معلومة

8.1: تحلل الخلايا - علم الأحياء

8.1: تحلل الخلايا - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

المصدر: BiochemFFA_8_1.pdf. الكتاب الدراسي بأكمله متاح مجانًا من المؤلفين على http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

لفصل المركبات عن البيئات الخلوية ، يجب على المرء أولاً فتح (ليس) الخلايا. هناك عدة طرق لتحقيق ذلك.

  • الصدمة التناضحية والإنزيمات: تتمثل إحدى طرق تحليل الخلايا في خفض القوة الأيونية للوسط الذي توجد فيه الخلايا. وهذا يمكن أن يتسبب في تضخم الخلايا وانفجارها. يمكن استخدام المواد الخافضة للتوتر السطحي المعتدلة لتعطيل الأغشية. تقاوم معظم البكتيريا والخميرة والأنسجة النباتية الصدمات التناضحية ، بسبب وجود جدران الخلايا ، وعادة ما تكون هناك حاجة لتقنيات تعطيل أقوى. قد تكون الإنزيمات مفيدة في المساعدة على تحطيم جدران الخلايا. الليزوزيم ، على سبيل المثال ، مفيد جدًا في تحطيم الجدران البكتيرية. تشمل الإنزيمات الأخرى المستخدمة بشكل شائع السليولاز (النباتات) والبروتياز والماناس وغيرها.
  • اضطراب ميكانيكي: يمكن استخدام التحريض الميكانيكي على شكل خرز تهتز بمزيج من الخلايا. في هذه الطريقة ، يتم قصف الخلايا بحبيبات زجاجية صغيرة تفتحها. توفر الموجات الصوتية (20-50 كيلو هرتز) نوعًا بديلاً من الإثارة التي يمكن أن تكون فعالة. ومع ذلك ، فإن الطريقة صاخبة وتولد حرارة يمكن أن تكون مشكلة للمركبات الحساسة للحرارة.
  • اضطراب الضغط: من الوسائل الأخرى لتعطيل الخلايا استخدام "قنبلة الخلية". في هذه الطريقة ، يتم وضع الخلايا تحت ضغط مرتفع جدًا (يصل إلى 25000 رطل / بوصة مربعة) ثم يتم تحرير الضغط بسرعة. يتسبب التغيير السريع في الضغط في إطلاق الغازات المذابة في الخلايا على شكل فقاعات والتي بدورها تكسر الخلايا.
  • التثليج بالتبريد: غالبًا ما يتم استخدام التثليج بالتبريد للعينات التي تحتوي على مصفوفة صلبة خارج الخلية ، مثل النسيج الضام والبذور والغضاريف. في هذه التقنية ، يتم تجميد الأنسجة باستخدام النيتروجين السائل ثم يتم إجراء عملية السحق بالصدمة (عادةً ، الطحن ، باستخدام ملاط ​​ومدقة أو مطحنة كهربائية قوية). ثم يتم تعليق المسحوق الذي تم الحصول عليه في المخزن المؤقت المناسب.

مهما كانت الطريقة المستخدمة لإنشاء محللة ، يجب معالجة الكسور الخام التي يتم الحصول عليها منها عن طريق التجزئة.


طرق المختبر في بيولوجيا الخلية

براندون إل ميلر. وليام ج.لوري ، في طرق في بيولوجيا الخلية ، 2012

5.2 الخطوة 2 - خلايا الدم الحمراء ليس باستخدام محلول العازلة

ملخصخلايا الدم الحمراء ليز عن طريق إضافة الدم الكامل إلى أنابيب تحتوي على محلول عازلة.
مدة15 دقيقة.
إجراء
2.1تحضير أنابيب تحلل عن طريق إضافة 42.5 مل ماء و 5 مل محلول مخزون عازلة تحلل لكل أنبوب 50 مل.
نصيحة: أنبوب واحد يمكن أن يصل إلى 2.5 مل من الدم. لمزيد من الدم ، قم بإعداد أنابيب إضافية.
2.2أضف ما يصل إلى 2.5 مل من الدم إلى كل من الأنابيب التي تم تحضيرها في الخطوة السابقة.
2.3قم بسد الأنابيب واخلطها عن طريق قلب كل أنبوب عدة مرات.
2.4احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
2.5أنابيب الطرد المركزي عند 350ز لمدة 5 دقائق. تجاهل المادة طافية.
نصيحةيمكن تكرار الخطوة 2 ، إذا لزم الأمر ، لمزيد من خلايا الدم الحمراء المتبقية. ومع ذلك ، فإن استعادة الخلايا المنواة سوف تتأثر أيضًا. بشكل عام ليس مطلوبًا ، ولا يوصى به ، لإجراء أكثر من خطوتين تحلل.

انظر الشكل 3 للحصول على مخطط انسيابي للخطوة 2.

الشكل 3. مخطط انسيابي للخطوة 2.


مقدمة

تم إجراء تنميط التعبير الجيني تقليديًا على عينات كبيرة نوعًا ما تحتوي على الكثير من المواد. ومع ذلك ، تحتوي الأنسجة على العديد من أنواع الخلايا التي تستجيب بشكل مختلف للمنبهات والتغيرات البيئية ، مما يعقد التفسير. تم الخلط بين العديد من الدراسات بسبب عدم التجانس الجوهري للعينات البيولوجية. من خلال تحليل الخلية الواحدة ، يتم التخلص من هذا التعقيد ويمكن دراسة الاستجابة الحقيقية لكل نوع من الخلايا (1 ، 2). أظهرت دراسات التنميط أحادية الخلية الحديثة تباينًا كبيرًا في مستويات النسخ بين الخلايا الفردية في مجموعات خلايا متجانسة على ما يبدو وكشفت عن مجموعات سكانية فرعية غير معروفة سابقًا (3 ، 4). من الواضح أن تحليل الخلايا الفردية يفتح أمام إمكانيات جديدة لدراسة العمليات البيولوجية مثل انتقالات الخلايا ، والإشارات ، والتمايز ، والتكاثر (5 ، 6).

