معلومة

تجميع الفيروس في المختبر

تجميع الفيروس في المختبر


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل الباحثون قادرون على تجميع الفيروسات في المختبر?

على سبيل المثال ، أتخيل أن مكتبة عرض الملتهمة يمكن أن يتم إنشاؤها عن طريق إلقاء البروتينات القفيصة (أو ما لديك) في أنبوب اختبار جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي ذي الصلة الذي سيتجمع ذاتيًا. هل تم ذلك؟ إذا كان الأمر كذلك ، فهل هي تقنية قابلة للتطبيق بسهولة على مجموعة واسعة من الفيروسات؟


نعم ، وسيؤدي البحث السريع عن التجميع في المختبر الفيروسي إلى ظهور الكثير من النتائج. - الأمر أكثر تعقيدًا من ذلك بقليل! - لكن لا يتم ذلك عادةً على هذا النحو ، وهو ما سأوضحه. في الأساس ، هناك أربعة أشياء قد ترغب في القيام بها:

  1. تريد أن تصنع كميات كبيرة من الفيروسات وتدرسها. إذا كان الأمر كذلك ، فكل ما عليك فعله هو إصابة ثقافة الخلية بالفيروس الخاص بك والسماح له بالتكاثر. من الواضح أن بعضها أسهل من البعض الآخر - من تجربتي الخاصة ، فإن فيروس نقص المناعة البشرية سهل جدًا ولكن التهاب الكبد الوبائي سي هو بيتا حقيقي - لكن هذا في الأساس هو. من الواضح أن هذا يفترض أن لديك بالفعل بعض مخزون الفيروسات في متناول اليد للعدوى. يمكنك أيضًا نقل الثقافة باستخدام بلازميدات فيروسية كاملة الطول ، مما يقودني إلى ...
  2. تريد دراسة بعض الجوانب المحددة للفيروس. هذا بارد! معظم الناس لا يقومون فقط بتلفيق الفيروسات. بشكل عام ، بالنسبة للفيروسات التي يمكن أن يصاب بها البشر ، يوصى عمومًا / نشجع بشدة على استخدام ما تحتاجه فقط لأسباب تتعلق بالسلامة. لذلك ، على سبيل المثال ، قد تقوم بنقل البروتين الوحيد الذي تعتقد أنه مهم لمعرفة ما يفعله بمفرده. بعد ذلك ، قد تنتقل العدوى إلى مزرعة الخلية بالفيروس الكامل ، ولكن بجين واحد مهم تم القضاء عليه. اعتدت على صنع فيروس نقص المناعة البشرية من جولة واحدة باستخدام بلازميد لفيروس نقص المناعة البشرية كامل الطول بدون جين مغلف فعال وبلازميد آخر لمغلف VSV ؛ ستصبح جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية الجديدة معدية بسبب جين VSV ولكن بعد الإصابة لم يعد لديهم هذا الجين بعد الآن. في الأساس ، نسخة محدودة من الفيروس ، والتي تقودني إلى ...
  3. تريد صنع جزيئات تشبه الفيروسات. هذه واحدة من أكثر الأشياء شهرة في العلم وهي كما تبدو - جزيئات تشبه الفيروسات إلى حد كبير ، ولكنها ليست كذلك. بشكل عام ، إنها قذائف فارغة. يمكننا استخدامها لجميع أنواع الأشياء ، من دراسات اللقاحات إلى الجينات والأمراض الأخرى. يمكن أن تختلف الأساليب ، لكنها بشكل عام مماثلة لما ورد أعلاه.
  4. تريد تقديم البعض آخر الجين إلى نظام استنبات الخلية ، باستخدام العمود الفقري للفيروس للتوصيل ؛ أعتقد "أريد إصلاح هذه الخلايا ... بشكل دائم." بشكل عام ، تعتمد هذه الفيروسات عادةً على الفيروس الغدي أو الفيروس البطيء (المعروف أيضًا باسم فيروس نقص المناعة البشرية) لأنها ستدخل جيناتها في جينوم الخلية ، لذلك سيستمر الجين.

ربما يكون العنصر 4 هو الأقرب إلى ما قصدته تحديدًا. فيما يلي مراجعة مجانية لاستخدام وسلامة ناقلات الفيروسات القهقرية في البشر ، وإليك مراجعة رائعة في الأسماك. بالنسبة للفيروسات التي تنطبق عليها ، فهذا يختلف كثيرًا حسب الفيروس والمضيف ونظام الثقافة وما إلى ذلك.


الجمعية المختبرية للفيروسات القهقرية

يبدأ التجميع ، وهو جزء من المراحل المتأخرة من دورة حياة الفيروسات القهقرية ، عندما يرتبط Gag الهيكلي متعدد البروتينات بالحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي. في النهاية ، تشكل أكثر من ألف جزيء من جزيئات الكمامة فيريونًا كرويًا غير ناضج. يحدث النضج بعد فترة وجيزة من نمو الفيروس أو بالتزامن معه ويبدأ عندما ينشطر البروتياز الفيروسي في مجالات البروتين المكونة له. يُعتقد أن النواة غير الناضجة تتفكك وبروتينات CA المحررة لتتجمع في قفيصة ناضجة متميزة شكليًا. تم استخدام التجميع في المختبر مع مشتقات Gag و CA لدراسة الفيروسات القهقرية لأكثر من عقدين. في هذه المراجعة ، نفحص اكتشاف وتطوير ثلاثة أنظمة نموذجية رئيسية [فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) ، فيروس ساركوما روس (RSV) ، وفيروس قرد Mason-Pfizer (MPMV)] ومناقشة السمات والجوانب الهيكلية من مسار التجميع الفيروسي الذي تم الكشف عنه باستخدام التجميع في المختبر. كما طرحنا سؤالين رئيسيين لم يتم حلهما في هذا المجال ونقترح سبلًا مستقبلية للبحث.


