معلومة

9.14: طرق الإشارات داخل الخلايا - علم الأحياء

9.14: طرق الإشارات داخل الخلايا - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يعتمد تحريض مسار الإشارات على تعديل مكون خلوي بواسطة إنزيم. فيما يلي بعض الأحداث الأكثر شيوعًا في الإشارات داخل الخلايا.

لاحظ الرسوم المتحركة لإشارات الخلية في هذا الموقع.

الفسفرة

من أكثر التعديلات الكيميائية شيوعًا التي تحدث في مسارات الإشارات إضافة مجموعة الفوسفات (PO4–3) إلى جزيء مثل البروتين في عملية تسمى الفسفرة. يمكن إضافة الفوسفات إلى نوكليوتيد مثل GMP لتشكيل الناتج المحلي الإجمالي أو GTP. غالبًا ما يتم إضافة الفوسفات إلى بقايا السيرين والثريونين والتيروزين للبروتينات ، حيث تحل محل مجموعة الهيدروكسيل من الأحماض الأمينية (الشكل 1). يتم تحفيز نقل الفوسفات بواسطة إنزيم يسمى أ كيناز. تمت تسمية كينازات مختلفة على الركيزة التي تفسفرها. غالبًا ما تؤدي الفسفرة لبقايا السيرين والثريونين إلى تنشيط الإنزيمات. يمكن أن تؤثر الفسفرة لبقايا التيروزين إما على نشاط الإنزيم أو إنشاء موقع ربط يتفاعل مع مكونات المصب في سلسلة الإشارات. قد تنشط الفسفرة أو تعطل الإنزيمات ، وعكس الفسفرة ، نزع الفسفرة بواسطة الفوسفاتيز ، سيعكس التأثير.

الرسل الثاني

الرسل الثاني هي جزيئات صغيرة تنشر إشارة بعد أن تبدأ بربط جزيء الإشارة بالمستقبل. تساعد هذه الجزيئات في نشر إشارة عبر السيتوبلازم عن طريق تغيير سلوك بعض البروتينات الخلوية.

أيون الكالسيوم هو مرسال ثانٍ يستخدم على نطاق واسع. التركيز الحر لأيونات الكالسيوم (Ca2+) داخل الخلية منخفض جدًا لأن المضخات الأيونية في غشاء البلازما تستخدم الأدينوزين-5′-ثلاثي الفوسفات (ATP) باستمرار لإزالته. لأغراض الإشارة ، Ca2+ يتم تخزينها في الحويصلات السيتوبلازمية ، مثل الشبكة الإندوبلازمية ، أو يتم الوصول إليها من خارج الخلية. عند حدوث الإشارات ، تسمح قنوات أيون الكالسيوم ذات بوابات الترابط بمستويات أعلى من الكالسيوم2+ الموجودة خارج الخلية (أو في حجرات التخزين داخل الخلايا) لتتدفق إلى السيتوبلازم ، مما يزيد من تركيز الكالسيوم السيتوبلازمي.2+. الاستجابة للزيادة في الكالسيوم2+ حسب نوع الخلية المعنية. على سبيل المثال ، في خلايا البنكرياس ، Ca2+ تؤدي الإشارات إلى إطلاق الأنسولين ، وفي خلايا العضلات ، تؤدي إلى زيادة الكالسيوم2+ يؤدي إلى تقلصات العضلات.

رسول آخر يستخدم في العديد من أنواع الخلايا المختلفة هو AMP دوري (cAMP). يتم تصنيع AMP الدوري بواسطة إنزيم adenylyl cyclase من ATP (الشكل 2). يتمثل الدور الرئيسي لـ cAMP في الخلايا في الارتباط وتنشيط إنزيم يسمى كيناز المعتمد على cAMP (A-kinase). ينظم A-kinase العديد من مسارات التمثيل الغذائي الحيوية: فهو يفسفوريلات سيرين وثريونين بقايا البروتينات المستهدفة ، وينشطها في هذه العملية. يوجد A-kinase في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، وتختلف البروتينات المستهدفة في كل نوع من الخلايا. تؤدي الاختلافات إلى تباين الاستجابات لـ cAMP في الخلايا المختلفة.

موجود بتركيزات صغيرة في غشاء البلازما ، فوسفوليبيدات الإينوزيتول هي دهون يمكن تحويلها أيضًا إلى رسل ثانٍ. نظرًا لأن هذه الجزيئات عبارة عن مكونات غشائية ، فإنها تقع بالقرب من مستقبلات مرتبطة بالغشاء ويمكن أن تتفاعل معها بسهولة. Phosphatidylinositol (PI) هو الفوسفوليبيد الرئيسي الذي يلعب دورًا في الإشارات الخلوية. الإنزيمات المعروفة باسم كينازات فسفوريلات PI لتشكيل PI-phosphate (PIP) و PI-bisphosphate (PIP)2).

يشق إنزيم phospholipase C PIP2 لتشكيل diacylglycerol (DAG) وثلاثي فوسفات الإينوزيتول (IP3) (الشكل 3). هذه المنتجات من انقسام PIP2 بمثابة الرسل الثاني. يبقى Diacylglycerol (DAG) في غشاء البلازما وينشط بروتين kinase C (PKC) ، والذي يقوم بعد ذلك بفسفوريلات سيرين وثريونين بقايا في البروتينات المستهدفة. IP3 ينتشر في السيتوبلازم ويرتبط بقنوات الكالسيوم ذات بوابات الترابط في الشبكة الإندوبلازمية لإطلاق الكالسيوم2+ التي تستمر في تسلسل الإشارة.

أهداف التعلم

يسمح ارتباط Ligand بالمستقبل بنقل الإشارة عبر الخلية. تسمى سلسلة الأحداث التي تنقل الإشارة عبر الخلية مسار الإشارة أو سلسلة الأحداث. غالبًا ما تكون مسارات الإشارات معقدة للغاية بسبب التفاعل بين البروتينات المختلفة. أحد المكونات الرئيسية لشلالات إشارات الخلية هو فسفرة الجزيئات بواسطة إنزيمات تعرف باسم كينازات. تضيف الفسفرة مجموعة فوسفات إلى بقايا السيرين والثريونين والتيروزين في البروتين ، وتغيير أشكالها وتنشيط البروتين أو تعطيله. يمكن أيضًا أن تكون جزيئات صغيرة مثل النيوكليوتيدات فسفرة. الرسل الثاني عبارة عن جزيئات صغيرة غير بروتينية تُستخدم لنقل إشارة داخل الخلية. بعض الأمثلة على الرسل الثاني هي أيونات الكالسيوم (Ca2+) ، و cyclic AMP (cAMP) ، و diacylglycerol (DAG) ، و inositol triphosphate (IP3).


الفصل 9. الاتصالات الخلوية

الشكل 9.1 هل انفصلت يومًا عن صديق أثناء وجودك في حشد من الناس؟ إذا كان الأمر كذلك ، فأنت تعرف التحدي المتمثل في البحث عن شخص ما عندما يكون محاطًا بآلاف الأشخاص الآخرين. إذا كان لديك أنت وصديقك هواتف محمولة ، فإن فرصكما في العثور على بعضكما البعض جيدة. إن قدرة الهاتف الخلوي على إرسال واستقبال الرسائل تجعله جهاز اتصال مثاليًا. (الائتمان: تعديل العمل بواسطة Vincent and Bella Productions)
  • 9.1 جزيئات الإشارات والمستقبلات الخلوية
  • 9.2 انتشار الإشارة
  • 9.3 الاستجابة للإشارة

وظيفة الكالسيوم والخلية

وظيفة الكالسيوم والخلية ، المجلد 7 يغطي تحويل الإشارة عبر غشاء الخلية. يناقش الكتاب phosphoinositides والكالسيوم الذي يشير إلى cyclases adenylate المحفزة بالكالموديولين والكالسيوم / الكالودولين المعتمد على البروتين. يصف النص أيضًا تنظيم التعبير الجيني عن طريق الكالسيوم وديناميكيات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا أثناء الانقسام الفتيلي وطرق قياس الكالسيوم المتأين داخل الخلايا في خلايا الثدييات. سيجد علماء الصيدلة وعلماء وظائف الأعضاء والأشخاص المشاركون في دراسة وظيفة الكالسيوم والخلية الكتاب لا يقدر بثمن.