PCR في الوقت الحقيقي الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) هو المعيار الذهبي لتنميط التعبير الجيني (7 ، 8). من خلال تنفيذ المبادئ التوجيهية & # x0201Cminimum information for نشر تجارب RT-qPCR & # x0201D (MIQE) ، أصبحت التقنية قوية وموثوقة (9). عادة ما يتم تحليل العينات المكونة من مئات الآلاف من الخلايا. يتم تحليل هذه العينات بعوامل تشوهية قوية تطلق الأحماض النووية وتحميها ، والتي يتم تنقيتها بعد ذلك باستخدام بروتوكولات تزيل الملوثات والمواد التي قد تتداخل مع RT-qPCR المصب (10 ، 11). من الشائع في هذه الطرق أنها تتضمن خطوة أو أكثر من خطوات الغسيل التي تؤدي إلى الفقد. أثناء الكتابة ، يتزايد فهرس أنواع الحمض النووي الريبي المعروفة ، مما يؤدي إلى زيادة التقدير للوظائف البيولوجية العديدة التي يقوم بها الحمض النووي الريبي (12). تحتوي الخلية المفردة النموذجية على عدد قليل من النسخ النصية لمعظم الجينات. تشير بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الحديثة إلى وجود حوالي 22000 mRNAs في خلية جذعية جنينية لفأر وحوالي 505000 mRNAs في خلايا ليفية جنينية لفأر. توجد أفضل ألف نسخة في 1.4 & # x020132709 جزيء لكل خلية جذعية و 77 & # x020137044 جزيء لكل خلية ليفية (13 ، 14). من الواضح أنه عند تحليل الخلايا المفردة ، فإن أي خسارة أثناء الاستخراج ناتجة عن الغسل يمكن أن تؤدي إلى عدم يقين خطير وحتى فقدان كامل لبعض النصوص. ومن ثم ، فإن بروتوكولات التنقية الكلاسيكية القائمة على الغسيل ليست مناسبة لتحليل الخلية الواحدة (15 ، 16). يوفر البروتوكول الذي يعتمد على وسيط التحلل الذي يعطل غشاء الخلية ، ويجعل الحمض النووي الريبي متاحًا لـ RT ويحافظ على سلامة الحمض النووي الريبي دون تثبيط التفاعلات الأنزيمية النهائية ، مزايا كبيرة في التنميط الكمي للتعبير الجيني أحادي الخلية.

في هذا العمل نقوم بدراسة المحاليل التحليلية المناسبة للعينات الصغيرة (1 & # x020131000 خلية) ولا تتطلب الغسيل. نقوم باختبار العديد من عوامل التحلل المستخدمة اليوم ، لمقارنة عائد التحلل ، والتكاثر ، واستقرار الحمض النووي الريبي. يعد التأثير على معالجة العينة بعد تحلل الخلية معلمة أخرى مهمة يجب مراعاتها ، نظرًا لأن الوقت من جمع الخلايا إلى التخزين يمكن أن يختلف من دقيقة إلى ساعات. نقارن أيضًا حساسية تحلل الخلايا المباشر ببروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي التقليدية القائمة على العمود ، ونختبر عدد الخلايا التي يمكن تحليلها دون تثبيط المصب. لتقييم الغلة والتحقق من صحة عمليات التكاثر ، نستخدم طفرات الحمض النووي الريبي والحمض النووي (17).


نتائج

تحدد الخلايا المرجعية كعناصر تحكم في الارتفاع التلوث في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

لتقييم تأثير العلاجات الدوائية بشكل منهجي على جزر البنكرياس الأولية بدقة كمية خاصة بنوع الخلية ، قمنا بتعريض الجزر البشرية والفأرية السليمة إلى 10 ميكرومتر من مادة أرتيميثير ، و 100 ميكرومتر GABA ، ومثبط FoxO 1 ميكرومتر AS1842856 (FoxOi) ، والتحكم في DMSO من أجل 72 ساعة خارج الجسم الحي (الشكل 1 أ). بعد هذه الفترة ، قمنا بفصل الجزر ، وتصفيتها للخلايا المفردة ، وأجرينا تحليلًا للنسخة أحادية الخلية على منصة 10X Chromium. بعد المحاذاة ومراقبة الجودة الأولية ، حصلنا على ما مجموعه 142،165 ملفًا شخصيًا للنسخة.

تمكّن Spike-ins تقييم التلوث في تجارب scRNA-seq. أ علاج الجزر ومخطط تحضير العينة. ب التعبير (log TPM) عن الأنسولين والجلوكاجون في جميع خلايا الجزر المعالجة بـ DMSO من متبرعين بشريين الأول والثاني. تشير الخطوط الأفقية إلى تحولات الخلايا غير ألفا وغير بيتا من المستويات غير المعبرة. الخط الأحمر المنقط: التعبير الأساسي للخلايا غير الجزيرية كما ورد في أطلس الخلية البشرية (HCA). ج التعبير عن الأنسولين والجلوكاجون في مجموعات البيانات الخارجية. تم تحويل قيم TPM و RPKM المبلغ عنها في كل مجموعة بيانات. د محاذاة القراءات لكل من جينومات الإنسان والفأر لتحديد الخلايا المرجعية المرتفعة ، وهنا ارتفاعات الماوس في عينة بشرية (DMSO ، المتبرع الثاني). ه تلوث مسامير الفئران في العينات البشرية. يتم قياس التلوث كنسبة مئوية من القراءات المتوافقة مع الجينوم البشري في ارتفاعات الماوس. F ارتباط ملف التلوث داخل خلايا الفئران الشائكة في العينات البشرية. ز متوسط ​​التلوث في الفئران المسامير (ذ-محور) مقابل متوسط ​​التعبير في العينة (خلايا البنكرياس البشرية ، x-المحور) الموضح لعينة DMSO ، المتبرع البشري II. ارتباط سبيرمان ص = 0.888. ح متوسط ​​التعبير (سجل TPM) للجينات ذات الاختلاف الأكبر في ارتفاعات الماوس والبشر والمراجع الخارجية

