معلومة

في بكتيريا كريسبر ، كيف يتم دمج الجينومات الفيروسية في فواصل كريسبر؟ أيضًا ، في استخدامه ، أين يقطع Cas9 الحمض النووي؟

في بكتيريا كريسبر ، كيف يتم دمج الجينومات الفيروسية في فواصل كريسبر؟ أيضًا ، في استخدامه ، أين يقطع Cas9 الحمض النووي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد خرجت من علم الأحياء لمدة عام تقريبًا في صقل مهاراتي في البرمجة. أعلم أن تقنية CRISPR / Cas9 تتيح "القطع" المستهدف للحمض النووي عبر توجيه الحمض النووي الريبي. أسئلة قليلة بخصوص هذا.

  1. فيما يتعلق بالظاهرة الطبيعية ، عندما يصيب الفيروس ميكروبًا بقدرات كريسبر ، كيف يتم دمج الجينوم في "فواصل" منطقة كريسبر مقابل أي مكان آخر من جينوم بدائيات النوى بحيث عند نسخها ، تعرف إنزيمات كاس أنه حمض نووي أجنبي العنصر المراد استهدافه؟ إن فهمي للعدوى بالفيروسات غائم بعض الشيء أيضًا ؛ أفكر في عمليات تبديل عشوائية.

  2. أنا أبحث في الأمر الآن ، لذلك يمكنني معرفة ذلك قبل أن يجيب شخص ما ، ولكن عندما يتم تحديد الحمض النووي المستهدف عبر الحمض النووي الريبي التوجيهي ، أين يقرر إنزيم Cas9 أن `` يقطع '' - مما يجعله عديم الفائدة - الحمض النووي ، وكيف تحدد الموقع؟

- تحرير- آه. يجب أن يشتمل التسلسل المستهدف أيضًا على تسلسل "PAM" في اتجاه مجرى النهر (Protospacer Adjacent Motif) ، والذي يسمح بربط مجمع البروتين الريبي (توجيه RNA + Cas9) ، وسحر الكيمياء الحيوية يقطعه ~ 3-4 قواعد في اتجاه التيار من PAM). الاقتباس: https://www.addgene.org/CRISPR/guide/

  1. فكرت للتو في سؤال آخر ، إذا تم قطع الحمض النووي في مكان محدد على ما يبدو ، فهل إصلاح الحمض النووي الذي يترتب على ذلك في اتجاه مجرى النهر عشوائي تمامًا؟ أشعر أنه سيكون من مصلحة الكائن الحي (anthropomorphogenic ، عفوًا) ، والتطور عمومًا يقول إنه عادة ما يكون لديه آلية لإصلاحه إلى حالته الأصلية.

يجب أن توضح هذه الورقة أكثر بكثير مما يستطيع أي شخص هنا فعلاً بشأن نظام كريسبر.

يعتبر CRISPR / Cas9 فريدًا جدًا ، حتى بالمقارنة مع البروتينات الأخرى المنقاة من البكتيريا مثل Taq Poly.

يرجع السبب إلى مدى تعقيده في تحفيز هذا البروتين. بشكل أساسي ، تقوم بإصابة البلازميد ببروتين Cas9 ودليله RNA (gRNA) على الناقل. إن إجراء التحويل في حد ذاته ليس بالأمر السهل ، ناهيك عن أنك تضيف بشكل أساسي آلية إلى خلية تحاول القضاء على الجينات ولديك حفنة. في الواقع ، القيام بذلك لخط خلية واحد ، وملاحظة تأثيرات ما أخرجته ، سيكون كافيًا لإنتاج ورقة في مجلة مؤثرة جدًا. (صورة من: https://www.systembio.com/)

تتضمن أيضًا بعض التطورات الحديثة في تقنية كريسبر ما يلي:

  • CRIPSR / Cas9 الناجم عن الضوء (تنظيم أسهل للنشاط الأنزيمي)

في الأساس ، كان هؤلاء الباحثون يحاولون استنتاج طريقة تسمح بمزيد من التحكم في تقنية كريسبر ، نظرًا لأن كريسبر واجهت مشكلات في التأثيرات غير المستهدفة. في حين أنه ليس تغييرًا في كيفية عمل كريسبر ، أو حتى مكانه ، فإن التغيير هو مدى قدرتك على التحكم في رد الفعل. ببساطة ، ابتكروا طريقة تسمح لك بتشغيل / إيقاف تشغيل CRISPR باستخدام الضوء مما يتيح تحكمًا أكثر دقة في نشاطها. بالتأكيد سيكون من المفيد تقليل تأثيرات الهدف.