وظيفة الكالسيوم والخلية ، المجلد 7 يغطي تحويل الإشارة عبر غشاء الخلية. يناقش الكتاب phosphoinositides والكالسيوم الذي يشير إلى cyclases adenylate المحفزة بالكالموديولين والكالسيوم / الكالودولين المعتمد على البروتين. يصف النص أيضًا تنظيم التعبير الجيني عن طريق الكالسيوم وديناميكيات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا أثناء الانقسام وطرق قياس الكالسيوم المتأين داخل الخلايا في خلايا الثدييات. سيجد علماء الصيدلة وعلماء وظائف الأعضاء والأشخاص المشاركون في دراسة وظيفة الكالسيوم والخلية الكتاب لا يقدر بثمن.


محتويات

في عام 1914 ، لاحظ John S.Dexter ظهور شق في أجنحة ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة سوداء البطن. تم التعرف على أليلات الجين في عام 1917 من قبل عالم الأحياء التطوري الأمريكي توماس هانت مورغان. [4] [5] تم إجراء تحليله الجزيئي وتسلسله بشكل مستقل في الثمانينيات من قبل Spyros Artavanis-Tsakonas و Michael W. Young. [6] [7] أليلات الاثنين C. ايليجانس الشق تم تحديد الجينات بناءً على الأنماط الظاهرية التنموية: لين 12 [8] و GLP-1. [9] [10] الاستنساخ والتسلسل الجزئي لـ لين 12 تم الإبلاغ عنه في نفس الوقت مع ذبابة الفاكهة الشق بواسطة إيفا غرينوالد. [11]

يمتد بروتين Notch غشاء الخلية ، مع جزء منه بالداخل وجزء بالخارج. تحفز بروتينات يجند المرتبطة بالمجال خارج الخلية الانقسام التحلل للبروتين وإطلاق المجال داخل الخلايا ، الذي يدخل نواة الخلية لتعديل التعبير الجيني. [12]

تم اقتراح نموذج الانقسام لأول مرة في عام 1993 بناءً على العمل المنجز ذبابة الفاكهة الشق و C. ايليجانس لين 12، [13] [14] علمت بأول طفرة سرطانية تؤثر على الإنسان الشق الجين. [15] تم تقديم دليل مقنع لهذا النموذج في عام 1998 عن طريق التحليل في الجسم الحي في ذبابة الفاكهة بواسطة غاري ستروهل [16] وفي زرع الخلايا بواسطة رافائيل كوبان. [17] على الرغم من أن هذا النموذج كان محل نزاع في البداية ، [1] كان الدليل المؤيد لهذا النموذج قاطعًا بحلول عام 2001. [18] [19]

يتم تشغيل المستقبل عادة عن طريق الاتصال المباشر من خلية إلى خلية ، حيث تشكل بروتينات الغشاء للخلايا في اتصال مباشر الروابط التي تربط مستقبل الشق. يسمح ربط Notch لمجموعات الخلايا بتنظيم نفسها بحيث ، إذا عبرت خلية واحدة عن سمة معينة ، فقد يتم إيقاف تشغيل هذا في الخلايا المجاورة بواسطة إشارة الشق بين الخلايا. بهذه الطريقة ، تؤثر مجموعات الخلايا على بعضها البعض لتكوين بنى كبيرة. وبالتالي ، فإن آليات التثبيط الجانبي هي مفتاح إشارة الشق. لين 12 و الشق التوسط في قرارات مصير الخلايا الثنائية ، ويتضمن التثبيط الجانبي آليات التغذية الراجعة لتضخيم الاختلافات الأولية. [18]

ال تتالي الشق يتكون من بروابط Notch و Notch ، بالإضافة إلى بروتينات داخل الخلايا تنقل إشارة الشق إلى نواة الخلية. تم العثور على عائلة مستقبلات Notch / Lin-12 / Glp-1 [20] لتكون متورطة في مواصفات مصائر الخلية أثناء التطور في ذبابة الفاكهة و C. ايليجانس. [21]

يشكل المجال داخل الخلايا لـ Notch معقدًا مع CBF1 و Mastermind لتنشيط نسخ الجينات المستهدفة. تم تحديد هيكل المجمع. [22] [23]

يعد مسار إشارات Notch مهمًا للاتصال بين الخلايا الخلوية ، والذي يتضمن آليات تنظيم الجينات التي تتحكم في عمليات تمايز الخلايا المتعددة أثناء الحياة الجنينية وحياة البالغين. تلعب إشارات الشق أيضًا دورًا في العمليات التالية:

    وظيفة والتنمية [24] [25] [26] [27]
  • استقرار مصير الشرايين البطانية وتكوين الأوعية [28]
  • تنظيم أحداث الاتصال الخلوي الحاسمة بين الشغاف وعضلة القلب أثناء تكوين وتمايز الصمام البدائي والبطين [29] ، بالإضافة إلى الآثار المترتبة على الاضطرابات البشرية الأخرى التي تشمل الجهاز القلبي الوعائي [30]
  • مواصفات نسب الخلايا في الوقت المناسب لكل من البنكرياس الصماء والغدد الصماء [31]
  • التأثير على قرارات المصير الثنائي للخلايا التي يجب أن تختار بين الأنساب الإفرازية والامتصاصية في القناة الهضمية [32]
  • توسيع حجرة الخلايا الجذعية المكونة للدم أثناء نمو العظام والمشاركة في الالتزام بسلالة العظام ، مما يشير إلى دور علاجي محتمل للشق في تجديد العظام وهشاشة العظام [33]
  • توسيع الخلايا البطانية الدموية جنبًا إلى جنب مع محور الإشارة الذي يتضمن إشارات القنفذ و Scl [34] التزام النسب من السلائف اللمفاوية الشائعة [35]
  • تنظيم قرار مصير الخلية في الغدد الثديية في عدة مراحل تطور متميزة [36]
  • ربما بعض الآليات غير النووية ، مثل التحكم في الهيكل الشعاعي من خلال التيروزين كيناز آبل [37]
  • تنظيم القرار الانقسامي / الانتصافي في C. ايليجانس خط جرثومي [9]

تكون إشارات الشق غير منظمة في العديد من السرطانات ، [38] والإشارات الخاطئة متورطة في العديد من الأمراض بما في ذلك T-ALL (سرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية) ، [39] CADASIL (اعتلال الشرايين الدماغي السائد مع احتشاءات قشرية تحت القشرية واعتلال بيضاء الدماغ ) ، والتصلب المتعدد (MS) ، ورباعية فالو ، ومتلازمة ألاجيل ، والعديد من الحالات المرضية الأخرى.

لقد ثبت أن تثبيط إشارات الشق له تأثيرات مضادة للتكاثر على ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية في الخلايا المستزرعة وفي نموذج الفأر. [40] [41] [42] وقد وجد أيضًا أن Rex1 له تأثيرات مثبطة على التعبير عن الشق في الخلايا الجذعية الوسيطة ، مما يمنع التمايز. [43]

يتضمن نضج مستقبل الشق الانقسام في الجانب خارج الخلية المحتمل أثناء الاتجار داخل الخلايا في مجمع جولجي. [44] ينتج عن هذا بروتين ثنائي الجزء ، يتكون من مجال كبير خارج الخلية مرتبط بالغشاء الأصغر والمجال داخل الخلايا. يشجع ارتباط ligand على اثنين من أحداث المعالجة المحللة للبروتين نتيجة لتحلل البروتين ، ويتم تحرير المجال داخل الخلايا ويمكن أن يدخل النواة لإشراك البروتينات الأخرى المرتبطة بالحمض النووي وتنظيم التعبير الجيني.