عند تحليل النسخ البشرية الناتجة ، لاحظنا اختلافات مذهلة خاصة بالعينة في تعبير الجلوكاجون (GCG) والأنسولين (INS) عبر جميع أنواع الخلايا بين التكرارات (الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا مستويات عالية بشكل مدهش من التعبير لكل من GCG (3.0 ٪ و 6.1 ٪ من جميع القراءات في التكرارات الأولى والثانية ، على التوالي) و INS (6.5 ٪ و 4.5 ٪) في جميع الخلايا ، ولم تكن أي خلايا سلبية INS لوحظ (الشكل 1 ب). توجد أنماط مماثلة في معظم مجموعات بيانات scRNA-seq المنشورة المستندة إلى القطيرات لجزر البنكرياس (الشكل 1 ج). في المقابل ، تم الكشف عن مجموعات الخلايا السلبية الهرمونية في بعض دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي (scRNA-seq) بناءً على فرز الخلايا للآبار الفردية ، على الرغم من وجود مستويات يمكن اكتشافها في غالبية خلايا الجزيرة من كل من INS و GCG. يشير الاعتماد العالي للدراسة والجزء المنخفض من الخلايا أحادية الهرمون إلى التحيزات التقنية المحتملة في نتائج scRNA-seq.

يتم تقدير تضمين المعايير الداخلية على نطاق واسع لتقييم الجودة والتطبيع والمعايرة وتقدير البيانات التحليلية [53]. يجب أن يتم رفع هذه المعايير الداخلية في وقت مبكر أثناء سير عمل معالجة العينة ولها خصائص مشابهة للغاية ، ولكن يمكن تمييزها بوضوح للعينات التحليلية. بالنسبة للنسخ أحادية الخلية ، فإن المعايير الداخلية المثالية هي مجموعات خلايا متجانسة تتميز جيدًا. اخترنا استخدام سطرين خلويين ، الماوس 32D وخلايا Jurkat البشرية ، كمعايير داخلية ، وكلاهما تميزنا بـ RNA-seq. الخلايا الثابتة الميثانول (

5 ٪ من جميع الخلايا) في جميع العينات قبل وقت قصير من تكوين القطيرات ، وبالتالي قبل المعالجة والتسلسل وتحليلات المعلوماتية الحيوية كجزء من مجموعة البيانات بأكملها. وجدنا أن المسامير عبر الأنواع (هنا خلايا الماوس 32D) توفر نقاطًا مرجعية نظيفة بشكل خاص عند محاذاة جينوم مرجعي بشري / فأر مشترك ، لسببين. أولاً ، كان من السهل فصلها عن الخلايا الأخرى (هنا: جزيرة بشرية ومسامير) من خلال نسبة قراءة الإنسان / الماوس لكل خلية (الشكل 1 د والملف الإضافي 1: الشكل S1). ثانيًا ، قدم حساب عدد القراءات المتقاطعة (هنا: القراءات البشرية الموجودة في خلايا الماوس) طريقة مباشرة لتقييم التحيزات الخاصة بالعينة.

قياس التلوث كنسبة مئوية للقراءات التي تتماشى مع المرجع البشري في خلايا الفئران الشائكة (الشكل 1 هـ) ، لاحظنا مستوى تلوث مرتفع خاص بالعينة في كلتا العينتين (الوسيطان 8.1٪ و 17.4٪ في العينات المأخوذة من المتبرعون البشريون الأول والثاني ، على التوالي) بحد أقصى 19.9٪ في العينة الأولى. ومع ذلك ، كان ملف التلوث متشابهًا للغاية داخل خلايا كل عينة (الشكل 1 و). كان هذا التلوث البشري في ارتفاع الفئران مرتبطًا ارتباطًا وثيقًا بمتوسط ​​التعبير في الخلايا البشرية (الشكل 1 جم) ، مما يشير إلى أن التلوث مشتق بالفعل من الحمض النووي الريبي. لتحديد الجينات المصابة ، قمنا بعد ذلك بمقارنة ارتفاعات الفأر والبشر في عينات الجزر البشرية بالماوس والارتفاعات البشرية المتسلسلة في عزلة كمرجع خارجي ، وكلها تتماشى مع الجينوم البشري (الشكل 1 ح). أظهر كل من ارتفاعات الإنسان والفأر من عينات الجزيرة تعبيرًا قويًا عن جينات علامة الجزيرة الرئيسية مثل INS و GCG و TTR و SST و PPY و IAPP و REG1A. بالنظر إلى أن التعبير عن هذه الجينات كان غائبًا فعليًا عن الخلايا المرجعية ، يمكن أن يُعزى إلى التلوث.

من المحتمل أن يكون التلوث موجودًا في الوسط أو المخزن المؤقت الذي يتم تعليق الخلايا فيه ، في شكل RNA خالٍ من الخلايا ينشأ من الخلايا المحتضرة التي كانت محاطة بقطرات أثناء المعالجة. من المحتمل أن يحدث تحلل الخلية أثناء سير عمل النسخ أحادية الخلية أثناء حضانة تعليق الخلية مع المزيج الرئيسي الذي يوفر الكواشف لخطوة النسخ العكسي قبل توليد القطيرات. الأهم من ذلك ، استبعدت كل من الاعتبارات التجريبية والنظرية الفرضية البديلة القائلة بأن التلوث يحدث بين العينات أثناء التسلسل من خلال تبديل المؤشر [54]. من الناحية التجريبية ، لاحظنا تداخلًا منخفضًا في الرموز الشريطية بين التجارب التي تعمل على نفس الممر (ملف إضافي 1: الشكل S2). نظريًا ، ستتطلب جميع الخلايا الملوثة (الرموز الشريطية) في عينة معينة خلية مقابلة (رمز شريطي) في عينة أخرى تمت معالجتها على نفس المسار وتحتوي على جميع الجينات الملوثة. هذا غير مرجح إلى حد كبير نظرًا لأن جزءًا صغيرًا فقط من جميع الرموز الشريطية يتم تصنيفها على أنها خلايا.