الملخص

الفيروسات عبارة عن معقدات فوق الجزيئية عالية الترتيب تطورت لتنتشر عن طريق اختطاف آلية الخلية المضيفة. على الرغم من أن الفيروسات شديدة التنوع ، وتنتشر عبر خلايا جميع ممالك الحياة ، إلا أنها تشترك في وظائف وخصائص مشتركة. بجانب الاهتمام العام بعلم الفيروسات ، تكتسب الآليات الفيروسية الأساسية أهمية متزايدة في تخصصات أخرى مثل الطب الحيوي وتكنولوجيا النانو (الحيوية). ومع ذلك ، من أجل الاستخدام الأمثل للفيروسات والجسيمات الشبيهة بالفيروسات ، على سبيل المثال كوسيلة لتوصيل الأدوية المستهدفة أو كعناصر بناء في الإلكترونيات ، من الضروري فهم خصائصها الكيميائية والفيزيائية الأساسية وخصائصها. في هذا السياق ، زاد عدد الدراسات التي تتناول الآليات التي تحكم الخصائص والعمليات الفيروسية بشكل كبير مؤخرًا. تلخص هذه المراجعة جزءًا محددًا من هذه الإنجازات العلمية ، ولا سيما معالجة مناهج علم الفيروسات الفيزيائية التي تهدف إلى فهم التجميع الذاتي للفيروسات والخصائص الميكانيكية للجسيمات الفيروسية. باستخدام منظور فيزيائي كيميائي ، ركزنا على الدراسات الأساسية التي تقدم لمحة عامة عن الأساس الجزيئي الذي يحكم هذه الجوانب الرئيسية للأنظمة الفيروسية.

  • المواد النانوية المستوحاة من البيولوجيا والبروتين والبنى القائمة على الفيروسات
  • مناهج تقنية النانو للبيولوجيا و gt Nanoscale Systems في علم الأحياء

تجميع فيروسات المختبر - علم الأحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يمكن إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


قراءة٪ s

خلال جلسة الفصل الأول ، سيقوم المعلمون والطلاب بتقديم أنفسهم. سيقدم المعلمون الدورة ويستعرضون المتطلبات والتوقعات الموضحة في المنهج الدراسي. سيقدم المدربون بعد ذلك محاضرة موجزة تحدد خلفية وأساسيات بنية الفيروس وتجميعه. أخيرًا ، سيتم تقديم موضوع الأسبوع 2.

مبادئ تناظر الفيروسات

لاحظ واتسون وكريك أن الحمض النووي الفيروسي لا يمكنه ترميز بروتين واحد كبير بما يكفي لإحاطة الفيروس ، واقترح أن وحدات فرعية متطابقة متعددة بلمرة في بنية لإيواء الحمض النووي الفيروسي. اقترح Caspar و Klug شكليات هندسية ، تسمى شبه التكافؤ ، لشرح كيف 1) يمكن بناء قفيصة كروية من pentamers و hexamers و 2) يمكن للبروتين أن يشارك في تفاعلات غير متكافئة.

كاسبار ، دي.إل. ، وأ.كلوج. "المبادئ الفيزيائية في بناء الفيروسات العادية." كولد سبرينغ هارب سيمب كوانت بيول 27 (1962): 1-24.

ليدنجتون ، آر سي ، واي يان ، جيه مولاي ، ر. سهلي ، تي إل بنجامين ، إس سي هاريسون. "هيكل الفيروس القرد 40 بدقة 3.8-A." طبيعة سجية 354 (1991): 278-84.

علم البلورات الفيروسي و Cryo-EM

علم البلورات ، ومؤخرًا ، المجهر الإلكتروني البارد ، هي تقنيات مستخدمة لتحديد هياكل الفيروسات. في الوقت الذي حل فيه ويكوف وزملاؤه بنية فيروس كامل ، HK97 ، كان أكبر هيكل تم حله عن طريق علم البلورات. يوفر Cryo-EM ، على الرغم من أنه ليس بدقة عالية ، معلومات من عينات رطبة مجمدة دون الحاجة إلى بلورات. وو وآخرون. حددت بنية فيروس الهربس وأظهرت مواقع الوحدات الفرعية داخل الهيكل.

Wikoff و W. R. و L. Liljas و R.L Duda و H. Tsuruta و R.W Hendrix و J. E. Johnson. "حلقات البروتين المرتبطة طوبولوجيًا في قفيصة البكتيريا HK97." علم 289 (2000): 2129-33.

Wu، L.، P. Lo، X. Yu، J. K. Stoops، B. Forghani، and Z. H. Zhou. "هيكل ثلاثي الأبعاد لفيروس الهربس البشري 8 قفيصة." ياء فيرول 74 (2000): 9646-54.