Notch ومعظم روابطه عبارة عن بروتينات عبر الغشاء ، لذلك يجب أن تكون الخلايا التي تعبر عن الروابط عادةً مجاورة للخلية التي تعبر عن الشق حتى تحدث الإشارة. [ بحاجة لمصدر ] روابط القطع هي أيضًا بروتينات عبر الغشاء أحادية المرور وهي أعضاء في عائلة البروتينات DSL (Delta / Serrate / LAG-2). في ذبابة الفاكهة سوداء البطن (ذبابة الفاكهة) ، هناك نوعان من الروابط تسمى دلتا وسيرات. في الثدييات ، الأسماء المطابقة هي Delta-like و Jagged. يوجد في الثدييات العديد من الترابطات المشابهة لـ Delta و Jagged ، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من الروابط الأخرى ، مثل F3 / contactin. [37]

في الديدان الخيطية C. ايليجانس، اثنان من الجينات يشفرون البروتينات المتماثلة ، GLP-1 و لين 12. كان هناك تقرير واحد على الأقل يشير إلى أن بعض الخلايا يمكنها إرسال عمليات تسمح للإشارة بالحدوث بين الخلايا التي يفصل بينها ما يصل إلى أربعة أو خمسة أقطار من الخلايا. [ بحاجة لمصدر ]

يتكون المجال خارج الخلية من الدرجة الأولى من أشكال صغيرة غنية بالسيستين تسمى التكرارات المشابهة لـ EGF. [45]

يحتوي Notch 1 ، على سبيل المثال ، على 36 من هذه التكرارات. يتكون كل تكرار شبيه بـ EGF من حوالي 40 من الأحماض الأمينية ، ويتم تحديد هيكلها إلى حد كبير من خلال ستة بقايا سيستين محفوظة والتي تشكل ثلاث روابط ثاني كبريتيد محفوظة. يمكن تعديل كل تكرار مثل EGF بواسطة اجليكانات مرتبطة في مواقع محددة. [46] أن ا- يمكن إضافة سكر الجلوكوز بين السيستين الأول والثاني المحفوظ ، و ا- يمكن إضافة الفوكوز بين السيستين الثاني والثالث المحفوظ. يتم إضافة هذه السكريات من قبل غير معروف حتى الآن ا-جلوكوزيل ترانسفيراز (باستثناء الرومي) ، والبروتين الناتج المحلي الإجمالي الفوكوز ا-فوكوزيل ترانسفيراز 1 (POFUT1) ، على التوالي. إضافة ا-الفوكوز بواسطة POFUT1 ضروري للغاية لوظيفة الشق ، وبدون الإنزيم المراد إضافته ا- الفوكوز ، كل بروتينات الشق تفشل في العمل بشكل صحيح. حتى الآن ، لا تزال الطريقة التي يؤثر بها الارتباط بالجليكوزيل على الوظيفة غير مفهومة تمامًا.

ال ا- يمكن إطالة الجلوكوز الموجود على الشق إلى ثلاثي السكاريد مع إضافة اثنين من السكريات الزيلوز بواسطة زيلوزيل ترانسفيرازات ، و ا- يمكن إطالة الفوكوز إلى رباعي السكاريد عن طريق الإضافة المطلوبة لسكر N-acetylglucosamine (GlcNAc) بواسطة ناقل N-Acetylglucosaminyltransferase المسمى Fringe ، وإضافة الجالاكتوز بواسطة galactosyltransferase ، وإضافة حمض السياليك عن طريق sialyltransferase. [47]

لإضافة مستوى آخر من التعقيد ، يوجد في الثدييات ثلاثة نقلات هامشية من نوع GlcNAc ، تسمى هامش جنوني ، وهامش جنوني ، وهامش جذري. هذه الإنزيمات مسؤولة عن شيء يسمى "تأثير هامشي" على إشارات الشق. [48] ​​إذا قام Fringe بإضافة GlcNAc إلى ملف ا- سكر الفوكوز ثم الإضافة اللاحقة لجلاكتوز وحمض السياليك. في وجود رباعي السكاريد هذا ، يشير الشق بقوة عندما يتفاعل مع رابطة دلتا ، ولكنه يثبط بشكل ملحوظ إرسال الإشارات عند التفاعل مع يجند Jagged. [49] الوسائل التي من خلالها تمنع إضافة السكر إرسال الإشارات من خلال إحدى الترابطات وتقوي الإشارة من خلال أخرى ليست مفهومة بشكل واضح.

بمجرد أن يتفاعل المجال خارج الخلية مع ligand ، يقوم أحد بروتينات metalloprotease لعائلة ADAM ويسمى ADAM10 ، بشق بروتين الشق خارج الغشاء مباشرة. [50] هذا يطلق الجزء خارج الخلية من الشق (NECD) ، والذي يستمر في التفاعل مع الليجند. يتم بعد ذلك إقران اللجند بالإضافة إلى المجال خارج الخلية من خلال الخلية التي تعبر عن الترابط. قد تكون هناك تأثيرات تأشير في الخلية التي تعبر عن الترابط بعد الالتقام الخلوي ، وهذا الجزء من إشارات الشق هو موضوع بحث نشط. [ بحاجة لمصدر ] بعد هذا الانقسام الأول ، يشق إنزيم يسمى γ-secretase (المتورط في مرض الزهايمر) الجزء المتبقي من بروتين الشق داخل النشرة الداخلية لغشاء الخلية للخلية التي تعبر عن الشق. يؤدي هذا إلى إطلاق المجال داخل الخلايا لبروتين الشق (NICD) ، والذي ينتقل بعد ذلك إلى النواة ، حيث يمكنه تنظيم التعبير الجيني عن طريق تنشيط عامل النسخ CSL. كان يعتقد في الأصل أن هذه البروتينات CSL تمنع النسخ المستهدف من Notch. ومع ذلك ، أظهر المزيد من الأبحاث أنه عندما يرتبط المجال داخل الخلايا بالمركب ، فإنه يتحول من مثبط إلى منشط للنسخ. [51] تشارك البروتينات الأخرى أيضًا في الجزء داخل الخلايا من سلسلة إشارات الشق. [52]

تبدأ إشارات الشق عندما تشتبك مستقبلات Notch على سطح الخلية مع الروابط المقدمة في العابرة على الخلايا المتعارضة. على الرغم من الحجم الواسع لمجال Notch خارج الخلية ، فقد ثبت أن مجالات EGF 11 و 12 هي المحددات الحاسمة للتفاعلات مع دلتا. [53] أشارت دراسات إضافية إلى وجود مناطق خارج Notch EGF11-12 في ارتباط الترابط. على سبيل المثال ، يلعب مجال Notch EGF 8 دورًا في التعرف الانتقائي على Serrate / Jagged [54] ونطاقات EGF 6-15 مطلوبة للإشارة القصوى عند تحفيز الترابط. [55] قدم التركيب البلوري للمناطق المتفاعلة من Notch1 و Delta-like 4 (Dll4) تصورًا جزيئيًا لتفاعلات Notch-ligand ، وكشف أن نطاقات N-terminal MNNL (أو C2) و DSL من الروابط الرابطة إلى مجالات Notch EGF 12 و 11 ، على التوالي. [56] أضاءت بنية Notch1-Dll4 أيضًا دورًا مباشرًا لشقوق الفوكوز والجلوكوز المرتبطة بـ Notch O في التعرف على الترابط ، وعقلنة آلية هيكلية للضبط بوساطة الجليكان لإشارات Notch. [56]

يلعب مسار إشارات Notch دورًا مهمًا في اتصال الخلايا الخلوية ، كما ينظم التطور الجنيني.

