج) غزو ​​الحبال / الاستيعاب:

خيط واحد (طولي) متولد من حلزون مزدوج للحمض النووي يغزو اللولب المزدوج الآخر (د). في الجين E. coli recA ينتج بروتين RecA وهو مهم لإعادة التركيب بين الكروموسومات مثل بروتينات ربط الخيط المفرد (SSB) ، يرتبط بروتين RecA بقوة بالحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل لتشكيل خيوط بروتين نووي.

قام Roca and Cox (1990) بمراجعة بنية ووظيفة بروتين RecA. يعزز بروتين RecA إعادة التشبع السريع لتحليل ssDNA المائي التكميلي ATP في هذه العملية. يحتوي بروتين RecA على العديد من مواقع الارتباط ، لذلك يمكنه ربط ssDNA وبالتالي dsDNA. يرتبط بروتين RecA أولاً بـ ssDNA ، ثم ابحث عن التماثل بين الخيط المانح والجزيء المتلقي.

نظرًا لوجود هذه المواقع ، يحفز بروتين RecA تفاعلًا متعدد الخطوات (يسمى المشبك) بين المنطقة المتجانسة من ssDNA والحلزون المزدوج للحمض النووي. يساعد بروتين E. coli SSB بروتين Rec على تنفيذ هذه التفاعلات. عندما يتم تحديد منطقة التماثل من خلال الاقتران الأساسي الأولي بين التسلسلات التكميلية ، تحدث الخطوة الحاسمة في المشابك.

أظهرت التجارب في الجسم الحي أن عدة أنواع من المجمعات تتشكل بين ssDNA مغطى ببروتين RecA و dsDNA helix. أولاً ، يتم تكوين معقد مزدوج غير أساسي يتم تحويله إلى بنية ثلاثية تقطعت بهم السبل (بروتين ssDNA و dsDNA و RecA) عند العثور على منطقة متجانسة.

هذا المركب غير مستقر ويخرج DNA heteroduplex بالإضافة إلى ssDNA النازح من الحلزون الأصلي. بمجرد مواجهة المناطق المتجانسة وتعقيد ssDNA و dsDNA ، يتم تشكيل حلقة D مستقرة (د).

الخطوة التالية هي استيعاب حبلا وربط النك (هـ). يزيح الشريط المتبرع تدريجياً حبلا المتلقي وهو ما يسمى هجرة الفرع. بعد تكوين التشابك العصبي ، يتم توسيع منطقة مضاعفة متغايرة من خلال هجرة الفرع الموجه بالبروتين المحفز بواسطة بروتين RecA.

تستمر هجرة الفروع الموجهة لبروتين RecA بمعدل موحد في اتجاه واحد بسبب إضافة المزيد من بروتين RecA إلى أحد طرفي خيوط بروتين RecA على ssDNA. يمكن أن يحدث ترحيل الفروع في أي نقطة حيث يحاول خيطان مفردان مع التسلسل الاقتران بنفس الخيط التكميلي.

منطقة غير متزاوجة من الخيط الفردي الآخر تؤدي إلى حركة نقطة التفرع دون تغيير العدد الإجمالي لأزواج قواعد الحمض النووي. تشارك هليكازات الحمض النووي الخاصة التي تحفز هجرة الفروع الموجهة للبروتين في إعادة التركيب. في المقابل ، تستمر الهجرة التلقائية للفرع في كلا الاتجاهين بنفس المعدل تقريبًا. لذلك ، فإنه يحرز تقدمًا بسيطًا على مسافة طويلة.

(هـ) Chiasma أو عبور التكوين:

يعد تبادل خيط واحد بين حلزمتين مزدوجتين خطوة مختلفة في حدث إعادة التركيب العام. بعد التبادل الأولي للخيوط المتقاطعة ، يُعتقد أن المزيد من التبادلات الخيطية بين الحلزونات المتعارضة بشدة تتقدم بسرعة. يشق نوكلياز ويحلل جزئيًا الحلقة D في بعض النقاط.

في هذه المرحلة ، ربما تتبع كائنات مختلفة مسارات مختلفة. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، يتم تشكيل بنية مهمة تسمى التبادل المتقاطع (وتسمى أيضًا Holliday Juncture أو شكل chi أو chiasmas ، من خلال حلزوني الحمض النووي المشاركين (g). وقد لوحظ أيضًا تحت المجهر الإلكتروني بواسطة دريسير وبوتر (1982).

شكل تشي من حلزونين متماثلين تم إقرانهما في البداية وتماسكهما معًا عن طريق التبادل المتبادل لاثنين من الخيوط الأربعة حيث تنشأ خصلة واحدة من كل من الحلزونات (g).

يحتوي نموذج chi على خاصيتين مهمتين ، (1) يمكن لنقطة التبادل أن تهاجر بسرعة ذهابًا وإيابًا على طول الحلزونات عن طريق ترحيل فرع مزدوج ، و (2) تحتوي على زوجين من الخيوط ، زوج واحد من الخيوط المتقاطعة والزوج الآخر من الخيوط غير المتقاطعة.