تمكّن الخلايا المرجعية المتصاعدة من التصحيح الحسابي الدقيق لتوقيعات الخلية

نحن نمثل التلوث كتوقيع نصي يضاف إلى التوقيع النسخي لكل خلية. في حين أن توقيع التلوث متشابه للغاية عبر الخلايا داخل كل عينة ، فإن مدى إضافة هذا الملف الشخصي يكون خاصًا بكل خلية (الشكل 1 هـ). وبالتالي تتطلب إزالة التلوث تقدير متغيرين. أولاً ، يقرأ مدى التلوث الكلي لكل خلية ، كميًا على أنه جزء من التلوث (Fج). ثانيًا ، مدى مساهمة كل جين في التلوث في كل عينة ، أي التوقيع النسخي للتلوث (سج). يصعب تقدير هذه العوامل في تجارب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية الكلاسيكية حيث يتم ملاحظة الملف الشخصي الملوث النهائي فقط لكل خلية. ومع ذلك ، يمكن تقدير كلا المتغيرين من الخلايا المتصاعدة ، حيث يمكن مقارنة ملفات تعريف التعبير الملوثة بملفات تعريف مرجعية نظيفة ، والتي تم الحصول عليها عن طريق تسلسل المسامير بشكل منفصل (في حالة عدم وجود خلايا يحتمل أن تكون ملوثة). ميزة خاصة هي زيادة الأنواع المتقاطعة ، حيث تمكّن القراءات المتوافقة مع الأنواع المتقاطعة من التحديد الكمي المباشر لتوقيع التلوث وجزئه في تلك الارتفاعات (الشكل 1 ز). على سبيل المثال ، من المحتمل أن تنشأ القراءات المتوافقة مع الجينوم البشري في خلية فأر من التلوث.

استنادًا إلى الأساس المنطقي أعلاه ، ابتكرنا إجراءً لإزالة التلوث الحسابي يعتمد على الخلايا المتصاعدة لتصحيح بيانات التعبير لجميع الخلايا (الشكل 2 أ). أولاً ، قدرنا سج في كل عينة من خلال مقارنة ارتفاعات الماوس الملوثة بالمراجع النظيفة. بعد ذلك ، توقعنا نسبة التلوث لجميع الخلايا. للقيام بذلك ، اعتمدنا على الماوس المسامير ، حيث Fج تم حسابه على أنه جزء من القراءات المتوافقة مع الأنواع المتقاطعة. بناء على هذه الحقيقة الأرضية Fج القيم في الماوس المسامير ، قمنا بتركيب نماذج خطية تتعلم التنبؤ Fج بناءً على تعبير الجينات الأكثر تلويثًا. بعد ذلك ، تم تطبيق هذه النماذج للتنبؤ Fج في جميع الخلايا البشرية. أخيرا، سج تحجيم من قبل Fج تم طرحه من ملف تعريف التعبير لجميع الخلايا.

تصحيح حسابي دقيق للتوقيعات الخلوية على أساس الخلايا المتصاعدة. أ يتم استخدام مسامير الماوس لتقدير جزء التلوث Fج وتوقيع التلوث سج. ب متوقعة مقابل قياسها Fج. ج, د ارتباط بيرسون للقيم الخام (السوداء) والمصححة (الحمراء) للارتفاعات في عينات الإنسان والماوس إلى النسخة المرجعية الخارجية. ه مخطط تدفق تصحيح البيانات لعينات DMSO من المتبرعين الأول والثاني. من اليسار إلى اليمين: 1 - مخطط مبعثر لـ INS الخام و GCG من المتبرعين البشريين الأول والثاني. 2 و 3 - مخططات الكثافة للمانحين بشكل منفصل للبيانات الخام والمصححة. 4 - مخطط مبعثر لـ INS و GCG المصححين من المتبرعين البشريين الأول والثاني. ***ص & lt 0.0001 **ص & lt 0.001 ، *ص & lt 0.005

لتقييم إجراء التصحيح الخاص بنا ، قمنا أولاً بتقييم دقة fج تنبؤات باستخدام التحقق من الصحة 3 أضعاف داخل مسامير الماوس. أظهر هذا التقييم أداء تنبؤ عاليًا (الشكل 2 ب ، ص = 0.72). بعد ذلك ، قمنا بربط القيم المصححة للماوس والارتفاعات البشرية لتنظيف المراجع الخارجية. في جميع الحالات ، ارتبطت القيم المصححة بالمراجع الخارجية بقوة أكبر من ارتباطها بالبيانات الأولية. تم إجراء هذا التقييم في الماوس عبر التحقق من صحة البيانات بالإضافة إلى البيانات البشرية التي لم يراها المتنبئ (الشكل 2 ج). ولوحظ أداء عالٍ مماثل عند تطهير خلايا الفأر بناءً على ارتفاعات بشرية بشرية (الشكل 2 د).

بعد إزالة التلوث ، كانت قراءات الهرمونات موجودة فقط في خلايا الغدد الصماء وليس في جميع مجموعات الخلايا (ملف إضافي 1: الشكل S3a). أيضًا ، أظهرت طريقة إزالة التلوث لدينا أداءً أفضل عند مقارنتها بطرق التصحيح الأخرى [55] (ملف إضافي 1: الشكل S3b ، ملف إضافي 2: الجدول S1).

إجمالاً ، تُظهر هذه التحليلات أن أدوات التحكم في الارتفاع الخلوي ليست فقط أدوات قوية للكشف عن تلوث العينة باستخدام الحمض النووي الريبي الخالي من الخلايا ، ولكنها تتيح أيضًا تصحيحًا عالي الدقة للبيانات الملوثة (الشكل 2 هـ). الأهم من ذلك ، تتطلب المسامير الإضافية موارد تسلسل هامشية لأنها تشكل جزءًا صغيرًا فقط من جميع الخلايا التي تم تحليلها.

يتيح التعلم الآلي إمكانية تعيين أنواع الخلايا في جزر البنكرياس بدون علامات

استنادًا إلى بيانات التعبير المصححة للتلوث ، سعينا بعد ذلك إلى تحديد أنواع الخلايا لتقييم التأثيرات الخاصة بنوع الخلية من العلاج بالعقاقير. لتحديد المجموعات السكانية الفرعية لخلية الجزيرة ، أجرينا في البداية تحليل المكون الرئيسي متبوعًا بتضمين الحي العشوائي الموزع على t (t-SNE) على بيانات التعبير الجيني المصحح (ملف إضافي 1: الشكل S4). حددنا مجموعات من الخلايا غير الصماء ، الأقنية ، البطانية ، والمناعة. بالإضافة إلى ذلك ، حددنا ارتفاعات من نفس النوع من خلال ارتباطها بالإشارة إلى النسخ. لم يتم فصل أنواع خلايا الغدد الصماء بشكل جيد في هذا التحليل الأولي. لذلك كررنا التحليل العنقودي وتحليل t-SNE بشكل منفصل لخلايا الغدد الصماء (الشكل 3 أ) ولاحظنا دقة محسنة ولكن لا يزال هناك فصل واضح (الشكل 3 ب).