تعديل قطبية الأجنة

تشوير الشق مطلوب في تنظيم القطبية. على سبيل المثال ، أظهرت تجارب الطفرات أن فقدان إشارة الشق يسبب قطبية أمامية خلفية غير طبيعية في الجسيدات. [57] أيضًا ، تكون إشارة الشق مطلوبة أثناء تحديد عدم التناسق بين اليسار واليمين في الفقاريات. [58]

الدراسات المبكرة في كائن نموذج الديدان الخيطية C. ايليجانس تشير إلى أن إشارات Notch لها دور رئيسي في تحريض الأديم المتوسط ​​وتحديد مصير الخلية. [9] كما ذكرنا سابقًا ، يحتوي C. elegans على جينين يقومان بترميز متماثلات Notch الزائدة جزئيًا ، GLP-1 و لين 12. [59] خلال C. elegans ، يتفاعل GLP-1 ، وهو متماثل من C. elegans ، مع APX-1 ، وهو متماثل Delta. هذا التأشير بين المتفجرات المعينة يحث على التمايز بين مصائر الخلية ويؤسس المحور الظهري البطني. [60]

تحرير الجسد

تعتبر إشارات الشق أساسية لتكوين الجسد. في عام 1995 ، تبين أن Notch1 مهم لتنسيق تقسيم الجسيدات في الفئران. [61] حددت دراسات أخرى دور تشوير في ساعة التجزئة. افترضت هذه الدراسات أن الوظيفة الأساسية لإشارات Notch لا تعمل على خلية فردية ، ولكنها تنسق ساعات الخلية وتحافظ عليها متزامنة. أوضحت هذه الفرضية دور إشارات Notch في تطوير التجزئة وقد تم دعمها من خلال التجارب على الفئران وسمك الزرد. [62] [63] [64] التجارب مع الفئران المتحولة Delta1 والتي تظهر تكوين جسدي غير طبيعي مع فقدان القطبية الأمامية / الخلفية تشير إلى أن إشارات Notch ضرورية أيضًا للحفاظ على حدود الجسيدات. [61]

أثناء تكوين الجسد ، يحدد مذبذب جزيئي في خلايا الأديم المتوسط ​​المحورية المعدل الدقيق لتكوين الجسيدة. تم اقتراح نموذج الساعة والجبهة الموجية من أجل التحديد المكاني للموقع والحدود بين الجسيدات. يتم تنظيم هذه العملية بشكل كبير حيث يجب أن يكون للجسيدات الحجم والتباعد الصحيحين من أجل تجنب التشوهات داخل الهيكل العظمي المحوري التي قد تؤدي إلى خلل التليف العظمي الفقاري. تساعد العديد من المكونات الرئيسية لمسار إشارات Notch في تنسيق الخطوات الرئيسية في هذه العملية. في الفئران ، تؤدي الطفرات في Notch1 أو Dll1 أو Dll3 أو Lfng أو Hes7 إلى تكوين جسدي غير طبيعي. وبالمثل ، في البشر ، لوحظ أن الطفرات التالية تؤدي إلى تطور خلل التعظم الفقاعي الضلعي: DLL3 أو LFNG أو HES7. [65]

تحرير تمايز البشرة

من المعروف أن إشارات الشق تحدث داخل الخلايا المهدبة المتمايزة الموجودة في طبقات البشرة الأولى أثناء نمو الجلد المبكر. [66] علاوة على ذلك ، فقد وجد أن بريسنيلين -2 يعمل جنبًا إلى جنب مع ARF4 لتنظيم إشارات الشق أثناء هذا التطور. [67] ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كان سيريز جاما له دور مباشر أو غير مباشر في تعديل إشارات Notch.

تم إجراء النتائج المبكرة على إشارات Notch في تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS) بشكل رئيسي في ذبابة الفاكهة مع تجارب الطفرات. على سبيل المثال ، اكتشاف أن النمط الظاهري الجنيني المميت في ذبابة الفاكهة كان مرتبطًا بخلل وظيفي في Notch [68] أشار إلى أن طفرات Notch يمكن أن تؤدي إلى فشل الفصل بين الخلايا العصبية والبشرية في وقت مبكر ذبابة الفاكهة الأجنة. في العقد الماضي ، سمحت التطورات في تقنيات الطفرات والضربة القاضية بإجراء بحث على مسار إشارات Notch في نماذج الثدييات ، وخاصة القوارض.

تم العثور على مسار إشارات Notch ليكون بالغ الأهمية بشكل أساسي لصيانة الخلايا العصبية السلفية (NPC) والتجديد الذاتي. في السنوات الأخيرة ، تم العثور أيضًا على وظائف أخرى لمسار Notch ، بما في ذلك مواصفات الخلية الدبقية ، [69] [70] تطور العصبونات ، [71] بالإضافة إلى التعلم والذاكرة. [72]

تحرير تمايز الخلايا العصبية

يعد مسار Notch ضروريًا للحفاظ على الشخصيات غير القابلة للعب في الدماغ النامي. تنشيط المسار كافٍ للحفاظ على الشخصيات غير القابلة للعب في حالة تكاثر ، في حين أن طفرات فقدان الوظيفة في المكونات الحرجة للمسار تسبب تمايزًا عصبيًا مبكرًا ونضوب NPC. [25] معدِّلات إشارة Notch ، على سبيل المثال ، بروتين Numb قادر على معاداة تأثيرات Notch ، مما يؤدي إلى توقف دورة الخلية وتمايز NPCs. [73] [74] على العكس من ذلك ، فإن مسار عامل نمو الخلايا الليفية يعزز إشارات الشق للحفاظ على الخلايا الجذعية للقشرة الدماغية في حالة تكاثرية ، والتي ترقى إلى آلية تنظم نمو مساحة السطح القشري ، وربما التقسيم. [75] [76] بهذه الطريقة ، تتحكم إشارات Notch في التجديد الذاتي لـ NPC بالإضافة إلى مواصفات مصير الخلية.

تم عرض فرع غير قانوني لمسار إشارات Notch يتضمن فسفرة STAT3 على بقايا السيرين في موضع الأحماض الأمينية 727 وزيادة تعبير Hes3 اللاحقة (STAT3-Ser / Hes3 Signaling Axis) لتنظيم عدد الشخصيات غير القابلة للعب في الثقافة وفي دماغ القوارض البالغة. [77]

في القوارض البالغة وفي زراعة الخلايا ، يعزز Notch3 التمايز العصبي ، وله دور معاكس لـ Notch1 / 2. [78] يشير هذا إلى أن مستقبلات Notch الفردية يمكن أن يكون لها وظائف متباينة ، اعتمادًا على السياق الخلوي.

تحرير تطوير نيوريت

في المختبر تشير الدراسات إلى أن Notch يمكن أن يؤثر على تطور العصب. [71] في الجسم الحي، حذف مُعدِّل إشارات Notch ، Numb ، يعطل نضوج الخلايا العصبية في المخيخ النامي ، [79] بينما يؤدي حذف Numb إلى تعطيل التشجر المحوري في العقد الحسية. [80] على الرغم من أن الآلية الكامنة وراء هذه الظاهرة غير واضحة ، فإن هذه النتائج مجتمعة تشير إلى أن إشارات Notch قد تكون حاسمة في نضوج الخلايا العصبية.