(و) الكسر ولم الشمل:

يمكن أن يتشابه هيكل تشي في عدة دورات (ح). ينتج عن هذا تغيير خيوط أصلية غير متقاطعة في السلاسل المتقاطعة ، والخيوط المتقاطعة في الخيوط غير المتقاطعة. من أجل تجديد حلزوني DNA منفصلين ، يلزم الكسر ولم الشمل في خيطين متقاطعين.

إذا حدث الكسر ولم الشمل قبل الأزمرة ، فلن يحدث الخيطان المتقاطعان. لذلك ، فإن الأزمرة مطلوبة لكسر وإعادة توحيد حلزوني مزدوج متماثل للحمض النووي الناتج عن إعادة التركيب الجيني العام.

يحدث الكسر ولم الشمل إما في المستوى الرأسي أو الأفقي. إذا حدث الكسر أفقيًا ، فستحتوي المؤتلفات على النمط الجيني ABlab مع تغيير طفيف في التسلسلات الأساسية في المنطقة الداخلية (i).

ومع ذلك ، إذا حدث الكسر عموديًا ، فإن المواد المؤتلفة ستحتوي على Ab / aB (J). يُعتقد أن بروتين RurC وبروتين RecG المعبر عنه من جينات ruvC و recG على التوالي هما نوكلياز داخلي بديل خاص بهيكل هوليداي.

(ز) إصلاح عدم التطابق (عدم تطابق نظام القراءة والخداع):

إنه نظام إصلاح يصحح أزواج القواعد غير المتطابقة للمناطق غير المزاوجة بعد إعادة التركيب. يتعرف هذا النظام على الوظيفة الخاطئة والمتطابقة لبوليميراز الحمض النووي. يتضمن أسلوب الميكا واللمعان استئصال إحدى القواعد الأخرى غير المتطابقة جنبًا إلى جنب مع حوالي 3000 نيوكليوتيد. يشارك RecFJO هذا في إصلاح عدم التطابق القصير إما في المرحلة الأولية أو في نهاية إعادة التركيب.

يوجد البروتينان MutS و MutL في البكتيريا وحقيقيات النوى. يرتبط بروتين MutS بزوج قاعدة غير متطابق ، بينما يقوم MutL بفحص الحمض النووي بحثًا عن شق (الشكل 8.26).

عندما يتم تشكيل النك ، يؤدي MutL إلى تدهور الشريط المكسور طوال الطريق من خلال عدم التطابق ، نظرًا لأن النكات محصورة إلى حد كبير في السلاسل المكررة حديثًا في حقيقيات النوى ، تتم إزالة أخطاء النسخ بشكل انتقائي. في البكتيريا ، تكون الآلية هي نفسها فيما عدا أن بروتينًا إضافيًا يقوم MH بقطع تسلسل GATC غير الميثلي ويبدأ العملية.

لقد ثبت في الخميرة والبكتيريا أن نفس نظام إصلاح عدم التطابق الذي يزيل أخطاء النسخ كما في الشكل 8.26 يقاطع أيضًا أحداث إعادة التركيب الجيني بين تسلسل الحمض النووي غير المطابق تمامًا. من المعروف أن الجينات المتماثلة في نوعين من البكتيريا ذات الصلة الوثيقة (E. coli و S.typhimurium) لن تتحد بشكل عام ، حتى بعد وجود 80٪ من متواليات النوكليوتيدات المتطابقة.

ومع ذلك ، عندما يتم تعطيل نظام إصلاح عدم التطابق عن طريق الطفرة ، فإن تكرار إعادة التركيب بين الأنواع يزيد بمقدار 100 ضعف. تحمي هذه الآلية الجينوم البكتيري من تغييرات التسلسل التي قد تنتج عن إعادة التركيب مع دخول جزيئات دنا غريبة في الخلية.

(2) إعادة التركيب غير المتبادل (تحويل الجينات):

القانون الأساسي لعلم الوراثة هو أن الشريكين يساهمان بكمية متساوية من الجينات في النسل. وهذا يعني أن النسل يرثون نصف مجموعة الجينات الكاملة من الذكر والنصف الآخر من الأنثى. تخضع إحدى الخلايا ثنائية الصبغيات للانقسام الاختزالي وتنتج أربع خلايا أحادية الصيغة الصبغية ، وبالتالي فإن عدد الجينات التي يساهم بها الذكر ينخفض ​​إلى النصف ، وبالتالي فإن جينات الأنثى.

في الحيوانات الأعلى مثل الإنسان ، لا يمكن تحليل هذه الجينات التي تأخذ خلية واحدة. ومع ذلك ، في بعض الكائنات الحية مثل الفطريات ، من الممكن استعادة وتحليل جميع الخلايا الوليدة الأربعة المنتجة من خلية واحدة من خلال الانقسام الاختزالي.

من حين لآخر ، يتم تكوين ثلاث نسخ من الأليل الأمومي ونسخة واحدة فقط من الأليل الأبوي عن طريق الانقسام الاختزالي. يشير هذا إلى أن واحدة من نسختين من الأليلات الأبوية قد تغيرت إلى أليل الأم. هذا التغيير الجيني من النوع غير المتبادل ويسمى تحويل الجينات. يُعتقد أن التحويل الجيني حدث مهم في تطور جينات معينة ويحدث نتيجة لآلية إعادة التركيب العام وإصلاح الحمض النووي.