"تم تحقيق ذلك من خلال دمج البروتينات المتغايرة المحفزة للضوء CRY2 و CIB1 في مجال المعاملات و d Cas9 غير النشط تحفيزيًا ، على التوالي." (لورين آر بولستين وتشارلز إيه غيرسباخ)

  • Cpf1 ليحل محل Cas9 كبروتين تقطيع (نشاط أكثر بريسيس)

هذا واحد أكثر إثارة للاهتمام من حيث أنه تغيير مباشر لنظام كريسبر نفسه. كان Cas9 هو بروتين القطع القياسي المستخدم في نظام CRISPR على الرغم من أنه أثار الجدل بسبب قطعه غير الدقيق إلى حد ما. لقد ثبت أن Cpf1 أكثر دقة (كما تقول بياناتهم) ويتم تنفيذه الآن من قبل البعض لمعرفة ما إذا كان هذا هو الحال بالفعل. بالاقتران مع النظام "الناجم عن الضوء" أعلاه ، يؤدي ذلك إلى خفض CRISPR إلى مستويات أكثر أمانًا عند الحديث عن التأثيرات خارج الهدف.

إليك بعض الندوات الجيدة عبر الإنترنت لتبدأ بها:

  1. CRISPR / Cas9 من البداية إلى النهاية
  2. تحسين تجارب CRISPR-Cas9 باستخدام RNAs الإرشادية المصممة بعقلانية

لا يمكنني التعليق مباشرة على هذه الندوات لأنها تشرح كل شيء جيدًا بمفردها. أي شيء أقوله حقًا سينتقص مما يقومون بتدريسه لأنني لست خبيرًا في تقنية CRISPR بأي حال من الأحوال ولكن ببساطة شخص يبحث في إمكانية استخدامه لمختبري. يوجد حاليًا الكثير من المواد الإرشادية حول كيفية تنسيق تجارب CRISPR بشكل صحيح ، لكن رأيي الشخصي هو إعطاء التقنية ربما عامًا أو عامين آخرين عندما تكون قياسية أكثر للبحث.

هذا ما لم ترغب في البحث عن الطريقة مباشرة وتحسينها بطريقتك الخاصة.

اسمحوا لي أن أعرف إذا كان هذا يجيب على أسئلتك بشكل كاف.

آسف لأنني لا أستطيع فعل المزيد من حيث شرح الروابط. الدراسات ليست دراسات يمكنني الوصول إليها بسهولة إلا إذا كنت في العمل لأنني عادة ما أصل إليها من خلال الجامعة.

فيما يتعلق بآلية الإصلاح (سؤالك رقم 3) ، لا يمكنني الإجابة عن ذلك بالتأكيد ، لكنني تلقيت مؤخرًا كتيبًا يصف كيفية التأكد من أن الخلايا تستخدم HJ بدلاً من NHEJ.


السلالات البكتيرية الرئيسية خالية بشكل أساسي من أنظمة الدفاع الفيروسي CRISPR-Cas

يعتمد الفهم الحالي للتفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة والفيروسات ، التي تشكل تطور وعمل النظم البيئية للأرض ، في المقام الأول على الكائنات الحية المستزرعة. نحن هنا نحقق في الآلاف من الجينومات الفيروسية والميكروبية التي تم استردادها باستخدام نهج مستقل عن الزراعة لدراسة تواتر وتنوع وتوزيع آليات الدفاع الفيروسي. توجد أنظمة CRISPR-Cas التي تمنح الكائنات الحية الدقيقة مناعة ضد الفيروسات في 10٪ فقط من 1724 كائنًا دقيقًا تم أخذ عينات منها ، مقارنة بالتقارير السابقة التي تشير إلى حدوث 40٪ في البكتيريا و 81٪ في العتائق. نعزو هذا الاختلاف الكبير إلى عدم وجود أنظمة CRISPR-Cas عبر السلالات البكتيرية الرئيسية التي ليس لها ممثلون مزروعون. نحن نربط غياب كريسبر-كاس بنقص قدرة التخليق الحيوي للنيوكليوتيدات ونمط الحياة التكافلي. يتم تمثيل أنظمة التقييد بشكل جيد في هذه السلالات وقد توفر دفاعًا فيروسيًا غير محدد والوصول إلى النيوكليوتيدات.