تحرير جليوجينيسيس

في عملية تكوين الخلايا الدبقية ، يبدو أن Notch يلعب دورًا إرشاديًا يمكن أن يعزز بشكل مباشر تمايز العديد من الأنواع الفرعية للخلايا الدبقية. [69] [70] على سبيل المثال ، يؤدي تنشيط إشارات Notch في شبكية العين إلى تفضيل إنتاج خلايا مولر الدبقية على حساب الخلايا العصبية ، بينما يؤدي انخفاض إشارات Notch إلى إنتاج الخلايا العقدية ، مما يؤدي إلى انخفاض عدد الخلايا الدبقية Muller. [25]

تحرير وظيفة الدماغ الكبار

بصرف النظر عن دورها في التطور ، تُظهر الأدلة أن إشارات Notch تشارك أيضًا في موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية ، وتراجع العصبونات ، والتنكس العصبي للسكتة الدماغية الإقفارية في الدماغ [81] بالإضافة إلى الوظائف التنموية ، يتم التعبير عن بروتينات Notch والروابط في خلايا البالغين الجهاز العصبي ، [82] مما يشير إلى دوره في مرونة الجهاز العصبي المركزي طوال الحياة. الفئران البالغة متغايرة الزيجوت للطفرات في Notch1 أو Cbf1 لديها عجز في التعلم المكاني والذاكرة. [72] شوهدت نتائج مماثلة في التجارب مع بريسينيلين 1 و 2 ، والتي تتوسط الانقسام الغشائي للشق. لكي تكون محددًا ، فإن الحذف الشرطي للبريسنيلينات في 3 أسابيع بعد الولادة في الخلايا العصبية المثيرة يسبب عجزًا في التعلم والذاكرة ، واختلالًا وظيفيًا في الخلايا العصبية ، وتنكسًا عصبيًا تدريجيًا. [83] أدت العديد من مثبطات إفراز جاما التي خضعت لتجارب سريرية بشرية في مرض الزهايمر ومرضى MCI إلى تدهور ملحوظ إحصائيًا في الإدراك بالنسبة إلى عناصر التحكم ، والذي يُعتقد أنه يرجع إلى تأثيره العرضي على إشارات Notch. [84]

يعد مسار إشارات Notch مكونًا مهمًا في تكوين القلب والأوعية الدموية وتشكلها في كل من التطور والمرض. مطلوب لاختيار طرف البطانة وخلايا الساق أثناء تشكل الأوعية الدموية. [85]

تحرير تطور القلب

يلعب مسار إشارة الشق دورًا مهمًا في ثلاث عمليات تطوير قلبية على الأقل: تطوير القناة الأذينية البطينية ، وتطور عضلة القلب ، وتطوير مسار تدفق القلب (OFT). [86]

تحرير تطوير القناة الأذينية البطينية (AV)

تحرير التنمية البطينية

تحرير تطوير مجرى التدفق البطيني

تحرير الأوعية الدموية

تستخدم الخلايا البطانية مسار إشارات Notch لتنسيق السلوكيات الخلوية أثناء نمو الأوعية الدموية التي تحدث عملية تكوين الأوعية الدموية. [101] [102] [103] [104]

يتم تنشيط Notch بشكل أساسي في خلايا وخلايا "الموصل" التي تبطن الأوعية الدموية المستقرة من خلال التفاعل المباشر مع ligand 4 (Dll4) الذي يشبه دلتا ، والذي يتم التعبير عنه في خلايا الطرف البطاني. [105] إشارات VEGF ، والتي تعد عاملاً هامًا في انتقال الخلايا البطانية وتكاثرها ، [106] يمكن تقليل تنظيمها في الخلايا ذات الإشارات التنشيطية عن طريق خفض مستويات نسخة مستقبلات نباتية. [107] أجنة الزرد التي تفتقر إلى إشارات الشق تظهر تعبيرًا خارج الرحم ومستمرًا عن تقويم الزرد لـ VEGF3 ، flt4 ، داخل جميع الخلايا البطانية ، بينما يقوم تنشيط Notch بقمع تعبيرها تمامًا. [108]

يمكن استخدام إشارات الشق للتحكم في نمط تنبت الأوعية الدموية أثناء تكوين الأوعية. عندما تتعرض الخلايا الموجودة داخل وعاء براءة الاختراع لإشارات VEGF ، فإن عددًا محدودًا منها فقط هو الذي يبدأ في عملية تكوين الأوعية. Vegf قادر على إحداث تعبير DLL4. بدوره ، يقوم DLL4 الذي يعبر عن الخلايا بضبط مستقبلات Vegf في الخلايا المجاورة من خلال تنشيط Notch ، وبالتالي منع انتقالها إلى البرعم النامي. وبالمثل ، أثناء عملية الإنبات نفسها ، يجب أن يقتصر سلوك الهجرة للخلايا الوصلة على الاحتفاظ بوصلة براءة اختراع للأوعية الدموية الأصلية. [105]

أثناء التطور ، يتمايز الأديم الباطن والأديم الظاهر إلى عدة سلالات ظهارية معدية معوية ، بما في ذلك خلايا الغدد الصماء. أشارت العديد من الدراسات إلى أن إشارات Notch لها دور رئيسي في تطور الغدد الصماء.

تحرير تنمية البنكرياس

يبدأ تكوين البنكرياس من الأديم الباطن في التطور المبكر. تم العثور على التعبير عن عناصر مسار إشارات Notch في البنكرياس النامي ، مما يشير إلى أن إشارات Notch مهمة في تطور البنكرياس. [109] [110] تشير الدلائل إلى أن إشارات Notch تنظم التوظيف التدريجي لأنواع خلايا الغدد الصماء من سلائف مشتركة ، [111] تعمل من خلال آليتين محتملتين. أحدهما هو "التثبيط الجانبي" ، الذي يحدد بعض الخلايا لمصير أولي بينما يحدد البعض الآخر مصيرًا ثانويًا بين الخلايا التي لديها القدرة على تبني نفس المصير. التثبيط الجانبي مطلوب للعديد من أنواع تحديد مصير الخلية. هنا ، يمكن أن يفسر التوزيع المتشتت لخلايا الغدد الصماء داخل ظهارة البنكرياس. [112] الآلية الثانية هي "الصيانة القمعية" ، والتي تشرح دور إشارات Notch في تمايز البنكرياس. يُعتقد أن عامل نمو الخلايا الليفية 10 مهم في هذا النشاط ، لكن التفاصيل غير واضحة. [113] [114]

تحرير التنمية المعوية

تمت الإشارة إلى دور إشارات Notch في تنظيم تطور القناة الهضمية في العديد من التقارير. تؤثر الطفرات في عناصر مسار إشارات Notch على قرارات مصير الخلايا المعوية المبكرة أثناء تطور أسماك الزرد. [115] كشف تحليل النسخ واكتساب التجارب الوظيفية أن إشارات Notch تستهدف Hes1 في الأمعاء وتنظم قرار مصير الخلية الثنائية بين مصائر الخلية الممتصة والإفرازية. [115]

تحرير نمو العظام

مبكرا في المختبر لقد وجدت الدراسات أن مسار إشارات Notch يعمل كمنظم سفلي في تكون الخلايا العظمية وتكوين الخلايا العظمية. [116] يتم التعبير عن Notch1 في منطقة تكاثف اللحمة المتوسطة وبعد ذلك في الخلايا الغضروفية الضخامية أثناء تكوين الغضروف. [117] الإفراط في التعبير عن إشارات Notch يثبط تمايز بانيات العظم الناجم عن بروتين العظم. بشكل عام ، تلعب إشارات Notch دورًا رئيسيًا في التزام الخلايا اللحمية المتوسطة بنسب ورم العظام وتوفر نهجًا علاجيًا محتملاً لتجديد العظام. [33]

الشق متورط في تطور الحويصلات الهوائية في الرئة. [118]