ويرد في الشكل 8.27 إعادة التركيب العام غير المتبادل. ناقش كوباياشي (1992) آلية تحويل الجينات وإعادة التركيب المتماثل.

تبدأ هذه العملية عندما يتم عمل شق في أحد الخيوط (أ). من هذه النقطة ، يصنع بوليميراز الدنا نسخة إضافية من حبلا ويزيل النسخة الأصلية كخيط واحد (ب). يبدأ هذا الخيط الفردي في الاقتران بالمنطقة المتجانسة كما هو الحال في الازدواج السفلي لجزيء الحمض النووي (ب). يتدهور الخيط القصير غير المقترن الناتج في الخطوة (ب) عند اكتمال نقل تسلسل النوكليوتيدات. يتم ملاحظة النتائج (في الدورة التالية) عندما يقوم تكرار الحمض النووي بفصل السلاسل غير المتطابقة (ج).

(3) إعادة التركيب الخاصة بالموقع:

إعادة التركيب الخاص بالموقع يغير الموضع النسبي لتسلسلات النيوكليوتيدات في الكروموسوم. يعتمد تفاعل الاقتران الأساسي على التعرف بوساطة البروتين لتسلسل الحمض النووي اللذين سيتم دمجهما. تسلسل متماثل طويل جدا غير مطلوب.

على عكس إعادة التركيب العام ، يتم توجيه عملية إعادة التركيب الخاصة بالموقع بواسطة إنزيم إعادة التركيب الذي يتعرف على تسلسلات نوكليوتيد معينة موجودة في أحد جزيئات الحمض النووي المعاد تركيبها. لا يتم تضمين الاقتران الأساسي ، ومع ذلك ، في حالة حدوثه ، يكون المفصل متغاير التضاعف بطول بضعة أزواج أساسية فقط.

تم اكتشافه لأول مرة في Phage حيث ينتقل جينومها داخل وخارج كروموسوم الإشريكية القولونية. بعد الاختراق ، قامت فجوة بتشفير إنزيم ، وهو lambda Integrase الذي يحفز عملية إعادة التركيب (الشكل 8.28). يرتبط Lambda Integrase بموقع ارتباط محدد لتسلسل الحمض النووي على كل كروموسوم.

يقوم بعمل جروح وكسر تسلسل DNA متماثل قصير. تقوم أداة التكامل بتبديل خيوط الشريك وإعادة ضمها لتشكيل مفصل مضاعف متغاير بطول 7 نقاط أساس. يُشبه الإكْتِرْزَةُ DNA topoisomerase DNA في إعادة ضم الخيوط التي تم كسرها سابقًا.

إعادة التركيب الخاصة بالموقع هي من النوعين التاليين:

(أ) إعادة التركيب والتركيب الخاص بالموقع المحافظ:

يُعرف إنتاج مضاعف متغاير قصير جدًا عن طريق طلب بعض تسلسل الحمض النووي المتماثل في جزيئي الحمض النووي بإعادة التركيب المحافظ الخاص بالموقع. يتم وصف الإجراء التفصيلي في الشكل 8.28.

(ب) إعادة التركيب والتألق الخاصة بالموقع الانتقالي:

هناك نوع آخر من نظام إعادة التركيب يُعرف باسم إعادة التركيب عبر موقع محدد (TSS). لا ينتج عن إعادة تركيب TSS مضاعف مضاعف متغاير ولا يتطلب تسلسلات محددة على أكبر DNA.

هناك العديد من تسلسلات الحمض النووي المحمولة بما في ذلك العديد من الفيروسات والعناصر القابلة للنقل التي تتكامل. يتكامل الإنزيم عن طريق إشراك آلية مختلفة عن الملتهمة - إدخال الحمض النووي الخاص به في الكروموسوم. كل إنزيم يدمج recog ويضيء تسلسل DNA معين مثل phage λ.

قام K. Mizuuchi (1992a) بمراجعة آلية التأشيب عبر الموضع بناءً على دراسات العاثية Mu والعناصر الأخرى. تمت تنقية الإنزيم المتكامل لأول مرة من Mu. على غرار تكامل phage λ ، ينفذ Mu Integrase أيضًا من تفاعلاته المقطوعة وإعادة الانضمام دون الحاجة إلى ATP. كما أنها لا تتطلب تسلسل DNA محددًا في الكروموسوم المستهدف ولا تشكل مفصلًا مضاعفًا متغايرًا.

تظهر الخطوات المختلفة للأحداث المؤلفة من TSS في الشكل 8.29. تقوم التركيبة بعمل قطع في خيط واحد عند كل نهاية من متواليات الحمض النووي الفيروسي ، وتكشف عن المجموعة 3 & # 8242-OH التي تبرز. لذلك ، تغزو كل من هذه النهايات 3 & # 8242-OH مباشرة رابطة فوسفوديستر على خيوط متقابلة من موقع تم اختياره عشوائيًا على كروموسوم مستهدف.

هذا يسهل إدخال تسلسل الحمض النووي الفيروسي في الكروموسوم المستهدف ، تاركًا فجوتين قصيرين مفردين تقطعت بهما السبل على كل جانب من جزيء الحمض النووي المترابط.