الملخص

تعتمد الفيروسات على مضيفيها لإكمال دورات تكرارها ، حيث تستغل المستقبلات الخلوية للدخول واختطاف الوظائف الخلوية لتكرار جينومها ، وتجميع فيروسات النسل وانتشارها. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام شاشات CRISPR-Cas على نطاق الجينوم لتحديد عوامل المضيف المطلوبة لتكرار الفيروس ، بما في ذلك تكرار الفيروسات ذات الصلة سريريًا مثل فيروس زيكا وفيروس غرب النيل وفيروس حمى الضنك وفيروس التهاب الكبد الوبائي. في هذه المراجعة ، نناقش الجوانب الفنية لشاشات خروج المغلوب على نطاق الجينوم باستخدام تقنية CRISPR-Cas ، ونقارن هذه الشاشات بتقنيات الفحص الجيني البديلة. إن السهولة النسبية في الاستخدام والتكاثر لـ CRISPR-Cas تجعلها أداة قوية للتحقق من تفاعلات الفيروس مع المضيف ولتحديد أهداف جديدة مضادة للفيروسات.

الفيروسات تلزم مسببات الأمراض داخل الخلايا التي تعتمد على المكونات الخلوية المضيفة لتكرارها. ترتبط بمستقبلات سطح الخلية لدخول الخلايا ، وتشترك في اختيار الوظائف الخلوية والعضيات لتتكاثر. يمكن للخلايا المضيفة مواجهة العدوى عن طريق استشعار الأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (PAMPs) ، مثل الأحماض النووية الفيروسية ، ومن خلال تحفيز التعبير عن الجينات المضادة للفيروسات لاحقًا. يمكن أن يوفر تحديد وتوصيف العوامل المضيفة التي تعزز وتقييد تكاثر الفيروس رؤى مهمة في الجوانب الأساسية للبيولوجيا الخلوية والعلاقات بين الفيروس والمضيف ، ويمكن أن يؤدي إلى تحديد أهداف جديدة للعلاجات المضادة للفيروسات.

قدم استخدام الشاشات الجينية الأمامية استراتيجية غير متحيزة وشاملة للكشف عن عوامل المضيف التي تعزز أو تقيد تكاثر الفيروس. في الأصل ، اقتصر استخدام هذه الشاشات الجينية على الكائنات الحية النموذجية التي يمكن تتبعها وراثيًا ، مثل الخمائر وذباب الفاكهة والديدان المستديرة وسمك الزرد ، واعتمد على استخدام الأشعة السينية أو المطفرات الكيميائية لإحداث طفرات. ساهمت هذه الشاشات الجينية الأمامية بشكل ملحوظ في فهمنا للعديد من العمليات البيولوجية الأساسية 1،2،3،4 ، لكن تطبيقها على خلايا الثدييات المستزرعة كان أمرًا صعبًا. مع التقدم التكنولوجي مثل RNAi والطفرات التدميرية في الخلايا أحادية الصيغة الصبغية البشرية ، أصبح من الممكن تعطيل التعبير الجيني على مقياس الجينوم في زراعة خلايا الثدييات 5،6،7. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم نظام المناعة التكيفي CRISPR-Cas بدائية النواة للحث بكفاءة على طفرات خروج المغلوب في أي نوع من الخلايا تقريبًا ، مما أحدث ثورة في الأبحاث البيولوجية 8،9،10 (الإطار 1). على عكس أساليب الضربة القاضية الجينية ، مثل RNAi ، غالبًا ما ينتج عن خروج الأليلات بواسطة CRISPR-Cas أنماط ظاهرية أكثر وضوحًا ، ونسبة إشارة إلى ضوضاء أكبر وتحديد عدد أقل من الإيجابيات الخاطئة 11،12،13،14. يتم إنشاء أليلات خروج المغلوب بواسطة نوكلياز Cas9 الداخلي ، والذي يتم توجيهه إلى منطقة جينومية محددة بواسطة RNA أحادي الدليل (sgRNA) من خلال الاقتران بقاعدة Watson-Crick. يقوم Cas9 بإنشاء فاصل مزدوج (DSB) في الموقع المستهدف ، والذي يتم إصلاحه بعد ذلك عن طريق الانضمام إلى طرف غير متماثل (NHEJ). يؤدي هذا غالبًا إلى حدوث طفرة في الإطارات والتعبير عن البروتينات المقتطعة أو غير الوظيفية. إن سهولة استهداف Cas9 لمواقع محددة ، جنبًا إلى جنب مع تصميم مجموعات متعددة من sgRNAs التي تمتد على كامل الجينوم البشري 14،15،16،17 ، قد مكنت من تحديد نطاق الجينوم لعوامل المضيف التي تعتبر حاسمة لتكرار الفيروس.