دور إشارات Notch في تحرير اللوكيميا

تعد إشارات الشق الشاذ محركًا لسرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية (T-ALL) [119] ويتم تحويرها في 65٪ على الأقل من جميع حالات T-ALL. [120] يمكن تنشيط إشارات الشق بواسطة الطفرات في Notch نفسها ، أو تعطيل الطفرات في FBXW7 (منظم سلبي لـ Notch1) ، أو نادرًا عن طريق الانتقال t (79) (q34q34.3). في سياق T-ALL ، يتعاون نشاط Notch مع آفات سرطانية إضافية مثل c-MYC لتنشيط المسارات الابتنائية مثل الريبوسوم والتخليق الحيوي للبروتين وبالتالي تعزيز نمو خلايا سرطان الدم. [121]

مثبطات الشق تحرير

أدى تورط إشارات Notch في العديد من السرطانات إلى التحقيق في مثبطات الشق (خاصة مثبطات إفراز جاما) كعلاجات للسرطان في مراحل مختلفة من التجارب السريرية. [2] [122] اعتبارًا من عام 2013 [تحديث] كانت 7 مثبطات على الأقل في التجارب السريرية. [123] أعطت MK-0752 نتائج واعدة في تجربة سريرية مبكرة لسرطان الثدي. [124] أظهرت الدراسات قبل السريرية الآثار المفيدة لمثبطات إفراز جاما في الانتباذ البطاني الرحمي ، [125] وهو مرض يتميز بزيادة التعبير عن مكونات مسار الشق. [126] [127]

من الممكن هندسة مستقبلات Notch الاصطناعية عن طريق استبدال المستقبلات خارج الخلية ومجالات النسخ داخل الخلايا بمجالات أخرى مفضلة. يسمح هذا للباحثين باختيار الروابط التي يتم اكتشافها ، وأي الجينات يتم تنظيمها استجابةً لذلك. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للخلايا الإبلاغ عن سلوكها أو تغييره استجابةً للتلامس مع الإشارات التي يحددها المستخدم ، مما يسهل طرقًا جديدة للبحث الأساسي والتطبيقي في إشارات الخلايا الخلوية. [128] والجدير بالذكر أن هذا النظام يسمح بتصميم مسارات تركيبية متعددة في خلية بالتوازي. [129] [130]


الملخص

تتكون الطبقة القرنية (SC) ، الطبقة الخارجية من البشرة ، من خلايا كيراتينية غير نواة غير قابلة للحياة ، تسمى الخلايا القرنية ، والتي تعمل كحاجز وقائي. لا تزال الأنماط الدقيقة لموت الخلايا التي تنفذها الخلايا الكيراتينية في الطبقة الحبيبية العليا (خلايا SG1) غير معروفة إلى حد كبير. هنا ، باستخدام التصوير داخل الحجاج جنبًا إلى جنب مع تحقيقات الفلورسنت المستجيبة للأس الهيدروجيني Ca 2 + داخل الخلايا ، كنا نهدف إلى تشريح عملية موت SG1 في الجسم الحي. وجدنا أن موت خلايا SG1 قد سبقه ارتفاع طويل الأمد (60 دقيقة) Ca 2 + وتحريض سريع لتحمض داخل الخلايا. بمجرد بدء مثل هذه التغييرات الأيونية داخل الخلايا ، أصبحت مستدامة ، وتلزم خلايا SG1 بتحويل الخلايا القرنية بشكل لا رجعة فيه. كشف التصوير الفاصل الزمني لخلايا SG1 المعزولة من الفئران أن التحمض داخل الخلايا كان ضروريًا لتدهور حبيبات الكيراتوهيالين والحمض النووي النووي ، وهي ظاهرة خاصة بتكوين الخلايا القرنية SC. علاوة على ذلك ، أظهر التصوير داخل الحجاج أن عدد خلايا SG1 التي تظهر ارتفاع Ca 2+ وتوقيت التحمض داخل الخلايا تم تنظيمهما بإحكام بواسطة قناة الكاتيون المحتملة للمستقبلات العابرة V3. تم تأكيد النشاط الوظيفي لهذا البروتين في خلايا SG1 المعزولة باستخدام تحليل مشبك التصحيح للخلية الكاملة. توفر هذه النتائج إطارًا نظريًا لتحسين فهم الآليات الجزيئية الفريدة الكامنة وراء وضع الموت الخاص بالخلية الكيراتينية ، أي ترقق القرنية.


ورقة منتج البروتين داخل الخلايا أحادية الخلية

تلتقط رقاقة IsoCode "Proteomic Barcoded" الخاصة بنا والحاصلة على براءة اختراع ، خلايا مفردة في كل غرفة صغيرة ، وتكتشف النطاق الكامل للبروتينات الفوسفورية ، مما يتيح الاكتشافات التنبؤية داخل الخلايا.

P-PRAS40 و P-IkBα و P-NF-kβ p65 و P-Met و P-p44 / 42 MAPK و P-S6 Ribosomal و P-Rb و P-p90RSK و P-STAT3 و P-MEK1 / 2 و P -Stat1 ، P-Stat5 ، P-eIF4E ، PARP المشقوق ، Alpha Tubulin

P-Akt و P-p53 و P-PD1 و P-LCK و P-CD3 زيتا و P-Zap70 و P-CCR7 و P-CD28 و P-41BB و P-MEK 1/2 و P-P44 / 42 MAPK (ERK1 / 2) ، P-Jak1 ، P-Jak2 ، P-AMPK ، P-PI3K ، P-mTOR ، P-P21 ، P-LAT ، P-NF-kB p65 ، Alpha Tubulin

يسمح حل البروتينات داخل الخلايا أحادية الخلية المبتكرة للمستخدمين بتحليل تسلسلات الإشارات للعديد من البروتينات الفوسفورية مباشرة من كل خلية مفردة ، عبر آلاف الخلايا المفردة بالتوازي ، لأول مرة. القفزة على التقنيات الحالية مثل اللطخة الغربية ، وقياس الطيف الكتلي ، وقياس التدفق الخلوي ، هي قدرة محلول البروتين أحادي الخلية داخل الخلايا على تحديد التحليلات داخل الخلايا وتعددها بشكل كبير في وقت واحد من كل خلية ، وبالتالي اكتشاف البروتينات الحرجة لتفاعلات البروتين وشبكات الإشارات في الخلايا النادرة ومجموعات الخلايا الفرعية.


طرق التشوير داخل الخلايا

يعمل تحريض مسار الإشارة على تنشيط سلسلة من التعديلات الأنزيمية التي يتم التعرف عليها بدورها بواسطة المكون التالي في اتجاه مجرى النهر.

أهداف التعلم

اشرح كيف يبدأ ارتباط ligand في تحويل الإشارة في جميع أنحاء الخلية

الماخذ الرئيسية

النقاط الرئيسية

  • تعد الفسفرة ، إضافة مجموعة فوسفات إلى جزيء مثل البروتين ، أحد أكثر التعديلات الكيميائية شيوعًا التي تحدث في مسارات الإشارات.
  • يعد تنشيط الرسل الثاني ، الجزيئات الصغيرة التي تنشر إشارة ، حدثًا شائعًا بعد تحريض مسار الإشارة.
  • أيون الكالسيوم ، AMP الدوري ، وفوسفوليبيدات الإينوزيتول هي أمثلة على الرسل الثاني المستخدم على نطاق واسع.

الشروط الاساسية

  • الرسول الثاني: أي مادة تستخدم لنقل إشارة داخل الخلية ، خاصة تلك التي تطلق سلسلة من الأحداث عن طريق تنشيط المكونات الخلوية
  • الفسفرة: إضافة مجموعة فوسفات إلى مركب غالبًا ما يتم تحفيزه بواسطة الإنزيمات

يعتمد تحريض مسار الإشارات على تعديل مكون خلوي بواسطة إنزيم. هناك العديد من التعديلات الأنزيمية التي يمكن أن تحدث والتي يتم التعرف عليها بدورها من قبل المكون التالي المصب.