يتم سد هذه الفجوات لاحقًا عن طريق عملية إصلاح الحمض النووي (أي بوليميريز الحمض النووي) لإكمال عملية إعادة التركيب. تؤدي هذه الآلية إلى تكوين ازدواجية قصيرة (تكرارات قصيرة من حوالي 3 إلى 12 نيوكليوتيد طويلة) لتسلسل الحمض النووي الهدف المجاور. تشكيل التكرارات القصيرة هو علامات القاعة لإعادة تركيب TSS.

التين. 8.29: آلية إعادة التركيب SDR الخاصة بالموقع العابر للموضع ، التكرارات القصيرة المباشرة لتسلسل DNA الهدف.


محتويات

هناك نوعان من النظريات الشائعة والمتداخلة التي تشرح أصول العبور ، قادمة من النظريات المختلفة حول أصل الانقسام الاختزالي. تستند النظرية الأولى إلى فكرة أن الانقسام الاختزالي قد تطور كطريقة أخرى لإصلاح الحمض النووي ، وبالتالي فإن العبور هو طريقة جديدة لاستبدال الأجزاء التالفة المحتملة من الحمض النووي. [ بحاجة لمصدر ] تأتي النظرية الثانية من فكرة أن الانقسام الاختزالي تطور من التحول البكتيري ، مع وظيفة نشر التنوع. [6] في عام 1931 ، اكتشفت باربرا مكلينتوك نبات ذرة ثلاثي الصبغيات. توصلت إلى نتائج رئيسية تتعلق بالنمط النووي للذرة ، بما في ذلك حجم وشكل الكروموسومات. استخدمت مكلينتوك مرحلتي الطور الأولي والطور الطوري للانقسام الفتيلي لوصف مورفولوجيا كروموسومات الذرة ، وأظهرت لاحقًا أول عرض خلوي على الإطلاق للعبور في الانقسام الاختزالي. Working with student Harriet Creighton, McClintock also made significant contributions to the early understanding of codependency of linked genes.

DNA repair theory Edit

Crossing over and DNA repair are very similar processes, which utilize many of the same protein complexes. [7] [8] In her report, “The Significance of Responses of the Genome to Challenge”, McClintock studied corn to show how corn's genome would change itself to overcome threats to its survival. She used 450 self-pollinated plants that received from each parent a chromosome with a ruptured end. She used modified patterns of gene expression on different sectors of leaves of her corn plants to show that transposable elements (“controlling elements”) hide in the genome, and their mobility allows them to alter the action of genes at different loci. These elements can also restructure the genome, anywhere from a few nucleotides to whole segments of chromosome. Recombinases and primases lay a foundation of nucleotides along the DNA sequence. One such particular protein complex that is conserved between processes is RAD51, a well conserved recombinase protein that has been shown to be crucial in DNA repair as well as cross over. [9] Several other genes in D. melanogaster have been linked as well to both processes, by showing that mutants at these specific loci cannot undergo DNA repair or crossing over. Such genes include mei-41, mei-9, hdm, spnA, and brca2. [ بحاجة لمصدر ] This large group of conserved genes between processes supports the theory of a close evolutionary relationship. Furthermore, DNA repair and crossover have been found to favor similar regions on chromosomes. In an experiment using radiation hybrid mapping on wheat's (Triticum aestivum L.) 3B chromosome, crossing over and DNA repair were found to occur predominantly in the same regions. [10] Furthermore, crossing over has been correlated to occur in response to stressful, and likely DNA damaging, conditions [11] [12]

Links to bacterial transformation Edit

The process of bacterial transformation also shares many similarities with chromosomal cross over, particularly in the formation of overhangs on the sides of the broken DNA strand, allowing for the annealing of a new strand. Bacterial transformation itself has been linked to DNA repair many times. [ بحاجة لمصدر ] The second theory comes from the idea that meiosis evolved from bacterial transformation, with the function of propagating genetic diversity. [6] . [13] Thus, this evidence suggests that it is a question of whether cross over is linked to DNA repair or bacterial transformation, as the two do not appear to be mutually exclusive. It is likely that crossing over may have evolved from bacterial transformation, which in turn developed from DNA repair, thus explaining the links between all three processes.

Meiotic recombination may be initiated by double-stranded breaks that are introduced into the DNA by exposure to DNA damaging agents, [ بحاجة لمصدر ] or the Spo11 protein. [14] One or more exonucleases then digest the 5’ ends generated by the double-stranded breaks to produce 3’ single-stranded DNA tails (see diagram). The meiosis-specific recombinase Dmc1 and the general recombinase Rad51 coat the single-stranded DNA to form nucleoprotein filaments. [15] The recombinases catalyze invasion of the opposite chromatid by the single-stranded DNA from one end of the break. Next, the 3’ end of the invading DNA primes DNA synthesis, causing displacement of the complementary strand, which subsequently anneals to the single-stranded DNA generated from the other end of the initial double-stranded break. The structure that results is a cross-strand exchange, also known as a Holliday junction. The contact between two chromatids that will soon undergo crossing-over is known as a chiasma. The Holliday junction is a tetrahedral structure which can be 'pulled' by other recombinases, moving it along the four-stranded structure.

Molecular structure of a Holliday junction.