يجب أن تُبنى القفيصات من القطع المكونة لها. تتشكل بدون أي مساعدة خارجية أو طاقة في عملية تسمى غالبًا "التجميع الذاتي". طور Prevelige and King واحدًا من أقدم أنظمة التجميع المختبرية لفيروس إيكوساهدرا. استخدم كونواي وزملاؤه تقنية cryo-em لدراسة توافق قفيصات الفيروس مع نضوجها بمرور الوقت ، وهي عملية تؤدي إلى تمدد وزيادة صلابة الغلاف الفيروسي.

كونواي ، جيه إف ، آر إل دودا ، إن تشينج ، آر دبليو هندريكس ، وآيه سي ستيفن. "التحلل البروتيني والتحكم التوافقي لنضج قفيصة الفيروس: نظام عاثيات HK97." J مول بيول 253 (1995): 86-99.

بريفيليج ، بي إي ، الابن ، دي توماس ، وجيه إيه كينج. "مراحل التنوي والنمو في بلمرة الغلاف والوحدات الفرعية للسقالات في قذائف البروكابسيد العشرينية السطوح." بيوفيس ج 64 ، لا. 3 (1993): 824-35.

توسيع المبادئ التي وصفها Caspar and Klug ، Ganser et al. اقتراح نموذج مخروط الفوليرين لنواة فيروس نقص المناعة البشرية. أثبتوا فيما بعد نموذجهم باستخدام تقنية cryo-EM متقدمة تسمى cryotomography.

غانسر ، ب ك ، س. لي ، ف.ي.كليشكو ، ج.ت.فينش ، و دبليو آي سونكويست. "تجميع وتحليل النماذج المخروطية لنواة HIV-1." علم 283 (1999): 80-3.

Benjamin، J.، B.K Ganser-Pornillos، W.F Tivol، W.I Sundquist، and G.Jensen. "هيكل ثلاثي الأبعاد لجسيمات تشبه فيروسات HIV-1 بواسطة التصوير بالتبريد الإلكتروني." J مول بيول 346 (2005): 577-88.

طورت الفيروسات استراتيجيات مختلفة للحصول على أحماضها النووية في أصداف. عادةً ما تستخدم العاثيات غلافًا بروتينيًا مُشكلًا مسبقًا ، يُطلق عليه اسم procapsid ، حيث يتم ضخ جينوم الحمض النووي من خلال مجموعة من البروتينات تسمى portal و terminase. باستخدام ملاقط بصرية ، سميث وآخرون. أظهر أن أحد محركات التعبئة والتغليف قوي بشكل لا يصدق. تمتلك الفيروسات القهقرية آليات مختلفة تمامًا تعتمد على التفاعلات بين البنية الثانوية للحمض النووي الريبي والبروتينات التي تشكل الغلاف المحيط. تعد تفاعلات البروتين والحمض النووي هذه مكونًا أساسيًا للتجميع والتعبئة المتزامنة للفيروس القهقري وجينومه.

D'Souza ، V. ، و M.F. سامرز. "الأساس الهيكلي لتغليف الجينوم الخافت لفيروس مولوني مورين اللوكيميا." طبيعة سجية 431 ، لا. 7008 (2004): 586-90.

سميث ، دي إي ، إس جيه تانس ، إس بي سميث ، إس.جرايمز ، دي إل أندرسون ، سي بوستامانتي. "يمكن لمحرك البوابة phi29 المستقيم للبكتيريا أن يحزم الحمض النووي ضد قوة داخلية كبيرة." طبيعة سجية 413 (2001): 748-52.

التعرف على الفيروسات وإرفاقها

الخطوة الأولى في العدوى الفيروسية هي التعرف على الخلية المضيفة والارتباط بها. تستخدم البكتيريا P22 بروتينًا يشبه الذيل يتعرف بشكل خاص على عديدات السكاريد الدهنية ويشقها على سطح مضيفه ، السالمونيلا تيفيموريوم ، مما يمكّنه من "الحفر" على سطح الخلية. حدد شتاينباكر وزملاؤه بنية البروتين المعقدة مع ركائزه ، وكشفوا عن الأساس الجزيئي للخصوصية. يتم ربط فيروسات حمى الضنك بطريقة أنيقة بنفس القدر. على عكس tailspike ، تخضع البروتينات التي تنجز هذه المهمة لعملية إعادة ترتيب هيكلية كبيرة عند التفاعل مع المضيف. تؤدي إعادة هيكلة البروتين إلى اندماج الغشاء ، وهي خطوة حاسمة في عملية العدوى.

موديس ، واي. ، إس أوغاتا ، دي كليمنتس ، إس سي هاريسون. "هيكل بروتين مغلف فيروس حمى الضنك بعد اندماج الغشاء." طبيعة سجية 427 ، لا. 6972 (2004): 313-9.

Steinbacher، S.، U. Baxa، S. Miller، A. Weintraub، R. Seckler، and R. Huber. "التركيب البلوري لبروتين P22 tailspike معقد مع Salmonella sp. O- مستقبلات المستضد." Proc Natl Acad Sci U S A 93 ، لا. 20 (1996): 10584-8.

بمجرد أن تلتصق الفيروسات بمضيفيها ، يجب أن تحصل على حمضها النووي داخل الخلية. مرة أخرى ، طورت الفيروسات حلولًا متنوعة جدًا لهذه المشكلة. يستخدم فيروس شلل الأطفال ، وهو فيروس بيكورنا ، ببتيدًا يرتبط بالأغشية ويحث الخلية على استيعاب الجسيمات من خلال مسار الالتقام الخلوي. تقوم البكتيريا T4 بدلاً من ذلك بإنشاء قناة عبر أغشية مضيفها وتطلق الحمض النووي الخاص بها في الخلية. استخدم Petr Leiman وزملاؤه تقنية cryo-EM للكشف عن التغييرات الهيكلية الملحوظة التي تصاحب المركبات البروتينية في ذيل T4 التي تحقق هذا العمل الفذ.