من أكثر التعديلات الكيميائية شيوعًا التي تحدث في مسارات الإشارات إضافة مجموعة الفوسفات (PO4 -3) لجزيء مثل البروتين في عملية تسمى الفسفرة. يمكن إضافة الفوسفات إلى نوكليوتيد مثل GMP لتشكيل الناتج المحلي الإجمالي أو GTP. غالبًا ما يتم إضافة الفوسفات إلى بقايا السيرين والثريونين والتيروزين للبروتينات حيث تحل محل مجموعة الهيدروكسيل من الأحماض الأمينية. يتم تحفيز نقل الفوسفات بواسطة إنزيم يسمى كيناز. تمت تسمية كينازات مختلفة على الركيزة التي تفسفرها. غالبًا ما تؤدي الفسفرة لبقايا السيرين والثريونين إلى تنشيط الإنزيمات. يمكن أن تؤثر الفسفرة لبقايا التيروزين إما على نشاط الإنزيم أو إنشاء موقع ربط يتفاعل مع مكونات المصب في سلسلة الإشارات. قد تنشط الفسفرة أو تعطل الإنزيمات عكس الفسفرة ، إزالة الفسفرة بواسطة الفوسفاتيز ، سيعكس التأثير.

مثال على الفسفرة: في فسفرة البروتين ، تضاف مجموعة فوسفات (PO4-3) إلى بقايا الأحماض الأمينية سيرين وثريونين وتيروزين.

يعد تنشيط الرسل الثاني أيضًا حدثًا شائعًا بعد تحريض مسار الإشارات. إنها جزيئات صغيرة تنشر إشارة بعد أن تبدأ بربط جزيء الإشارة بالمستقبل. تساعد هذه الجزيئات في نشر إشارة عبر السيتوبلازم عن طريق تغيير سلوك بعض البروتينات الخلوية.

أيون الكالسيوم هو مرسال ثانٍ يستخدم على نطاق واسع. التركيز الحر لأيونات الكالسيوم (Ca 2+) داخل الخلية منخفض جدًا لأن مضخات الأيونات في غشاء البلازما تستخدم الأدينوزين -5 و # 8242-ثلاثي الفوسفات (ATP) بشكل مستمر لإزالته. لأغراض الإشارة ، يتم تخزين Ca 2+ في الحويصلات السيتوبلازمية ، مثل الشبكة الإندوبلازمية ، أو الوصول إليها من خارج الخلية. عند حدوث الإشارات ، تسمح قنوات أيونات الكالسيوم ذات البوابات الترابطية للمستويات الأعلى من Ca 2+ الموجودة خارج الخلية (أو في حجرات التخزين داخل الخلايا) بالتدفق إلى السيتوبلازم ، مما يرفع تركيز السيتوبلازم Ca 2+. تختلف الاستجابة للزيادة في Ca 2+ ، اعتمادًا على نوع الخلية المعنية. على سبيل المثال ، في خلايا β في البنكرياس ، تؤدي إشارات Ca 2+ إلى إطلاق الأنسولين ، بينما في خلايا العضلات ، تؤدي زيادة الكالسيوم 2+ إلى تقلصات العضلات.

رسول آخر يستخدم في العديد من أنواع الخلايا المختلفة هو دوري AMP (cAMP). يتم تصنيع AMP الدوري بواسطة إنزيم adenylyl cyclase من ATP. يتمثل الدور الرئيسي لـ cAMP في الخلايا في الارتباط وتنشيط إنزيم يسمى كيناز المعتمد على cAMP (A-kinase). ينظم A-kinase العديد من مسارات التمثيل الغذائي الحيوية. يعمل على فسفرة بقايا السيرين والثريونين من البروتينات المستهدفة ، مما يؤدي إلى تنشيطها في هذه العملية. يوجد A-kinase في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، تختلف البروتينات المستهدفة في كل نوع من الخلايا. تؤدي الاختلافات إلى تباين الاستجابات لـ cAMP في الخلايا المختلفة.

مثال على cAMP كرسول ثانٍ: يوضح هذا الرسم البياني آلية تكوين AMP الدوري (cAMP). يعمل cAMP كرسول ثانٍ لتنشيط أو تعطيل البروتينات داخل الخلية. يحدث إنهاء الإشارة عندما يقوم إنزيم يسمى phosphodiesterase بتحويل cAMP إلى AMP.

توجد بتركيزات صغيرة في غشاء البلازما ، فوسفوليبيدات الإينوزيتول عبارة عن دهون يمكن أيضًا تحويلها إلى رسل ثانٍ. نظرًا لأن هذه الجزيئات عبارة عن مكونات غشائية ، فإنها تقع بالقرب من مستقبلات مرتبطة بالغشاء ويمكن أن تتفاعل معها بسهولة. Phosphatidylinositol (PI) هو الفوسفوليبيد الرئيسي الذي يلعب دورًا في الإشارات الخلوية. الإنزيمات المعروفة باسم كينازات فسفوريلات PI لتشكيل PI-phosphate (PIP) و PI-bisphosphate (PIP)2).


كيف يشير الأنسولين إلى خلية تأخذ الجلوكوز؟

يظهر مثال رائع (وجيد الاستخدام) لمسار إشارات الخلية في إجراءات موازنة الأنسولين. الأنسولين ، وهو بروتين صغير ينتجه البنكرياس ، يتم إطلاقه عندما ترتفع مستويات الجلوكوز في الدم بشكل كبير.

أولاً ، تحفز مستويات الجلوكوز المرتفعة في البنكرياس إطلاق الأنسولين في مجرى الدم. يجد الأنسولين طريقه إلى خلايا الجسم حيث يرتبط بمستقبلات الأنسولين. يؤدي هذا إلى بدء مسار تحويل الإشارة داخل كل خلية مما يؤدي إلى فتح قنوات الجلوكوز ، كما هو موضح في هذا الرسم البياني:

مع تدفق الجلوكوز إلى الخلية ، تنخفض مستويات الجلوكوز في مجرى الدم ببطء. ستستخدم الخلايا الجلوكوز لإنتاج طاقة ATP أو تقوم الخلايا بتخزينها على شكل دهون ونشويات لاستخدامها لاحقًا. بمجرد انخفاض مستوى الجلوكوز في مجرى الدم إلى مستوى كافٍ ، يتوقف البنكرياس عن إنتاج الأنسولين ، وتغلق الخلايا قنوات الجلوكوز الخاصة بها.


الشكل 3

الشكل 3. صور مدينة دبي للإنترنت لخلايا CHO قبل وأثناء وبعد التثقيب الكهربائي عندما تم تطبيق نبضة 800 فولت / سم و 25 مللي ثانية. (أ) سلسلة الصور التي أظهرت التغيير الديناميكي في مورفولوجيا الخلية خلال عملية التثقيب الكهربائي. (ب) صور الخلايا قبل و 24 ساعة بعد تطبيق النبض. الخلايا التي كانت حية بعد 24 ساعة من التثقيب الكهربائي تتميز بنقاط حمراء في الصورة العلوية.