في هذه المراجعة ، نصف كيف ساهمت الشاشات الجينية في فهمنا لبيولوجيا مضيف الفيروس وكيف تم استخدام شاشات CRISPR-Cas لتوسيع مجموعة أدواتنا لتحديد عوامل المضيف المهمة لتكرار الفيروس. نقدم نصائح عملية حول كيفية إعداد شاشات CRISPR-Cas ونقدم أمثلة على الاكتشافات الحديثة التي تم إجراؤها باستخدام تقنية CRISPR-Cas للفيروسات التي تسبب أمراضًا بشرية مهمة ، بما في ذلك فيروس حمى الضنك (DENV) وفيروس زيكا (ZIKV) والغرب. فيروس النيل (WNV) وفيروس التهاب الكبد الوبائي سي (HCV) ونوروفيروس. نناقش أيضًا إمكانات تقنية CRISPR-Cas بما يتجاوز تطبيقات الفحص الجيني ، وكيف يمكنها تعزيز فهمنا للإمراض الفيروسية وتطوير العلاجات المضادة للفيروسات.

الإطار 1: المناعة التكيفية CRISPR – Cas بوساطة

نظام CRISPR-Cas هو نظام مناعي تكيفي يحمي البكتيريا والعتائق من العاثيات والبلازميدات. يتم التوسط في مناعة CRISPR-Cas بواسطة CRISPR RNA (crRNA) و Cas endonculease الذي يستهدف العناصر الجينية 141. يتكون أسلوب العمل من ثلاث خطوات متميزة: الاكتساب والتعبير والتدخل (انظر الشكل). في خطوة الاستحواذ ، يتم دمج الأحماض النووية الأجنبية بشكل مباشر ، كفواصل CRISPR جديدة ، في مصفوفة CRISPR مفصولة بتسلسلات متكررة ، وبالتالي إنشاء ذاكرة لغزو العناصر الجينية 142 (انظر الشكل ، الخطوة 1). في خطوة التعبير ، يتم نسخ موضع CRISPR إلى نسخة ما قبل CRISPR RNA (pre-crRNA) ، والتي تتم معالجتها بعد ذلك في crRNA ناضج يحتوي على تسلسلات فاصل CRISPR جزئية مرتبطة بتكرارات CRISPR الجزئية 132. يقوم موضع كريسبر أيضًا بتشفير الحمض النووي الريبي للمعاملات (tracrRNA) الذي له تكامل لمناطق تكرار نسخ كرنا 143. بالإضافة إلى مصفوفة CRISPR ، يتم ترميز نوكلياز Cas واحد أو متعدد (على سبيل المثال ، Cas9) بواسطة موضع CRISPR (انظر الشكل ، الخطوة 2). في مرحلة التداخل ، يتم تكوين هجين crRNA-tracrRNA من خلال ربط متواليات منطقة التكرار التكميلية ، ويوجه هجين RNA هذا نوكلياز Cas نحو تسلسلات DNA التكميلية ، مما يؤدي إلى استهداف العناصر الوراثية الغازية وانشقاقها 144. تعتمد معظم بروتينات المستجيب لـ CRISPR على نموذج مجاور لـ protospacer (PAM على سبيل المثال ، NGG لـ Cas9) في الحمض النووي المستهدف. يعد PAM ضروريًا للاعتراف والانقسام والتمييز بين الحمض النووي الذاتي وغير الذاتي 145،146،147 (انظر الشكل ، الخطوة 3). بالنسبة لـ Cas9 ، سيؤدي التكامل المثالي إلى تغيير توافقي في نوكلياز داخلي يؤدي إلى حالة هيكلية مختصة بالانقسام 148،149،150،151،152،153. مكونات البروتين والحمض النووي الريبي من الأبراج العقدية تم تكييف نظام كريسبر من الفئة 2 ليعمل في حقيقيات النوى ، بما في ذلك الخلايا البشرية. يتم دمج Cas9 المُحسَّن بواسطة الكودون البشري في إشارة التوطين النووي (NLS) لتوجيه Cas9 إلى النواة في خلايا الثدييات 8،9،10. لتوليد الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNAs) لتحرير الجينوم الذي يحاكي الهجين الطبيعي كرنا- tracrRNA ، يتم دمج المتواليات الشبيهة بـ crRNA في tracrRNA الجزئي من خلال حلقة جذعية اصطناعية.