Bubeck، D.، D.J Filman، N. Cheng، A.C Steven، J.M Hogle، and D.M Belnap. "إن بنية دخول خلية فيروس شلل الأطفال 135S الوسيطة بدقة 10 أنجستروم تكشف عن موقع بولي ببتيد خارجي يرتبط بالأغشية." ياء فيرول 79 ، لا. 12 (2005): 7745-55.

ليمان ، بي جي ، بي آر تشيبمان ، ف.أ.كوستيوتشينكو ، في في. ميسيانزينوف ، وم. ج. روسمان. "إعادة ترتيب ثلاثية الأبعاد للبروتينات في ذيل العاثية T4 عند إصابة مضيفها". زنزانة 118 ، لا. 4 (2004): 419-29.

تراكيب الفيروس في الخلية

الفيروسات عبارة عن محمل جزيئي مستقل وستستخدم أي مسارات خلوية ممكنة. يتطلب بروتين T4 كابسيد وجود وصي ليتم طيه ، لكن المرافق المضيف صغير جدًا. كيف تتعامل T4 مع هذه المشكلة؟ يحتوي على جين يقوم بترميز غطاء مرافق يتفاعل مع المضيف المضيف ، مما يخلق مساحة أكبر لتناسب بروتين T4 كابسيد من أجل الطي. يستخدم فيروس حمى الخنازير الأفريقية آلية خلوية غير مفهومة جيدًا للمساعدة في طي وتجميع كبسولاته: aggresome. يُعتقد أنها آلية خلوية للتعامل مع البروتينات غير المطوية ، يتم تحفيز هذه الهياكل داخل الخلايا أثناء الإصابة بـ ASFV وهي مواقع تجميع القفيصة.

باكيس ، بي جيه ، بي دبليو فابر ، إتش فان هيريكويزين ، إس إم فان دير فيس. "إن cochaperonin المشفر T4 ، gp31 ، له خصائص فريدة تفسر متطلباته لطي البروتين الرئيسي T4 كابسيد." Proc Natl Acad Sci U S A 102 ، لا. 23 (2005): 8144-9.

هيث ، سي إم ، إم وندسور ، وتي ويلمان. "Aggresomes يشبه المواقع المتخصصة لتجميع الفيروسات." J خلية بيول 153 ، لا. 3 (2001): 449-55.

بمجرد أن يتجمع الفيروس داخل الخلية ، يجب أن يخرج. تمتلك البكتيريا نظامًا بسيطًا ولكن قويًا لفك مضيفها ، مما يؤدي حرفيًا إلى انفجارها. يحتوي هذا النظام على آلية تحكم مدمجة تتيح التوقيت الفعال للتحلل. يبدو أن فيروس نقص المناعة البشرية يستغل مسارًا خلويًا لم يكن مفهومًا جيدًا في السابق للتبرعم من الخلايا. فون شويدلر وآخرون. استخدام علم الوراثة لتحديد أكثر من عشرين لاعب بروتين في هذا المسار المعقد للغاية.

غراندلينج ، أ ، دي إل سميث ، يو بلاسي ، ور. يونغ. "Dimerization بين مثبط holin و holin لعاثيات لامدا". J باكتيريول 182 ، لا. 21 (2000): 6075-81.

von Schwedler ، UK ، M. Stuchell ، B. Muller ، DM Ward ، HY Chung ، E. Morita ، HE Wang ، T. Davis ، GP He ، DM Cimbora ، A. Scott ، HG Krausslich ، J. Kaplan ، SG Morham ، و WI Sundquist. "شبكة بروتين فيروس نقص المناعة البشرية في مهدها." زنزانة 114 ، لا. 6 (2003): 701-13.

فيروس نقص المناعة البشرية

بتجميع ما تعلمناه عن بنية الفيروس وتجميعه ، سنناقش المركبات المضادة للفيروسات لفيروس نقص المناعة البشرية في ضوء آلياتها. كانت مثبطات الاندماج الفيروسي ذات يوم علاجًا واعدًا مضادًا لفيروس نقص المناعة البشرية. لكن فيروس نقص المناعة البشرية طور مقاومة بسرعة ، ويُفهم أساس هذه المقاومة من حيث بنية البروتين الذي تحور ، gp41. Sticht et al. تقرير ببتيد واعد مضاد للفيروسات يمنع تجميع قفيصة فيروس نقص المناعة البشرية.

بالدوين ، سي إي ، آر دبليو ساندرز ، واي دينج ، إس جوريانز ، جي إم لانج ، إم لو ، وبيرخوت. "ظهور نوع فيروس نقص المناعة البشرية المعتمد على الأدوية من النوع 1 أثناء العلاج بمثبط الاندماج T20." ياء فيرول 78 ، لا. 22 (2004): 12428-37.

ستيخت ، جيه ، إم هامبرت ، إس فيندلو ، جيه بودم ، بي مولر ، يو ديتريش ، جيه فيرنر ، و إتش جي كراوسليش. "مثبط ببتيد لتجميع HIV-1 في المختبر." نات هيكل مول بيول 12 ، لا. 8 (2005): 671-7.