Molecular structure of a Holliday junction. From PDB: 3CRX ​.

MSH4 and MSH5 Edit

The MSH4 and MSH5 proteins form a hetero-oligomeric structure (heterodimer) in yeast and humans. [16] [17] [18] In the yeast خميرة الخميرة MSH4 and MSH5 act specifically to facilitate crossovers between homologous chromosomes during meiosis. [16] The MSH4/MSH5 complex binds and stabilizes double Holliday junctions and promotes their resolution into crossover products. An MSH4 hypomorphic (partially functional) mutant of S. cerevisiae showed a 30% genome wide reduction in crossover numbers, and a large number of meioses with non exchange chromosomes. [19] Nevertheless, this mutant gave rise to spore viability patterns suggesting that segregation of non-exchange chromosomes occurred efficiently. Thus in S. cerevisiae proper segregation apparently does not entirely depend on crossovers between homologous pairs.

Chiasma Edit

The grasshopper Melanoplus femur-rubrum was exposed to an acute dose of X-rays during each individual stage of meiosis, and chiasma frequency was measured. [20] Irradiation during the leptotene-zygotene stages of meiosis (that is, prior to the pachytene period in which crossover recombination occurs) was found to increase subsequent chiasma frequency. Similarly, in the grasshopper تشورثيبوس برونوس, exposure to X-irradiation during the zygotene-early pachytene stages caused a significant increase in mean cell chiasma frequency. [21] Chiasma frequency was scored at the later diplotene-diakinesis stages of meiosis. These results suggest that X-rays induce DNA damages that are repaired by a crossover pathway leading to chiasma formation.

In most eukaryotes, a cell carries two versions of each gene, each referred to as an allele. Each parent passes on one allele to each offspring. An individual gamete inherits a complete haploid complement of alleles on chromosomes that are independently selected from each pair of chromatids lined up on the metaphase plate. Without recombination, all alleles for those genes linked together on the same chromosome would be inherited together. Meiotic recombination allows a more independent segregation between the two alleles that occupy the positions of single genes, as recombination shuffles the allele content between homologous chromosomes.

Recombination results in a new arrangement of maternal and paternal alleles on the same chromosome. Although the same genes appear in the same order, some alleles are different. In this way, it is theoretically possible to have any combination of parental alleles in an offspring, and the fact that two alleles appear together in one offspring does not have any influence on the statistical probability that another offspring will have the same combination. This principle of "independent assortment" of genes is fundamental to genetic inheritance. [22] However, the frequency of recombination is actually not the same for all gene combinations. This leads to the notion of "genetic distance", which is a measure of recombination frequency averaged over a (suitably large) sample of pedigrees. Loosely speaking, one may say that this is because recombination is greatly influenced by the proximity of one gene to another. If two genes are located close together on a chromosome, the likelihood that a recombination event will separate these two genes is less than if they were farther apart. Genetic linkage describes the tendency of genes to be inherited together as a result of their location on the same chromosome. Linkage disequilibrium describes a situation in which some combinations of genes or genetic markers occur more or less frequently in a population than would be expected from their distances apart. This concept is applied when searching for a gene that may cause a particular disease. This is done by comparing the occurrence of a specific DNA sequence with the appearance of a disease. When a high correlation between the two is found, it is likely that the appropriate gene sequence is really closer. [23]

Crossovers typically occur between homologous regions of matching chromosomes, but similarities in sequence and other factors can result in mismatched alignments. Most DNA is composed of base pair sequences repeated very large numbers of times. [24] These repetitious segments, often referred to as satellites, are fairly homogenous among a species. [24] During DNA replication, each strand of DNA is used as a template for the creation of new strands using a partially-conserved mechanism proper functioning of this process results in two identical, paired chromosomes, often called sisters. Sister chromatid crossover events are known to occur at a rate of several crossover events per cell per division in eukaryotes. [24] Most of these events involve an exchange of equal amounts of genetic information, but unequal exchanges may occur due to sequence mismatch. These are referred to by a variety of names, including non-homologous crossover, unequal crossover, and unbalanced recombination, and result in an insertion or deletion of genetic information into the chromosome. While rare compared to homologous crossover events, these mutations are drastic, affecting many loci at the same time. They are considered the main driver behind the generation of gene duplications and are a general source of mutation within the genome. [25]

The specific causes of non-homologous crossover events are unknown, but several influential factors are known to increase the likelihood of an unequal crossover. One common vector leading to unbalanced recombination is the repair of double-strand breaks (DSBs). [26] DSBs are often repaired using homology directed repair, a process which involves invasion of a template strand by the DSB strand (see figure below). Nearby homologous regions of the template strand are often used for repair, which can give rise to either insertions or deletions in the genome if a non-homologous but complementary part of the template strand is used. [26] Sequence similarity is a major player in crossover – crossover events are more likely to occur in long regions of close identity on a gene. [27] This means that any section of the genome with long sections of repetitive DNA is prone to crossover events.