مقدمة

تصيب الفيروسات النباتية أنواعًا نباتية متنوعة في جميع أنحاء العالم. أثناء العدوى الناجحة ، تؤدي الفيروسات إلى مجموعة من التفاعلات مع نواقل الحشرات أو مضيفات النبات. اكتسبت بعض فيروسات النبات مكونات خارج فيروسية ، بمعنى. ، أقمار الحمض النووي ، أقمار RNA ، وفيروسات الأقمار الصناعية (Mansoor et al.، 1999 Briddon et al.، 2001 Palukaitis، 2016). تسببت فيروسات النبات في انخفاض كبير في إنتاجية المحاصيل في جميع أنحاء آسيا وإفريقيا وأوروبا وأمريكا الجنوبية ، مما أدى إلى خسائر ما يقرب من 30 مليار دولار أمريكي و # x0024 سنويًا (Sastry and Zitter ، 2014). على سبيل المثال ، في العقد الماضي ، تسبب مرض فسيفساء الكسافا في خفض إنتاج الكسافا بنحو 25 مليون طن في جميع أنحاء العالم (Legg and Thresh ، 2000 Thresh and Cooter ، 2005). تم تدمير الملايين من نباتات الحمضيات سنويًا بواسطة فيروس Citrus Tristeza (CTV) (Moreno et al. ، 2008 Harper ، 2013). أدى فيروس لفافة أوراق البطاطس إلى خسارة ما يقرب من US & # x0024100 مليون في الولايات المتحدة وحوالي & # x00A350 مليون في المملكة المتحدة (Wale et al.، 2008 Sastry and Zitter، 2014). وبالمثل ، خلال الفترة بين عامي 1992 و 9197 ، تسبب مرض تجعيد أوراق القطن في خسارة حوالي 00245 مليار دولار أمريكي (بريدون وآخرون ، 2001) لاقتصاد باكستان.

يتطلب النهج الفعال لمكافحة الفيروسات طرقًا فعالة للكشف ورؤى لاحقة حول البنية الجينية للفيروسات المستهدفة. تم استخدام طرق مختلفة ، بما في ذلك مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وتحليل إنزيم التقييد ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، والنسخ العكسي PCR (RT-PCR) ، بشكل منتظم كأداة فحص أولية. تعتمد معظم تقنيات التشخيص هذه على المعرفة السابقة بالجينومات الفيروسية بحيث تظل الفيروسات غير المعروفة غير مكتشفة. أحدثت تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) ثورة في مجال البيولوجيا الجزيئية ، وخاصة علم الفيروسات النباتية ، من خلال الكشف الشامل عن البيانات الجينومية بمستوى لم يكن ممكنًا من قبل. يمكن لتقنيات NGS المعاصرة تسلسل جميع أنواع جزيئات الحمض النووي في وقت واحد. مكنت تقنيات NGS من اكتشاف فيروسات ممرضة جديدة ظلت غير مكتشفة بسبب انخفاض عيار الفيروس أو مستويات عتبة الكشف (Villamor et al. ، 2019). تسهل تقنيات NGS اكتشاف أنواع فيروسات النبات التي تم التغاضي عنها وتساعد على توسيع فهمنا للفيروسات النباتية.