يوم المشروع: النظر في هياكل الفيروسات ثلاثية الأبعاد

يعد التلاعب البصري للجزيئات الحيوية ثلاثية الأبعاد أداة مهمة لعلماء الأحياء الهيكلية. سنقضي فترة الفصل هذه في التعرف على برامج مستوى البحث التي تسمح لنا بتدوير الجزيئات ومعالجتها وعرضها في ثلاثة أبعاد ، وسنلقي نظرة على المستوى الجزيئي على بعض البروتينات الفيروسية التي تمت مناقشتها خلال الفصل الدراسي.

الفيروسات هي في الأساس آلات بيولوجية. إن التحكم الجيني في هياكلها ، إلى جانب الدقة التي تتجمع بها هذه الهياكل ذاتيًا ، يجعل الفيروسات منصات مثالية لتطوير المواد والأسطح على نطاق النانو.

ماو ، سي ، دي جيه سوليس ، بي دي ريس ، إس تي كوتمان ، آر واي سويني ، إيه هايهورست ، جي جورجيو ، بي إيفرسون ، إيه إم بيلشر. "مجموعة أدوات تعتمد على الفيروسات للتوليف الموجه للأسلاك النانوية المغناطيسية وشبه الموصلة." علم 303 ، لا. 5655 (2004): 213-7.

مونيير ، إس ، إي سترابل ، إم جي فين. "التشابك والاقتران مع البروتينات القفيصة الفيروسية عن طريق أكسدة التيروزين." تشيم بيول 11 ، لا. 3 (2004): 319-26.


أساليب

البروتينات والحمض النووي المؤتلف

تم وصف استنساخ بروتين غلاف PP7 والإفراط في التعبير عنه وتنقيته بالتفصيل في مكان آخر. لإنشاء ثنائى PP7 أحادي السلسلة ، تم تضخيم تسلسل الغلاف من pP7CT مع Pfu DNA polymerase و 3'-Primer مكمل لتسلسلات ناقلات البلازميد وبادئ 5'-CCCCCGCCGTTATGGGCAAAACCATCGTTCTTTCGGTC-3 '. قدم هذا Bgl لقد قمت بالموقع بالقرب من الطرف الخامس لما سيكون النسخة النهائية لتسلسل ترميز بروتين الغلاف. تم ضم هذا لاحقًا إلى حدث طبيعي Bgl أنا موقع بالقرب من الطرف 3'-نهاية النسخة الأولية في pP7CT لإنشاء تسلسل الوصلات الموضح في الشكل 3. تم استنساخ التسلسل المكرر الآن بين Xba انا و بام مرحبًا في pET3d للإفراط في التعبير بتنسيق بكتريا قولونية. أدت هذه التلاعبات إلى الازدواجية والاندماج الانتقالي للتسلسلتين ، مع ارتباط آخر حمض أميني من النسخة الأولية (أرجينين) بالحمض الأميني الثاني (سيرين) للنسخة النهائية من خلال رابط ثنائي الأحماض الأمينية (tyr-gly) .

فحص من أجل الاستقرار الحراري

تم تحديد الثبات الحراري للجسيمات الشبيهة بالفيروس في ظل ظروف مختلفة بطريقتين. في الأول تم إنتاج "ملف تعريف انصهار" عن طريق تسخين 25 عينة من جزيئات PP7 الشبيهة بالفيروس بتركيز 1.0 مجم / مل في 50 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.5 ، و 100 ملي كلوريد الصوديوم لمدة دقيقتين. في درجات حرارة محددة. عندما احتوى التفاعل على DTT ، كان موجودًا بتركيز 10 ملي مولار. في نهاية فترة الحضانة ، تم تبريد العينات على الجليد ثم تعريضها للطرد المركزي عند 13000 دورة في الدقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق IEC MicroMax لمدة 5 دقائق. تمت إزالة المواد الطافية من هذه العينات ، والتي تحتوي على جزء من البروتين الذي ظل قابلاً للذوبان بعد المعالجة الحرارية ، إلى أنبوب جديد. تمت إعادة تذويب البروتينات غير القابلة للذوبان في الحبيبات في 6 م يوريا. تم إجراء قياسات للكميات النسبية للبروتين القابل للذوبان وغير القابل للذوبان بواسطة اختبار برادفورد [24]. تم إنتاج المنحنيات القياسية باستخدام ليسوزيم الدجاج كمعيار وكانت خطية على مدى الفحص. لقياس كمية الكبسولات المتبقية بعد المعالجة الحرارية ، تم تطبيق البروتين القابل للذوبان على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ في 40 ملي أسيتات تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 2 ملي مولار من EDTA ، وتعرض للرحلان الكهربائي. تم تلطيخ الجل بعد ذلك ببروميد إيثيديوم وتم تصويره تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية لتصور VLPs المحتوية على الحمض النووي الريبي. كان البروتين ملطخًا بـ coomassie الأزرق اللامع R250. تم مسح الجل باستخدام مقياس كثافة وتم تحديد كمية البروتين في النطاقات الفردية بالمقارنة مع منحنى قياسي تم إنتاجه عن طريق تطبيق تخفيف كمية معروفة من جزيئات PP7 الشبيهة بالفيروس على نفس الهلام. كان المنحنى القياسي خطيًا عبر النطاق المستخدم في الفحص.