في الشكل 4 ، قمنا بفحص النسبة المئوية لإطلاق البروتين من الخلايا المفردة عندما تعرضوا جميعًا لنبضة تبلغ 800 فولت / سم و 25 مللي ثانية (من خلال مقارنة صورة التألق للخلايا المفردة قبل وبعد التثقيب الكهربائي) ثم قمنا بتجميع الرسم البياني للربط إطلاق البروتين لمصير الخلية (حي / ميت). يبدو أن عدد الخلايا يظهر تقريبًا توزيعًا طبيعيًا من حيث إطلاق النسبة المئوية مع إطلاق أكبر عدد من الخلايا لمستوى متوسط ​​من البروتين (25-45٪). ومع ذلك ، لم يكن هناك ما يشير إلى أن نسبة أعلى من إطلاق البروتين كانت مرتبطة باحتمالية أعلى لموت الخلية على مستوى الخلية المفردة. بشكل غير متوقع ، يبدو أن احتمال موت الخلية أقل في الطرف الأعلى من إطلاق البروتين. يبدو أن هذا يشير إلى آليات الاسترداد المحتملة التي لا يتم تشغيلها إلا من خلال كمية أكبر من إطلاق البروتين وتساعد في الحفاظ على بقاء الخلية بعد الإجراء. ستتطلب تفاصيل هذه الآليات مزيدًا من الدراسات المنهجية.


فى الموقع التهجين (ISH) والفلورة فى الموقع التهجين (FISH)

فى الموقع Hybridization (ISH) is a method that allows to localize and detect nucleic acid sequences within structurally intact cells or morphologically preserved tissues sections. ضوئي فى الموقع hybridization (FISH) is a kind of ISH which uses fluorescent probes binding parts of the chromosome to show a high degree of sequence complementarity. The basic principles for FISH and all other methods of فى الموقع hybridization are the same, except one is utilizing a fluorescence probe to detect specific nucleotide sequences within cells and tissues. They differ from immunohistochemistry which usually localize proteins in tissue sections. فى الموقع hybridization can be performed on a variety of targets, including RNA within cells, DNA in metaphase chromosome preparations obtained from mitotic cells, or DNA in interphase nuclei from cells in the non-mitotic phases of the cell cycle. In addition to the advantages of detection in morphologic context, فى الموقع hybridization has become popular also because of its high sensitivity in nucleic acid detection. فى الموقع hybridization has been widely used for research applications, including clinical cytogenetics, gene mapping, tumor biology and studies of chromosome evolution.

Choice of Probe

Probe is critical to فى الموقع hybridization, and a right probe can help you achieve your goals. Not only the probe types but also the label of probe should you take into account when you choose a probe for فى الموقع تهجين.

There are essentially four types of probe that can be used in performing فى الموقع تهجين. The information of the probe types is listed in Table1.

Table1 The information of probe types

Probe Types مزايا سلبيات
Double-stranded DNA (dsDNA) probes Stable, available, easier to obtain Self-hybridize, less sensitive, need denaturation before hybridization
Single-stranded DNA (ssDNA) probes Stable, easier to work with, more specific, resistant to RNases, better tissue penetration, without self-hybridize Time consuming, expensive
RNA probes (riboprobes) Higher thermal stability, better tissue penetration, more specific, low background noise by RNase Sensitive to RNases
Synthetic oligonucleotides Economical, stable, available, easier to work with, more specific, resistant to RNases, better tissue penetration, better reproducibility Know the information of nucleotide sequence

To "see" where the probe has bound within your cells or tissue section you must attach a label to the probe before hybridization. The presence of the label should not interfere with the hybridization reaction. There are a variety of labeling techniques which can be divided into two types: radioactive isotopes and non-radioactive labels.

Radiolabeled probes, including 3 H, 35 S, 32 P, are still widely used due to its high activity which can be detected transcripts in low amounts. When using the radiolabeling, waste disposal and containment measures must be take into account and it must be noted that the useful shelf life of your labeled probe is inherently dependent on the half-life of the radionucleotide.

On the other hand, non-radioactive successfully used with فى الموقع hybridization include digoxigenin (DIG), biotin and fluorescent labels. The non-radioactive labeled probe can be either used immediately or be stored at -20 °C as these non-radioactive labels have no inherent "decay" kinetics.

The process of the فى الموقع hybridization can be divided into following steps:

Fig1. The process of genomic فى الموقع hybridization (S P Brammer, وآخرون, 2013)

1. Slide Preparation

For chromosome spreads, alcohol/ether (1:1) cleaned slides are sufficient. However, since tissue sections may be lost during the procedure, either polylysine or glutaraldehyde-activated gelatin chrome aluminum slides for these sections are required.

2. Sample Collection and Fixation

To preserve morphology, fresh tissue should be rapidly removed and fixed as soon as possible. From a chemical point of view, common precipitating fixatives (such as acetic acid/ethanol and Carnoy's fixative) are not recommended because of a fear that such fixatives would make the cell matrix impermeable, or alter the target nucleic acid to a point that hybridization would be reduced or prevented.

For metaphase chromosome spreads, methanol/acetic acid fixation is usually sufficient. For paraffin-embedded tissue sections, formalin fixation is always used. Cryostat sections fixed for 30 min with 4% formaldehyde or with Bouin’s fixative have been used successfully, as well as paraformaldehyde vapor fixation. There is still no fixation protocol which can be used for all substrates, and the fixation protocols must be optimized for different applications.

3. Embedding and Section

After fixation, the sample is embedded in paraffin or OCT for long-term storage and sectioning for subsequent procedure. The embedded tissues can be sectioned to thin slices with microtome or freezing microtome (15-20μm).

4. Permeablization

It is known that the target DNA or RNA sequences are surrounded by proteins and the extensive cross-linking of these proteins mask the target nucleic acid, which present obstacles to good infiltration of the probe. Therefore, permeabilization procedures are critical to فى الموقع تهجين. Three main reagents used to permeabilize tissue are proteinase, HCl and detergents.

Protease treatment serves to increase target accessibility by digesting the proteins that surround the target nucleic acid. Proteinase K or pronase is usually used to remove those proteins. Optimal concentration has to be determined but a normal starting concentration is 1 μg/ml. Incubation has to be carefully monitored because if the digestion proceeds to far you could end up destroying most of the tissue or cell integrity.

In some protocols a 20-30 min treatment with 0.2M HCl is recommended. Although the precise action of the acid is unknown, the extraction of proteins and hydrolysis of the target sequence may contribute to a decrease of the level of background staining.

The Triton X-100, SDS and other detergents, are frequently used to permeabilize the membranes by extracting the lipids membrane. This is not usually required in tissue that has been embedded in wax, but it is critical to intact cells or cryostat sections.

5. Pretreatment/ Prehybridization

Pretreatment/ prehybridization is generally carried out to low the background noise.

When an enzyme (such as peroxidases or alkaline phosphatases) is used visualize the label, the endogenous enzymes which could result in high background have to be inactivated. This can be achieved with peroxidase by treating the sample with 1% H2ا2 methanol for 30 min. As for alkaline phosphatase, the levamisole can be added to the substrate solution, however this may be unnecessary since the residual alkaline phosphatase activity is usually lost during hybridization.

RNase treatment serves to remove endogenous RNA and decrease background in hybridization reaction. It is performed by incubating the preparations in DNase-free RNase (100 μg/ml) in 2xSSC (SSC = 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4) at 37°C for 60 min.

Prehybridization is carried out by incubating the tissue or section within a solution that contains all the components of the hybridization mixture, minus the probe. Not all protocols need this step.

6. Hybridization

Hybridization depends on the ability of the probe to anneal with a complementary target strand just below its melting point (Tm). Additionally, the composition of the hybridization solution is important to control the efficiency of hybridization process. The factors affecting the hybridization of the probe to the target sequence are:

  • monovalent cation concentration
  • درجة الحرارة
  • organic solvents
  • الرقم الهيدروجيني
  • other components such as ssDNA, tRNA, ssDNA and polyA

Unbound or loosely bound probes are removed by performing washes. Solution parameters such as temperature, salt and detergent concentration can be manipulated to remove non-specific interactions.

8. Detection

As mentioned above, radiolabeled probes are detected by either photographic film or photographic emulsion. For non-radiolabeled probes, there are two methods: direct and indirect:


شاهد الفيديو: Virussen (ديسمبر 2022).