The presence of transposable elements is another influential element of non-homologous crossover. Repetitive regions of code characterize transposable elements complementary but non-homologous regions are ubiquitous within transposons. Because chromosomal regions composed of transposons have large quantities of identical, repetitious code in a condensed space, it is thought that transposon regions undergoing a crossover event are more prone to erroneous complementary match-up [28] that is to say, a section of a chromosome containing a lot of identical sequences, should it undergo a crossover event, is less certain to match up with a perfectly homologous section of complementary code and more prone to binding with a section of code on a slightly different part of the chromosome. This results in unbalanced recombination, as genetic information may be either inserted or deleted into the new chromosome, depending on where the recombination occurred.

While the motivating factors behind unequal recombination remain obscure, elements of the physical mechanism have been elucidated. Mismatch repair (MMR) proteins, for instance, are a well-known regulatory family of proteins, responsible for regulating mismatched sequences of DNA during replication and escape regulation. [29] The operative goal of MMRs is the restoration of the parental genotype. One class of MMR in particular, MutSβ, is known to initiate the correction of insertion-deletion mismatches of up to 16 nucleotides. [29] Little is known about the excision process in eukaryotes, but E. coli excisions involve the cleaving of a nick on either the 5’ or 3’ strand, after which DNA helicase and DNA polymerase III bind and generate single-stranded proteins, which are digested by exonucleases and attached to the strand by ligase. [29] Multiple MMR pathways have been implicated in the maintenance of complex organism genome stability, and any of many possible malfunctions in the MMR pathway result in DNA editing and correction errors. [30] Therefore, while it is not certain precisely what mechanisms lead to errors of non-homologous crossover, it is extremely likely that the MMR pathway is involved.


Chapter 15 - Mechanisms of Horizontal Gene Transfer and DNA Recombination

Comparative genomics is revealing extensive diversity within many bacterial species. The pan-genome of a species is composed of core genes present in all strains and dispensable genes that provide a selective advantage under specific conditions. Movement of these dispensable genes between species, genera and kingdoms is known as horizontal gene transfer (HGT). There are three primary mechanisms of HGT in bacteria. Transformation: uptake of naked DNA from the environment by naturally competent cells. Transduction: transfer of bacterial DNA between cells using bacteriophages as vectors. Conjugation: intimate cell-to-cell contact with transfer of single-stranded DNA by a type-IV-like secretion system.

Horizontally acquired DNA that cannot replicate autonomously must be integrated into the genome of the recipient if it is to be maintained. Incoming DNA with significant similarity to the recipient genome can integrate by homologous recombination. Mobile genetic elements, such as integrative and conjugative elements, that have limited homology to the host genome use site-specific recombination to integrate at target sequences. Understanding these processes provides insight into the evolution of bacteria and emerging pathogens.


Crossing Over of Genes | Gene Mapping

في هذه المقالة سوف نناقش حول: - 1. Introduction to Crossing Over of Genes 2. Factors Affecting Crossing Over of Genes 3. Cytological Basis of Crossing Over 4. Molecular Mechanism Crossing Over 5. Hybrid DNA Models of Crossing Over.

  1. Introduction to Crossing Over of Genes
  2. Factors Affecting Crossing Over of Genes
  3. Cytological Basis of Crossing Over of Genes
  4. Molecular Mechanism Crossing Over of Genes
  5. Hybrid DNA Models of Crossing Over of Genes

1. Introduction to Crossing Over of Genes:

Recombination of genes on the same chro­mosome is accomplished by crossing over, a process by which parts of homologous chromo­somes are interchanged. Crossing over is impor­tant in evolution because it generates variation in a species. Crossing over and independent assort­ment are mechanisms that produce new combi­nation of genes.

The important features of the concept of crossing over are:

أنا. The loci of the genes on a chromosome are arranged in a linear sequence.

ثانيا. The two alleles of a gene in a hetero- zygote occupy corresponding positions in the homologous chromosomes, that is, allele A occupies the same position in homologue 1 that allele a occupies in homologue 2. iii. Crossing over involves the breakage of each of two homologous chromosomes (actually chromatids) and the exchange of parts.

رابعا. Crossing over occurs at pachytene after the synapsis of the homologous chromo­somes in prophase I of meiosis. Since chromosome replication occurs during interphase, meiotic crossing over occurs in the post replication tetrad stage with four chromatids for each pair of homo­logous chromosomes (Fig. 8.6).

v. Chromosomes with recombinant combi­nations of linked genes are formed by occurrence of crossing over in the region between the two loci.

السادس. The probability of crossing over occur­ring between two loci increases with increasing distance between the two loci on the chromosome.

2. Factors Affecting Crossing Over of Genes:

The fre­quency of crossing over between linked genes is affected by several factors:

1. Distance between genes:

ihe frequency of crossing over between two genes is positive­ly associated with the distance between their locations in the chromosome.

ثانيا. Distance from centromere:

Genes located in the vicinity of centromeres show a rela­tively lower recombination rate than those located away from them.

ثالثا. Chromosomal aberrations:

Translocations, inversions (crossover suppressor) reduce recombination between the genes located within the altered segment.

The frequency of recombination is influenced by the sex, e.g., male Drosophila does not show recombination.

Some genes affect occurrence of crossing over, e.g., c3G gene of Drosophila prevents recombination.

السادس. Age of female:

A progressive decline of recombination frequency with the advan­cing age of female Drosophila is noticed.