تم تحديد معدلات التمسخ عن طريق احتضان البروتينات في 50 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.5 ، و 100 ملي كلوريد الصوديوم ، مع أو بدون DTT عند 10 ملي مولار عند درجات حرارة محددة. في النقاط الزمنية تم إخماد التفاعلات على الجليد ثم تحليل محتواها من القفيصات والبروتين القابل للذوبان وغير القابل للذوبان كما هو موضح أعلاه.

تنقية الثنائيات

تم تحضين عشرة ملليغرام من PP7 أو 2PP7 VLPs المنقى كما هو موصوف سابقًا لمدة 60 دقيقة في 1 مل من 50 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.5 ، 6 م يوريا ، 10 ملي مولار DTT على الجليد. تم غسيل البروتين الناتج مقابل 10 ملي مولار من حامض الخليك ، و 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم (حوالي الرقم الهيدروجيني 4) ثم تم وضعه على عمود 0.9 × 45 سم من Sephadex G75 وتم التصفية في نفس المخزن المؤقت. تم جمع أجزاء من 0.7 مل. ظهرت قمتان في الكروماتوجرام. يُظهر الرحلان الكهربائي للهلام Agarose أن القمة الأولى تتكون من VLPs التي فشلت في التفكيك. الآخر ، الذي يتم فصله عند الكسر 20 ، يمثل على ما يبدو ثنائيات بروتين الغلاف. في تجربة منفصلة لألبومين المصل البقري (MW = 68000) ، تم تطبيق ألبومين البيض (MW = 45000) ، كيموتربسينوجين (MW = 25700) وليزوزيم (MW = 14400) على العمود كمعايير للوزن الجزيئي. أسفرت البروتينات القياسية عن مخطط خطي لموضع الشطف مقابل الوزن الجزيئي اللوغاريتمي. لاحظ أنه تم حذف مساحة سطح الجسم من هذا التحليل لأنه تمت إزالته في حجم الفراغ أو بالقرب منه. تشير المقارنة مع سلوك الشطف للمعايير إلى أن ذروة بروتين الغلاف الثاني لها وزن جزيئي يبلغ حوالي 32000 ، وهو حجم يتوافق تقريبًا مع الوزن الجزيئي المتوقع لحوالي 28000 لثنائي بروتين الغلاف. تم استخدام البروتين من كسور الذروة في في المختبر ردود فعل التجميع.

في المختبر تجميع VLP

تمت إضافة بروتين غلاف PP7 المنقى (0.1 نانومول) إلى التفاعلات التي تحتوي على 50 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.5 وخميرة الحمض الريبي النووي النقال ، أو عامل التحويل MS2 ، أو RNA المشغل الانتقالي PP7 بكميات متفاوتة بالتخفيف التسلسلي مرتين من 0.1 نانومول إلى 6.3 ميكرولتر. . بعد 30 دقيقة ، تمت إضافة الجلسرين وأزرق البروموفينول وتعرضت التفاعلات لفرز كهربائي في هلام الاغاروز بنسبة 1٪. تم تصور الحمض النووي الريبي من خلال تلطيخ المواد الهلامية ببروميد إيثيديوم متبوعًا بالتصوير على جهاز ترانسيلومينيتور للأشعة فوق البنفسجية. تم إنتاج RNAs للمشغل متعدية MS2 و PP7 عن طريق النسخ في المختبر كما هو موضح سابقًا [26]. في بعض الحالات ، تم تصنيع RNAs في وجود 32 نيوكليوتيد مسمى P ويمكن تصورها وتحديد كميتها بعد تعرض الجل لشاشة Packard Cyclone phosphorimager. لتصور البروتينات ، كانت المواد الهلامية ملطخة بـ coomassie الأزرق اللامع R250.


في المختبر خصائص التجميع للبروتينات الكبسيدية المنقاة من البكتيريا المعبر عنها لفيروس نقص المناعة البشرية

إن بروتين الكمامة في الفيروسات القهقرية كافٍ لتجميع وتبرعم الجسيمات الشبيهة بالفيروس من الخلية المضيفة. في حالة فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، يحتوي Gag على مصفوفة المجالات ، و capsid (CA) ، و nucleocapsid (NC) و p6 التي يتم فصلها عن طريق البروتينات الفيروسية داخل الفيروس الناشئ ، مما يؤدي إلى النضج المورفولوجي لإنتاج فيروس معدي. في الفيروس الناضج ، تشكل CA قفيصة تحيط بنواة البروتين النووي المكونة من NC و RNA الجينومي. لتحديد متطلبات تجميع الجسيمات والمساهمات الوظيفية للمجالات الفردية ، عبرنا عن مجالات فيروس نقص المناعة البشرية الإشريكية القولونية وتنقية المنتجات إلى درجة قريبة من التجانس. في المختبر أسفر تجميع CA ، مع أو بدون ببتيد المباعد المجاور لـ C ، عن هياكل أنبوبية يبلغ قطرها حوالي 55 نانومتر وطول غير متجانس. يتطلب تكوين الجسيمات الفعال تركيزًا عاليًا للبروتين وملحًا عاليًا ودرجة حموضة قلوية متعادلة. فى المقابل، في المختبر حدث تجميع CA-NC بتركيز بروتين أقل بمقدار 20 ضعفًا وبملح منخفض ، ولكنه تطلب إضافة RNA. تشير هذه النتائج إلى أن التفاعلات الكارهة للماء لبروتينات القفيصة كافية لتكوين الجسيمات بينما قد يركز مجال القابسيد النوكلي المرتبط بالـ RNA ومحاذاة البروتينات الهيكلية على الجينوم الفيروسي.