تم استخدام إعادة التركيب كأداة لتعديل جينومات بدائية النواة ، ولكن هذا النهج كان أقل تحديدًا وعائدًا منخفضًا. اكتشاف أربعة نوكليازات داخلية خاصة بالتسلسل مثل meganucleases و Zinc Finger Nuclease (ZFN) و Transcription Activator مثل Effector Nuclease (TALEN) وتكرارات متناظرة قصيرة متباعدة بشكل منتظم (CRISPR) - بروتين مرتبط بـ CRISPR 9 (CRISPR-Cas9) ( Zhang et al. ، 2013) تحسن بشكل كبير في تحرير الجينوم (GE) في الكائنات الحية الأعلى (Wiedenheft et al. ، 2011 Jinek et al. ، 2012 ، 2013 Gaj et al. ، 2013). من بينها ، نظام CRISPR-Cas هو أبسط أداة GE وأكثرها كفاءة وتنوعًا والتي تسمح بطفرات موجهة للموقع في الموضع الجينومي المطلوب (Gaj et al.، 2013 Bortesi and Fischer، 2015).

تشتق أنظمة CRISPR-Cas من أنظمة المناعة بدائية النواة التي توفر مناعة أصلية ضد غزو الأحماض النووية (الشكل 1). تتنوع أنظمة CRISPR-Cas ويمكن تقسيمها إلى فئتين رئيسيتين وستة أنواع مختلفة وأنواع متعددة (Makarova et al. ، 2020). المكونات الرئيسية لأنظمة CRISPR-Cas الأكثر استخدامًا هي نوكلياز Cas9 الداخلي ، المشتق من كائنات دقيقة مختلفة ، مثل الأبراج العقدية, المكورات العنقودية الذهبية، و فرانسيسيلا نوفيسيدا، وهي جزء من أنظمة الفئة الثانية من النوع الثاني (Makarova and Koonin، 2015 Makarova et al.، 2020). هذه البروتينات Cas9 مصحوبة بـ CRISPR-RNA (crRNA) وتنشيط CRISPR-RNA (tracrRNA) للانقسام المعتمد على التسلسل للأحماض النووية الأجنبية (Hille et al. ، 2018 Makarova et al. ، 2020). أدى اختراع الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNA) إلى زيادة التطبيقات المحتملة لأنظمة CRISPR-Cas (Jinek et al. ، 2012). كخطوة أولية في المناعة بدائية النواة المستندة إلى CRISPR-Cas ، يتم دمج شظايا الحمض النووي لمسببات الأمراض الغازية في موضع كريسبر أثناء الإصابة. وبالتالي ، تنشط العدوى اللاحقة نسخ هذه الأجزاء الصغيرة كجزء من مجموعة كريسبر التي تنسقها مع آلية بروتين (Cas) المرتبطة بـ CRISPR للتعرف على عناصر DNA / RNA الأجنبية وربطها والالتصاق بها.

شكل 1. نموذج تحريض المقاومة المعتمد على CRISPR-Cas. يتم تحديد وتجنيد وانقسام العامل الممرض الغازي والحمض النووي (الفطريات والبكتيريا والفيروسات و / أو الفيتوبلازما) في ثلاث خطوات أساسية. 1. الاكتساب: تم ​​دمج الحمض النووي المغزو (شريط باللون الأحمر) في مصفوفة CRISPR (مستطيلات بيضاء) كفواصل جديدة 2. التعبير: يتم تشغيل آلية ما قبل CRISPR و crRNAs والتعبير عنها في الخلية التي تم غزوها 3. التداخل: تم تهجين الحمض النووي الريبي الناضج مع جينوم الممرض الغازي وتم التعرف عليه لاحقًا بواسطة بروتينات كاس. ينتج عن تنسيق Cas Helicase و nuclease مع ماكينات CRISPR RNA انقسام الحمض النووي الغازي & # x2019s.