السابع. Association with heterochromatin:

Hetero- chromatic segments influence crossing over.

ثامنا. Environmental factors:

Temperature, radia­tion (X-ray, γ-ray), chemicals (antibiotics EMS) also affect the frequency of crossing over.

3. Cytological Basis of Crossing Over of Genes:

Morgan first proposed crossing over to explain the formation of recombinant combina­tions of genes that were shown to be linked by genetic data. He hypothesized that the linkage was the result of the location of these genes on the same chromosome. If crossing over occurs, one might expect to be able to observe it (or its consequences) cytologically.

The cross shaped structures, in which two of the four chromatids of homologous chromosome pairs appear to exchange pairing partners, are readily detected in cytological studies of meiosis in many orga­nisms. These cross shaped structures were first detected in amphibians and called chiasmata by F. Janssens.

Studies in which chiasma frequency was correlated with recombination frequency have shown a direct relationship between cross­ing over and chiasmata.

The cytological evidence that homologous chromosomes exchange parts during crossing over was first noted in 1931 by Stern in Drosophila and Creighton and McClintock in maize. Normally the two chromosomes of any homologous pair are morphologically indistin­guishable.

Stern, Creighton and McClintock identified homologues that were morphologi­cally distinguishable, that is, they were not entirely homologous. The chromosome pairs were homologous along most of their length. They paired arid segregated normally during meiosis. The ends of the homologues were dif­ferent and could be recognized by microscopy (heteromorphic pair).

Stern’s Experiment in Drosophila:

In Stern’s experiment, stocks carrying structural chromoso­mal changes were crossed to produce a female which had section of Y chromosome attached to one of its X chromosomes. The other X chromo­some was composed of two approximately equal fragments, each with its own centromere. Each of the two X chromosomes was, therefore, uniquely recognizable under the microscope.

In addition, one of the X chromosome fragments carried the mutant alleles for carnation (car, recessive light eye colour) and Bar (B, semi-dominant narrow eye shape), while the long X – Y chromosome carried the normal alleles for these genes. In the absence of crossing over, such females would be expected to produce only car B or ++ gametes.

When fertilized by, a carnation-eyed male (car +), the female non-crossover offspring of the mating should therefore appear as carnation, bar-eyed (car +/car +) and wild type (++/ car+).

Genetic crossing over, however, will produce more diffe­rent female phenotypes – carnation (car + / car +) and bar (+B / car +), and more interestingly, will also produce uniquely recognizable chromo­somes if chromosomal exchange accompanies genetic crossing over.

The two crossover pro­ducts produced by the female are one long X chromosome and a short X fragment with attached Y section. When combined with the nor­mal long X chromosome of the male, the crossover female offspring’s are thus cytologically distinct from the non-crossovers.

Stern found the predicted genotype – X chromosome correlation in almost every crossover female examined. Such cytological observations suggested that genetic crossing over was accompanied by an actual exchange of chromosome segments (Fig. 8.9).

Creighton and McClintock’s Experiment in Corn:

Creighton and McClintock also demon­strated the correlation between genetic crossing over and the exchange of parts of homologous chromosomes. They analysed crosses involving two loci on chromosome 9 of maize.

One gene controlling the kernel colour (C – coloured c – colourless) and the other controlling the type of carbohydrates in the kernel (Wx – starchy wx – waxy). They made use of a chromosome with a densely stained “knob” at one end and an extra (trans-located) piece of chromosome at the other end (Fig. 8.10).

The plant was heterozygous for coloured aleurone and starchy (non-waxy) endosperm characters and carried these genes in repulsion phase, i.e., Cwx / cWx. Cwx was carried on the knobbed chromosome and cWx on the knobless chromosome. Such a plant was test crossed with plant homozygous recessive for both characters, i.e., colourless and waxy (cwx / cwx).

If the chromosome region between the knob and the c gene is represented as I region and that between c and Wx as II region, then one would expect two types of non-crossover gametes (Cwx and cWx) and six types of crossover gametes including single and double crossovers. The progeny can be classified into eight types based on phenotypes and cytological observations.

The following observations in phenotype and cytology of progeny (Fig. 8.11) suggested that actual exchange of chromosome segments was involved in genetic crossing over:

أنا. Association of knob in chromosome with the phenotype, colourless seed (c), and non-waxy endosperm (Wx), showed crossing over in region I, as the phenotypes are associated with knobless chro­mosome in the parents.

ثانيا. A ring of four chromosomes is formed in meiosis due to presence of translocation in heterozygote condition. In this case, in meiotic metaphase I, the presence of a ring of four chromosomes without a knob suggested cytological exchange of chromosome segments, because the knob was associated with the 9th chro­mosome carrying translocation in the parent.

ثالثا. Presence of knob in the bivalents instead of being with the quadrivalents, can be treated as an evidence for cytological crossing over, since the knob was origi­nally associated with the translocation and the translocation usually results in the formation of quadrivalents.

4. Molecular Mechanism Crossing Over of Genes:

The models that have been proposed to account for crossing over are of two general types:

(ii) Breakage – reunion (Fig. 8.12).

These are based on the assumption that molecules of DNA in the process of being synthesized could switch over from using DNA of one homologue as template in one region to using the DNA of the other homologue as template in another region. Most such copy choice models of crossing over were based on the assumption of conservative DNA synthesis.