الملخص

لوحظ تخليق كمية صغيرة من 42S RNA بالإضافة إلى أنواع mRNA الخاصة بـ VSV في نظام ترجمة-نسخ مقترن يحتوي على جزيئات بروتين نووي من الخلية L المصابة بفيروس التهاب الفم الحويصلي ومستخلص ريبوزومي معالج بالنوكلياز تم الحصول عليه من خلايا هيلا غير المصابة. أظهر التحليل على تدرج كثافة CsCl أن الحمض النووي الريبي 42S المركب كان مرتبطًا ببروتين N المركب حديثًا كبروتين نووي بكثافة نباتية تبلغ 1.3 جم / مل. كان الحمض النووي الريبي 42S والبروتين N الموجودان في البروتين النووي مقاومًا للنيوكلياز والبروتياز ، على التوالي. حوالي 35 ٪ من الحمض النووي الريبي 42S المركب لها نفس القطبية مثل RNA الجينومي VSV والنسبة المتبقية البالغة 65 ٪ لها قطبية تكميلية. يوضح الدليل المقدم هنا أن كلا من الجينوم كامل الطول والحمض النووي الريبي التكميلي يرتبطان ببروتين N في عملية النسخ المتماثل في المختبر. يُقترح أيضًا دور قالب لـ 42S RNA التكميلي لتكرار الحمض النووي الريبي الجينومي.


مقدمة

ال في المختبر بناء الريبوسومات هو موضوع الاهتمام المتزايد بسرعة في النظم والبيولوجيا التركيبية. تهدف هذه الاهتمامات إلى توضيح المبادئ العامة التي تكمن وراء تشغيل وتجميع جهاز الترجمة (Nierhaus، 1990 Erlacher وآخرون، 2011 Polacek ، 2011) ، وتصميم وبناء الحد الأدنى من الخلايا لفهم أصول الحياة (Forster and Church ، 2006 Jewett and Forster ، 2010) ، وتمكين في المختبر التطور لانتقاء الريبوسومات التي لها وظائف معززة أو خواص كيميائية غيرت (Cochella and Green ، 2004 Wang وآخرون، 2007 نيومان وآخرون، 2010). لتحقيق هذه الأهداف ، وطرق في المختبر هناك حاجة لتخليق الريبوسوم.

في المختبر التجمع ، أو إعادة ، من الإشريكية القولونية الريبوسومات من مكونات الريبوسوم الأصلية النقية إلى وحدات فرعية صغيرة نشطة وظيفيًا (30S) وكبيرة (50S) تم تحقيقها لأول مرة في أعمال رائدة منذ 40 عامًا. يتضمن بروتوكول إعادة تكوين الوحدة الفرعية التقليدية 30S حضانة من خطوة واحدة عند 20 ملي Mg 2+ و 40 درجة مئوية (Traub and Nomura ، 1968) ، ويمكن تسهيلها في درجات حرارة منخفضة بواسطة المرافقين (Maki and Culver ، 2005). يتضمن بروتوكول إعادة تكوين الوحدة الفرعية التقليدي 50S حضانة غير فسيولوجية ذات درجة حرارة عالية من خطوتين ، أولاً عند 4 ملي ميغاغرام 2+ و 44 درجة مئوية ، ثم عند 20 ملي ميغاغرام 2+ و 50 درجة مئوية (Nierhaus and Dohme ، 1974).

في حين كشفت الدراسات التي تستخدم نهج إعادة التكوين التقليدي عن العديد من الأفكار المهمة حول تجميع الريبوسوم (Nierhaus ، 1990) ، فإن أوجه القصور في إعادة التكوين تجعل بناء وتحليل المتغيرات الهندسية أمرًا صعبًا (Semrad and Green ، 2002). على سبيل المثال ، الوحدات الفرعية 50S المعاد تشكيلها تقليديًا المصنوعة من في المختبر-النسخة 23S rRNA (التي تفتقر إلى التعديلات التي تحدث بشكل طبيعي بعد النسخ) تكون أقل كفاءة في إعادة التشكيل تصل إلى 10000 مرة من تلك التي تستخدم 23S rRNA الناضج كما تم قياسه بواسطة تفاعل الجزء ، حيث يتم تشكيل روابط الببتيد المفردة على وحدات فرعية معزولة 50S (Semrad و جرين ، 2002). علاوة على ذلك ، فإن الظروف غير الفسيولوجية المكونة من خطوتين لتجميع 50S تمنع اقتران تخليق الريبوسوم وتجميعه في نظام واحد متكامل.