تعيين نوع الخلية. أ مؤامرة t-SNE لخلايا الغدد الصماء البشرية. ب التعبير عن جينات العلامة على مخطط t-SNE. ج توقع احتمالية نوع الخلية لكل خلية غير مستخدمة في التدريب في العينات البشرية. تم إجراء إعادة تعيين نوع الخلية بناءً على التوقعات فقط لتلك الخلايا التي لم يتم تعيينها سابقًا ، والتي تسمى هنا "الغدد الصماء"

ثم استخدمنا نهجًا قائمًا على التعلم الآلي ، والذي تم تدريبه على خلايا قابلة للتخصيص بشكل لا لبس فيه ، للتنبؤ بنوع الخلية من الخلايا التي يصعب تعيينها. أولاً ، قمنا بتعيين ممثلين واضحين لخلايا ألفا وبيتا وغاما ودلتا فقط بناءً على التعبير العالي للأنسولين أو الجلوكاجون أو السوماتوستاتين أو عديد ببتيد البنكرياس. بالإضافة إلى ذلك ، تم تخصيص مجموعة تعبر عن مستويات عالية من REG1A على أنها "مثل أسينار" في العينات البشرية (الشكل 3 ب). قمنا بعد ذلك بتدريب المصنف على التنبؤ بنوع الخلية من النسخة النصية استنادًا إلى هؤلاء الممثلين الواضحين لكل نوع خلية ، والتي تم تجميعها أولاً لتقليل عدم توازن الفئة. الأهم من ذلك ، تمت إزالة هرمونات تحديد نوع الخلية من النسخ. تم بعد ذلك تطبيق المصنف المدرب على جميع الخلايا غير المستخدمة في التدريب ، مما يدل على أداء التنبؤ العالي (الشكل 3 ج والملف الإضافي 1: الشكل S5a). ثم تم استخدام الفئة التي تم التنبؤ بها حسابيًا لتعيين أنواع الخلايا فقط لتلك الخلايا التي لم تكن قابلة للتخصيص بناءً على جينات الواسمات (المسمى "الغدد الصماء" في الشكل 3 ج والملف الإضافي 1: الشكل S5a). نظرًا لأننا مهتمون بدراسة هويات نوع الخلية ، يمكن أن يكون للزوج غير المتماثل بين نوعين مختلفين من الخلايا تأثير على تحليلنا. نظرًا لعدم وجود قطع واضح لإزالة المضاعفات استنادًا إلى القطع الكلاسيكية لـ nGene أو nUMI ، أجرينا تصفية خاصة بنوع الخلية استنادًا إلى تنبؤات نوع الخلية و nGenes (ملف إضافي 1: الشكل S6 وملف إضافي 3: الجدول S2).

بعد تعيين الخلايا المفردة لأنواع الخلايا ، قمنا أولاً بتحليل نسب أنواع الخلايا المختلفة مقارنةً بإجمالي عدد السكان (ملف إضافي 1: الشكل S5b-c). بشكل عام ، لاحظنا اختلافات قوية بين المتبرعين والمتبرعين ، والتي هيمنت على تأثيرات العلاج الدوائي باستخدام FoxOi و Artemether و GABA. لتقييم تأثيرات العقاقير الخاصة بنوع الخلية ، قمنا بحساب التغييرات النسبية للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية من خلال مقارنة العلاج المركب بعناصر تحكم DMSO المتطابقة مع المتبرعين (ملف إضافي 4: الجدول S3).

يؤدي التثبيط الدوائي لـ FoxO إلى عدم تمايز خلايا الجزيرة في المختبر

قمنا أولاً بتحليل تأثيرات FoxOi على خلايا الجزيرة ، لتقييم ما إذا كان المركب يمكنه نمذجة تمايز خلايا بيتا في المختبر. تمشيا مع النماذج الجينية لفقدان FoxO [33 ، 56 ، 57] ، تسبب FoxOi في تقليل تعبير الأنسولين في خلايا بيتا للفأر الذي لاحظناه أيضًا في خلايا بيتا البشرية (الشكل 4 أ ، ملف إضافي 5: الجدول S4).

يحث FoxOi على عدم التمايز في خلايا ألفا وبيتا لجزر الإنسان والفأر. أ تعبير الأنسولين في خلايا بيتا من الجزر البشرية (INS) والفأر (Ins1 و Ins2) المعالجة بـ 1 ميكرومتر من FoxOi لمدة 72 ساعة (*ص & lt 10 −10 **ص & lt 10 −45). ب GSEA مع مجموعة الجينات المنتظمة في فئران خروج المغلوب الثلاثية Foxo (FoxO1 - / - و FoxO3a - / - و FoxO4 - / -) [57] في خلايا بيتا من جزر الإنسان والفأر المعالجة بـ 1 ميكرومتر من FoxOi لمدة 72 ساعة. ج يتغير التعبير الجيني في خلايا ألفا (أعلى) وبيتا (أسفل) من جزر الإنسان والفأر المعالجة بـ 1 ميكرومتر من FoxOi لمدة 72 ساعة مقارنةً بعلاج DMSO. د ارتباط التعبير الجيني لخلايا ألفا وبيتا من الجزر البشرية والماوسية المعالجة بـ 1 ميكرومتر من FoxOi لمدة 72 ساعة إلى مجموعة التوقيع الجيني لخلايا ألفا أو بيتا

لتحليل ما إذا كانت التغييرات على مستوى النسخ تعكس حدثًا حقيقيًا لإلغاء التمايز ، استخدمنا تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) لمقارنة تغييرات التعبير في خلايا بيتا المعالجة بـ FoxOi إلى توقيعات عدم التمايز المعروفة لخلايا بيتا [56]. تم تنظيم الجينات ذات التعبير المتزايد في نموذج الماوس الثلاثي FoxO KO على علاج FoxOi في جزر الفئران والبشر (الشكل 4 ب). تم تخفيض عوامل نسخ خلايا بيتا المهمة مثل NEUROD1 و ISL1 و NKX6-1 و NKX2-2 و FOXA2 و MAFA و PDX1 و FOXO1 (الشكل 4 ج). تمشيا مع النماذج الجينية لفقدان FOXO ، حددنا LY96 وعلامات خلايا بيتا غير ناضجة CRYBA2 و C2CD4A ليتم تنظيمها في خلايا بيتا بعد علاج FoxOi. كشفت GSEA أن المسارات الرئيسية المرتبطة بالجينات الخاضعة للتنظيم في خلايا بيتا المعالجة بـ FoxOi كانت "تنظيم التعبير الجيني في خلايا بيتا" و "إفراز البنكرياس" و "داء السكري من النوع الثاني" (ملف إضافي 6: الجدول S5).

ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا أيضًا فقدان هوية خلايا ألفا استجابةً لعلاج FoxOi. تم تقليل تنظيم الجلوكاجون ، بالإضافة إلى عامل النسخ الرئيسي ARX ، والجينات الأخرى الخاصة بخلايا ألفا مثل GC و NEUROD1 و TTR و PAX6 و PCSK2 و MAFB و TM4SF4 (الشكل 4 ج).

من أجل التحقق من صحة فقدان خلية ألفا وهوية خلية بيتا في نهج غير متحيز ، قمنا بربط توقيعات التعبير الجيني للخلايا المعالجة بـ FoxOi بمجموعات الجينات المكونة من علامات خلايا ألفا وبيتا غير الهرمونية (الشكل 4 د). وهكذا ، حصلنا على قيمة الارتباط بمجموعة جينات توقيع خلية ألفا أو بيتا لكل خلية مفردة. في كل من الفئران والجزر البشرية ، تسبب FoxOi في فقدان كل من هوية خلية ألفا وبيتا وتحولًا في كل من مجموعات الخلايا إلى توقيعات التعبير الجيني الأقل التزامًا.

تقوم مجموعة فرعية من خلايا ألفا في الجزر المعالجة بأرتيميثير بتنظيم الأنسولين وعلامات خلايا بيتا

قمنا بعد ذلك بتحليل تأثيرات مادة أرتيميثير على خلايا ألفا بناءً على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. في الضوابط المعالجة بـ DMSO ، 1-6٪ من الفئران وخلايا ألفا البشرية تعبر عن مستويات قابلة للاكتشاف من الأنسولين (4-6٪ Ins1 ، 0.7-3.3٪ Ins2 ، 1.3–4.3٪ INS). بعد علاج ارتيميثير 10 ميكرومتر لمدة 72 ساعة ، لاحظنا زيادة ثابتة في عدد سكان خلايا ألفا التي تعبر عن الأنسولين بحوالي 3 أضعاف في الجزر البشرية و 2 أضعاف في جزر الفئران (الشكل 5 أ ، ملف إضافي 1: الشكل S7a والملف الإضافي 7: الجدول S6). لوحظ هذا التأثير أيضًا في متبرع بشري ثالث تمت معالجته باستخدام مادة أرتيميثير لمدة 72 ساعة ، ولكن ليس لمدة 36 ساعة (ملف إضافي 1: الشكل S8a). تم اكتشاف هذه الزيادة باستمرار في الخلايا التي يُتوقع أن تكون خلايا ألفا مع احتمال 50 ٪ لكل من عينات الإنسان والفأر ، مما يضمن اعتبار هذه الخلايا كخلايا ألفا بدلاً من أي نوع آخر من خلايا الغدد الصماء (ملف إضافي 1: الشكل S7b- ج). لوحظ هذا التأثير بشكل مستقل عن نسبة الأنسولين / الجلوكاجون في الجزر من المتبرعين المختلفين (ملف إضافي 1: الشكل S7d). الأهم من ذلك ، فشل العلاج باستخدام FoxOi في زيادة جزء خلايا ألفا التي تعبر عن الأنسولين ، مما يشير إلى وجود تأثير خاص بأرتيميثير غير مرتبط بإلغاء التمايز العام (الشكل 5 أ والملف الإضافي 1: الشكل S7A).

أرتيميثير ينظم الأنسولين في مجموعة فرعية من خلايا ألفا البشرية والفأر بينما التأثيرات في خلايا بيتا تعتمد على الأنواع. أ التوزيع التراكمي العكسي لتعبير الأنسولين في خلايا ألفا المعينة من الجزر البشرية (INS) والفأر (Ins1 و Ins2) المعالجة بـ 1 ميكرومتر من FoxOi أو 10 ميكرومتر من مادة أرتيميثير أو DMSO لمدة 72 ساعة. المخطط هو جزء من خلايا ألفا التي تعبر عن الأنسولين إلى مستوى أعلى كما هو موضح في x-محور. ب ارتباط توقيعات التعبير الجيني في خلايا ألفا بدون (Ins -) ومع (Ins +) مجموعات التوقيع الجيني لخلايا بيتا أو تعبير الأنسولين القابل للاكتشاف. ج يتغير التعبير الجيني لخلايا Ins + alpha بالنسبة إلى Ins - alpha cells. د التوزيع التراكمي العكسي لتعبير الأنسولين في خلايا بيتا من الجزر البشرية (INS) والفأر (Ins1 و Ins2) المعالجة بـ 1 ميكرومتر من FoxOi أو 10 ميكرومتر من مادة أرتيميثير أو DMSO لمدة 72 ساعة. ه يتغير التعبير الجيني في خلايا بيتا البشرية والفأرية المعالجة بـ 10 ميكرومتر من مادة أرتيميثير أو 1 ميكرومتر من FoxOi مقارنة بـ DMSO