Copy choice models rapidly lost sup­port once DNA replication was proven to be semi-conservative. Pure copy choice (with no breakage and reunion) is not mechanistically compatible with semi-conservative DNA replica­tion. But a small amount of copy choice DNA repair synthesis is associated with crossing over by breakage and reunion.

This copy choice repair synthesis may be responsible for gene conver­sion or non-reciprocal recombination. Crossing over, therefore, occurs by a complex mechanism that includes some aspects of both breakage and reunion and copy choice models.

Breakage and Reunion Hypothesis:

It involves the breakage of two homologous chro­matids and the reunion of the parts in recombi­nant arrangements. Extensive data now docu­ment the occurrence of breakage and reunion during crossing over process.

Direct evidence for breakage and reunion has been obtained from Taylor’s experiments in eukaryotes by labelling chromosomes with radioactive thymidine [ 3 H] and following the distribution of radioactive chromatids by autoradiography. Labelled and unlabeled segments of chromatids were often observed to be interchanged.

They did not exclude, however, the possibility that the unlabeled segment is the result of new synthesis rather than the reunion of an unlabeled segment of a parental chromosome.

5. Hybrid DNA Models of Crossing Over of Genes:

The currently popular models to explain the molecular mechanism of crossing over, are based on hybrid DNA (heteroduplex DNA) for­mation. In these models, released broken strands of the DNA duplex pair crosswise with unbroken strand of non-sister chromatid resulting in the formation of hybrid DNA segments.

These models took into account all the various types of genetic data that must be consistent with the mechanisms of crossing over in terms of break­age and reunion with associated repair synthesis.

Holliday model and Whitehouse model, named after the scientists who proposed them in 1964, involve single strand break of two DNA duplexes belonging to non-sister chromatids. In the model (Fig. 8.13) proposed by H.L.K. Whitehouse, the two strands participating will have opposite polarity (5’→ 3′) and (3′ → 5′), but in the model proposed by Robin Holliday, their polarity will be similar (Fig. 8.14).

The Holliday model has been widely accepted and the possible pathways for occurrence of cross­ing over based on Holliday model has been dis­cussed below. This pathway (Fig. 8.15A) begins with an endonuclease that cleaves single strands of each of the two parental DNA molecules (breakage).

Segments of the single strands on one side of each cut are displaced from their complementary strands, probably with the aid of DNA binding proteins, helix destabilizing protein, and DNA unwinding proteins (also called helicases).

The displaced strands then exchange pairing part­ners, base-pairing with the intact complementary strands of homologous chromosomes.

This pro­cess is also aided by certain proteins (rec A pro­tein). As the single strand of one double helix “invades” (displaces the identical or homologous strand and base pairs with the complementary strand) a second homologous double helix, the displaced single strand of the second double helix, in turn, similarly invades the first double helix.

Fig. 8.15B: Double-strand-break model of recombination

The protein (rec A protein) mediates such a reaction by binding to the unpaired strand of DNA, promoting the displacement of a segment of one strand of the double helix by the unpaired strand, once a homologous double helix is found. The cleaved strands are subsequently covalently joined in recombinant arrangements (reunion) by DNA ligase.

If the original breaks in the two strands do not occur at exactly the same site in the two homologues, some “tailoring” will be required before DNA ligase can catalyze the reunion step this tailoring involves excision of a limited number of bases by an exonuclease and repair synthesis by a DNA polymerase. This sequence of events produce an X-shaped recom­bination intermediate (called a “chi” form).

A similar sequence of enzyme catalyzed breakage and reunion events, involving the other two single strands, occurs to complete the process of crossing over.

Homologous recom­bination possibly occurs by more than one mechanism. Evidence from studies of the yeast, Saccharomyces cerevisiae, shows that ends of molecules produced by double strand cuts or breaks are recombinogenic. Thus, a double strand break model of crossing over was pro­posed by Szostak in 1983 (Fig. 8.15B).

The major difference between this model and Holliday model is that recombination is mediated by a double strand break in one of the parental double helices’ and not by just single strand breaks.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


Methods for Genetic Engineering in Mice

Margeaux Wetendorf , . Francesco J. DeMayo , in The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy , 2014

Electroporation of ES Cells

The DNA fragment should be at a concentration of 1 μg/μl in dHOH.

Aliquot 0.7 ml of ES cells to each electroporation cuvette.

Add 25 μl of DNA to each cuvette. Set the electroporator (BIORAD GenePulser II) at 250 V, 500 μF, infinite Ohms.

Press the two red buttons simultaneously to electroporate.

The machine will flash “Ch 9” and will beep when the electroporation is complete. (The time constant should read around 10.)

Leave the cuvettes at room temperature for 5 min.

Change the medium in the feeder plates.

Aliquot 400 μl of electroporated cells to each 100 mm plate.

At 24 h after electroporation, feed the cells with the appropriate selection medium. If using G418 (Geneticin), the concentration is 150–200 μg/ml.

Feed the cells daily until colonies are visible (6–7 days). Colonies are large enough to be picked around day 9–10.


شاهد الفيديو: نظرية الخيوط المنزلقة (شهر فبراير 2023).