على عكس المخططات السابقة ، كنا نهدف إلى تطوير طريقة متكاملة للتجميع الفسيولوجي لـ بكتريا قولونية الريبوسومات ، حيث تتجمع الريبوسومات منها في المختبر-نسخ الرنا الريباسي ثم إجراء تخليق البروتين في نفس الحجرة (المربع 1). يحاكي هذا النهج النسخ المشترك للرنا الريباسي وتجميع الريبوسوم عند حدوثه في الجسم الحي (تالكينجتون وآخرون، 2005 مولدر وآخرون، 2010). علاوة على ذلك ، فهو يتماشى مع مبدأ إرشادي عام في البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا ، ألا وهو أن التقليد السيتوبلازمي يوفر مزايا لإعادة إنتاج السلوك الشبيه بالخلية (Jewett وآخرون، 2008 Hodgman and Jewett ، 2012). نوضح هنا طريقتنا الجديدة لتخليق الرنا الريباسي المتكامل ، وتجميع الريبوسوم ، و t ranslation ، والتي تسمى iSAT (المربع 1). بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يمكن استخدام iSAT لصنع ريبوسوم معدل بكفاءة ومقاومة عالية للمضاد الحيوي الكليندامايسين في خطوة واحدة. بالرغم ان Bacillus stearothermophilus (جرين ونولر ، 1999) و ثيرموس أكواتيكوس (خايتوفيتش وآخرون، 1999 إرلاتشر وآخرون، 2011) لديها ريبوسومات نشطة للغاية أعيد تكوينها من في المختبر-نسخ 23S rRNA تفتقر إلى التعديلات ، ونحن نركز عليها بكتريا قولونية الريبوسومات لأن جهاز الترجمة بكتريا قولونية هو الأفضل فهمًا والأكثر تميزًا من الناحية الكيميائية الحيوية والوراثية (Forster and Church ، 2006 Jewett and Forster ، 2010).


تجميع فيروسات المختبر - علم الأحياء

لقطة بيانات تجريبية

  • الطريقة: & nbspمجهر الكتروني
  • القرار: نبسب3.30 نبسب وأرينج
  • حالة التجميع: & nbspصفيف حلزوني & نبسب
  • طريقة إعادة الإعمار: & nbspحلزونية ونبسب

التحقق من صحة wwPDBونبسب ونبسبتقرير ثلاثي الأبعاد وتقرير كامل

توفر هياكل التجميع والبرودة EM للنيوكليوكابسيدات الخاصة بفيروس الحصبة RNA رؤية آلية في تكاثر الفيروسة المخاطانية.

(2019) Proc Natl Acad Sci U S A & nbsp116: 4256-4264

  • PubMed: & nbsp30787192 & nbsp ابحث في PubMedSearch على PubMed Central
  • DOI: & nbsp10.1073 / pnas.1816417116
  • الاقتباس الأساسي من الهياكل ذات الصلة: & nbsp
    6H5Q ، 6H5S
  • ملخص PubMed: & nbsp

يعد تجميع nucleocapsids paryxoviral على جينوم الحمض النووي الريبي (RNA) خطوة أساسية في الدورة الفيروسية. ظل الأساس الهيكلي لهذه العملية غامضًا بسبب عدم القدرة على التحكم في التغليف. استخدمنا نهجًا تم تطويره مؤخرًا لتجميع الجزيئات الشبيهة بالنيوكليوكابسيد لفيروس الحصبة على تسلسلات محددة من سداسيات الحمض النووي الريبي (متعدد الأدينين والجينوم الفيروسي 5 ') في المختبر ، وحددنا خرائط الفحص المجهري للإلكترون البارد إلى 3.

يعد تجميع nucleocapsids paryxoviral على جينوم الحمض النووي الريبي (RNA) خطوة أساسية في الدورة الفيروسية. ظل الأساس الهيكلي لهذه العملية غامضًا بسبب عدم القدرة على التحكم في التغليف. استخدمنا نهجًا تم تطويره مؤخرًا لتجميع الجسيمات الشبيهة بالنيوكليوكابسيد لفيروس الحصبة على متواليات محددة من سداسيات الحمض النووي الريبي (متعدد الأدينين والجينوم الفيروسي 5 ') في المختبر ، وحددنا خرائط الفحص المجهري للإلكترون البارد بدقة 3.3-. تحدد الهياكل بشكل لا لبس فيه مواقع الربط 5 'و 3' وبالتالي السجل الملزم لـ RNA الجينومي الفيروسي داخل nucleocapsids. تكشف هذه الملاحظة أن الطرف الثالث من الجينوم مكشوف إلى حد كبير في نوكليوكابسيدات الحصبة المجمعة بالكامل. على وجه الخصوص ، يتم توفير النوكليوتيدات الثلاثة الأخيرة للجينوم في متناول مجمع بوليميراز RNA المعتمد على RNA ، مما قد يمكّن من معالجة RNA بكفاءة. تكشف الهياكل أيضًا عن تغييرات توافقية محلية وعالمية في البروتين النووي عند التجميع ، ولا سيما بما في ذلك الحلزون α6 واللولب α13 اللذان يشكلان حواف أخدود ربط الحمض النووي الريبي. لوحظ اضطراب في الحمض النووي الريبي المنضم ، المترجمة في أحد موقعي التبديل المطابق للعمود الفقري. سمح لنا الهيكل عالي الدقة بتحديد مواقع تفاعل القاعدة النووية المفترضة في أخدود ربط الحمض النووي الريبي ، والذي تم قياس تأثيره على حركيات التجميع باستخدام الرنين المغناطيسي النووي في الوقت الحقيقي. إن تحور أحد هذه المواقع ، R195 ، الذي تعمل سلسلته الجانبية على تثبيت كل من العمود الفقري والقاعدة لحمض نووي مرتبط ، يُظهر أنه ضروري لتجميع الجسيمات الشبيهة بالنيوكليوكابسيد.


شاهد الفيديو: عينة يوميا تفحص في المختبر الإقليمي بمكة (شهر فبراير 2023).