قمنا كذلك بتمييز خلايا ألفا إيجابية الأنسولين من خلال مقارنة الترانسكريبتومات الخاصة بها مع جميع خلايا ألفا الأخرى (ملف إضافي 8: الجدول S7). من أجل تقييم ما إذا كانت الزيادة في تعبير الأنسولين هي انعكاس لفقدان هوية خلايا ألفا وتحريض محتمل لهوية خلية بيتا ، قمنا باختبار الارتباط بالتوقيعات الجينية الخاصة بخلايا ألفا أو خلايا بيتا ، باستثناء هرمونات تحديد نوع الخلية (مثل فوق). فقدت خلايا ألفا التي تعبر عن الأنسولين هوية خلايا ألفا واكتسبت جوانب ذات صلة بهوية خلايا بيتا مقارنة بخلايا ألفا سلبية الأنسولين (الشكل 5 ب). في الإنسان ، تمت زيادة الجينات الخاصة بخلايا بيتا IAPP و DLK1 و ABCC8 و PDX1 و MAFA و NKX6-1 و NKX2-2 وانخفضت الجينات الخاصة بخلايا ألفا GCG و ARX و TTR ، بما يتماشى مع المزيد الخسارة العامة لهوية خلية ألفا (الشكل 5 ج). كانت المسارات الرئيسية المنتظمة هي "إفراز الأنسولين" و "إشارات الأنسولين". في الفئران ، تم إعادة تنظيم الجينات الخاصة بخلايا بيتا Ins1 و Igf1r و Pdx1 و Nkx6-1 و Nkx2-2 و Iapp و Foxo1 و Abcc8 و Slc2a2 ، مما يقابل زيادة في "تنظيم التعبير الجيني في خلايا بيتا" و "تطوير خلايا بيتا" - مجموعات جينية محددة (ملف إضافي 9: الجدول S8) [58 ، 59].

لاحظنا أيضًا هذا التحريض للخلايا الإيجابية المزدوجة للأنسولين / الجلوكاجون التي من المحتمل أن تنشأ من خلايا ألفا في الجزر المعالجة بأرتيميثير من متبرع رابع باستخدام Drop-seq كتقنية بديلة لالتقاط تعبير RNA أحادي الخلية (ملف إضافي 1: الشكل S9) [60].

تأثير مادة أرتيميثير على خلايا بيتا في جزر البنكرياس خاص بالأنواع

قمنا بعد ذلك بتحليل آثار مادة أرتيميثير على خلايا بيتا. في خلايا بيتا بالفأر ، تسبب مادة أرتيميثير في انخفاض قوي في التعبير عن الأنسولين ، بما يتماشى مع تقرير سابق يشير إلى أن العقار يحفز عدم تمايز خلايا بيتا [8] (الشكل 5 د).

للتأكد من أن هذه التغييرات تعكس حدثًا حقيقيًا لإلغاء التمايز ، قمنا بمقارنة توقيعات التعبير الجيني لخلايا بيتا المعالجة بأرتيميثير بالنصوص المعروفة لخلايا بيتا غير المتمايزة باستخدام GSEA (ملف إضافي 1: الشكل S10a). في خلايا بيتا للفأر ، يتغير التعبير الجيني الناجم عن مادة الأرتيميثير المرتبطة بتلك التي يسببها FoxOi (ملف إضافي 1: الشكل S10b ، ص = 0.518). مع كلا المركبين ، لاحظنا انخفاض تنظيم الجينات في إفراز الأنسولين ، وإشارات الجلوكاجون ، ومسارات إشارات FoxO مثل Ucn3 و Nkx6-1 Pcsk2 و FoxO1 (الشكل 5 هـ).

على عكس ملاحظاتنا لعينات الفئران ، لم تظهر خلايا بيتا المعزولة من الجزر البشرية المعالجة بأرتيميثير أي انخفاض ، بل زيادة طفيفة في التعبير عن الأنسولين مقارنةً بعناصر التحكم المعالجة بـ DMSO (الشكل 5 د). لم ينخفض ​​تعبير الأنسولين أيضًا في المتبرع البشري الثالث عند 36 أو 72 ساعة (ملف إضافي 1: الشكل S8b). كانت خصوصية هذه الأنواع متناقضة مع تأثير FoxOi ، الذي تسبب في تقليل الأنسولين في كل من الفئران وخلايا بيتا البشرية. تماشياً مع هذا الاختلاف بين علاج مادة الأرتيميثير وعلاج FoxOi ، وُجد أن الارتباط العام لتغيرات التعبير الجيني في خلايا بيتا البشرية أضعف بين المركبين (ملف إضافي 1: الشكل S10b ، ص = 0.263). بينما قام FoxOi بتعديل جينات خلايا بيتا الرئيسية بما في ذلك NKX2-2 و PDX1 و FOXA2 و MAFA و INSR ، لم يتغير التعبير عن هذه الجينات في الغالب في خلايا بيتا البشرية المعالجة بأرتيميثير (الشكل 5 هـ).

أخيرًا ، قمنا بمقارنة تأثيرات الأدوية عبر الأنواع من خلال مطابقة الجينات المتعامدة بين خلايا بيتا والفأر البشري. لاحظنا أن تأثيرات FoxOi كانت مرتبطة ارتباطًا ضعيفًا بين الأنواع (ملف إضافي 1: الشكل S10c ، ص = 0.296) بينما لم يلاحظ أي ارتباط لتأثيرات مادة أرتيميثير في خلايا بيتا البشرية والفأرية (ص = 0.129). بينما أرتيميثير قللت من تنظيم جينات خلايا بيتا الرئيسية INS1 / 2 و SLC2A2 و ISL1 و GCGR و UCN3 و SCG5 في خلايا بيتا للفأر ، ظل التعبير عن هذه الجينات دون تغيير في خلايا بيتا البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، تغيرت العديد من الجينات بشكل غير متوافق ، على سبيل المثال أرتيميثير قللت من تنظيم SPP1 في خلايا بيتا للفأر ، في حين أنها أعادت تنظيم تعبيرها في خلايا بيتا البشرية ، والعكس بالعكس بالنسبة لـ IGF1R. تشير هذه البيانات إلى أن تأثيرات FoxOi محفوظة في خلايا بيتا البشرية والفأرية ، في حين أن مادة أرتيميثير تسبب تغيرات أكثر في التعبير الجيني المعتمد على الأنواع.

إن ربط تغييرات النسخ بين العينات الفردية يدعم أيضًا اكتشاف أن هذه الأدوية لها تأثيرات مختلفة في خلايا الفئران والجزيرة البشرية (الشكل 6).

تعتمد تأثيرات مادة أرتيميثير على خلايا بيتا على الأنواع. أ ارتباطات سبيرمان لتغييرات طية السجل لمقارنات 1 ميكرومتر FoxOi ، 10 ميكرومتر ارتيميثير ، أو 100 ميكرومتر GABA إلى DMSO لخلايا ألفا وبيتا من الفئران والجزر البشرية. ب يحث FoxOi على عدم التمايز بين خلايا ألفا وبيتا في الفئران والبشر ، بينما يزيد مادة الأرتيميثير جزء خلايا ألفا INS +. في خلايا بيتا ، تعتمد تأثيرات مادة الأرتيميثير على الأنواع في الفئران ، ويؤدي الدواء إلى عدم تمايز خلايا بيتا ، بينما لا توجد تأثيرات قوية في الإنسان


يؤدي الاستهداف المزدوج لسلائف جدار الخلية بواسطة تيكسوباكتين إلى تحلل الخلايا

يمثل Teixobactin أول عضو في فئة تم اكتشافها حديثًا من المضادات الحيوية التي تعمل من خلال تثبيط تخليق جدار الخلية. يربط تيكسوباكتين العديد من سلائف جدار الخلية المقترنة بالبكتوبرينول ، مما يثبط كل من تخليق حمض الببتيدوغليكان والتيشويك. هنا ، نوضح أن النشاط المبيد للجراثيم المثير للإعجاب لـ teixobactin يرجع إلى التثبيط التآزري لكلا الهدفين ، مما يؤدي إلى تلف جدار الخلية ، وإلغاء تحديد موقع autolysins ، وتحلل الخلية اللاحق. وجدنا أيضًا أن تيكسوباكتين لا يربط الببتيدوغليكان الناضج ، مما يزيد من نشاطه في كثافات الخلايا العالية وضد عزلات المكورات العنقودية الذهبية (VISA) مع طبقات الببتيدوغليكان السميكة. تضيف هذه النتائج إلى جاذبية تيكسوباكتين كعامل علاجي محتمل لعلاج العدوى التي تسببها مسببات الأمراض المقاومة للمضادات الحيوية إيجابية الجرام.

Copyright © 2016, American Society for Microbiology. كل الحقوق محفوظة.

الأرقام

Antibacterial activity of teixobactin is…

Antibacterial activity of teixobactin is dependent on autolysin. (A) Scanning electron microscopy of…

Teixobactin causes downregulation of atl…

Teixobactin causes downregulation of atl expression. (A) Bacteriolytic assay using supernatant from JE2…

Inhibition of WTA biosynthesis is…

Inhibition of WTA biosynthesis is responsible for teixobactin-mediated lysis. The lysis of SA113…

Mutation of saeS results in…

Mutation of saeS results in sensitization to vancomycin due to decreased WTA. (A)…

Teixobactin treatment causes Atl delocalization.…

Teixobactin treatment causes Atl delocalization. في المختبر binding of amidase repeats (Cy3-R 1–3…


Genetic targeting of Card19 is linked to disrupted Ninj1 expression, impaired cell lysis, and increased susceptibility to يرسينيا عدوى

Cell death plays a critical role in inflammatory responses. During pyroptosis, inflammatory caspases cleave Gasdermin D (GSDMD) to release an N-terminal fragment that generates plasma membrane pores that mediate cell lysis and IL-1 cytokine release. Terminal cell lysis and IL-1β release following caspase activation can be uncoupled in certain cell types or in response to particular stimuli, a state termed hyperactivation. However, the factors and mechanisms that regulate terminal cell lysis downstream of GSDMD cleavage remain poorly understood. In the course of studies to define regulation of pyroptosis during يرسينيا infection, we identified a line of Card19-deficient mice (Card19 lxcn ) whose macrophages were protected from cell lysis and showed reduced apoptosis and pyroptosis, yet had wild-type levels of caspase activation, IL-1 secretion, and GSDMD cleavage. Unexpectedly, CARD19, a mitochondrial CARD-containing protein, was not directly responsible for this, as two independently-generated CRISPR/Cas9 Card19 knockout mice showed no defect in macrophage cell lysis, and expression of CARD19 in Card19 lxcn macrophages did not restore cell lysis. Card19 is located on chromosome 13, adjacent to Ninj1, which was recently reported to regulate cell lysis downstream of GSDMD activation. Intriguingly, RNA-seq and western blotting revealed that Card19 lxcn BMDMs are hypomorphic for NINJ1 expression, and reconstitution of Ninj1 في Card19 lxcn immortalized BMDMs restored cell lysis. Card19 lxcn mice exhibited significantly increased susceptibility to يرسينيا infection, demonstrating that cell lysis itself plays a key role in protection against bacterial infection. Our findings identify genetic targeting of Card19 being responsible for off-target effects on the adjacent Ninj1 gene, thereby disrupting the ability of macrophages to undergo plasma membrane rupture downstream of gasdermin cleavage and impacting host survival and bacterial control during يرسينيا عدوى.

ملخص المؤلف Programmed cell death is critical for regulating tissue homeostasis and host defense against infection. Pyroptosis is an inflammatory form of programmed cell death that couples cell lysis with release of inflammatory cytokines. Cell lysis is triggered by activation of particular intracellular pore forming proteins, but how regulation of cell lysis occurs is not well understood. Genetic targeting of Card19 on chromosome 13 resulted in decreased expression of the adjacent gene, Ninj1 which was recently found to regulate terminal lysis events in response to cell death-inducing stimuli. We found that macrophages from Card19-deficient mice were resistant to multiple forms of cell death in response to a variety of inflammatory stimuli, including canonical and non-canonical inflammasome activation, as well as triggers of cell-extrinsic apoptosis. Notably, Card19-deficient mice were more susceptible to يرسينيا infection, indicating that cell lysis contributes to control of bacterial infections. Our data provide new insight into the impact of terminal cell lysis on control of bacterial infection and highlight the role of additional factors that regulate lytic cell death downstream of gasdermin cleavage.

Competing Interest Statement

The authors have declared no competing interest.


شاهد الفيديو: خلايا طبيعية ومتبلزمة. للصف. بلزمة الخلايا النباتية (ديسمبر 2022).