بالإضافة إلى أنظمة CRISPR-Cas9 المعروفة ، فإن تطبيقات التكنولوجيا الحيوية لعدد من الأنواع والأنواع الفرعية الأخرى من CRISPR هي أيضًا قيد التطوير النشط. تصنف أنظمة CRISPR-Cas إلى فئتين رئيسيتين بناءً على نوع التداخل: الصنف الأول والفئة الثانية. يتم تصنيف الفئتين الأولى والثانية أيضًا إلى ستة أنواع بناءً على نوع الحمض النووي الذي يستهدفونه (Makarova and Koonin ، 2015). تم تقييم التصنيف التطوري لأنظمة CRISPR-Cas ، وخاصة الفئة الثانية ومتغيراتها ، بواسطة Makarova et al. (2020). من بين أنظمة بروتين Cas الفردية من الفئة الثانية ، تشمل هذه الأنظمة Cas12 (النوع الخامس) ، و Cas9 (النوع الثاني) ، و Cas13a-d (النوع السادس) ، و Cas14a-c (النوع VF) (Burstein et al. ، 2017 Shmakov et al. ، 2017).مثل Cas9 ، يستهدف Cas12 DNA مزدوج الشريطة (ds) ، ومع ذلك ، Cas13 (النوع السادس) بروتينات المستجيب: Cas13a (C2c2) (Abudayyeh et al. ، 2016) ، Cas13b (C2c6) (Cox et al. ، 2017) ، Cas13c (C2c7) (Shmakov et al. ، 2017) ، و Cas13d (Yan et al. ، 2018) تتميز بأنها ريبونوكلياز موجه من الحمض النووي الريبي في الجينومات الميكروبية.

على عكس أنظمة الفئة 2 ، تتكون أنظمة الفئة 1 من عدة بروتينات Cas ، في مجموعات مختلفة ، اعتمادًا على النوع والنوع الفرعي. على وجه التحديد ، تتكون مجمعات النوع الأول عمومًا من Cas5 و Cas6 و Cas7 و Cas8 و Cas11 و dsDNA المستهدفة ، بينما تتكون مجمعات النوع الثالث من Cas5 و Cas6 و Cas8 و Cas10 وهي منتشرة في الجهاز المناعي تقريبًا ربع الأنواع البكتيرية (Koonin et al. ، 2017). ينقسم النوع III CRISPR أيضًا إلى نوعين فرعيين ، أي النوع III-A والنوع III-B ، استنادًا إلى اثنين من مؤثرات Cas الرئيسية (Cas10-Csm و Cas10-Cmr). النوع الثاني يتكون من Cas5 و Cas6 و Cas7 و Csf1. ومن المثير للاهتمام ، أن أنظمة النوع الثالث هذه لا تتطلب PAM ، وبدلاً من ذلك ، تستهدف mRNAs الوليدة والحمض النووي المقابل في المجمعات النشطة نسبيًا.

في السنوات القليلة الماضية ، تم توسيع تطبيقات تقنية CRISPR-Cas لتشمل جميع مجالات العلوم الحيوية ، بما في ذلك خطوط الخلايا البشرية والحيوانية (Belhaj et al. ، 2015) ، وكذلك الفيروسات البشرية (كل من RNA و DNA) ( حديدي وآخرون ، 2016). تتمتع تقنية كريسبر بتطبيقات واسعة تشمل إدخال و / أو حذف جزء معين من الحمض النووي ، وإدخال الطفرات الموجهة بالموقع ، والتعبير و / أو قمع الجينات ، وإعادة تشكيل الجينوم. توفر أنظمة CRISPR-Cas مزايا رائعة بما في ذلك سهولة الاستنساخ والتكلفة المنخفضة وتعدد الإرسال ، حيث يمكن استهداف مواقع متعددة في الجينوم في وقت واحد (Shin et al.، 2017 Manghwar et al.، 2019 Lee et al.، 2020). أظهرت العديد من الدراسات فعالية تقنية CRISPR-Cas نظرًا لتطبيقاتها السريعة وسهلة الاستخدام في الأنواع المتمردة ، والتي يمكن استخدامها بشكل فعال لإدخال أو إزالة جينات مختلفة (في وقت واحد) ولا تتطلب العديد من أدوات التلاعب. منذ التطبيق الأول لـ GE المستندة إلى CRISPR-Cas في المصانع في عام 2013 ، تم استخدام هذه التقنية بشكل مستمر لهندسة المقاومة ضد مجموعة متنوعة من فيروسات النبات (Scheben et al.، 2017 Vats et al.، 2019 El-Mounadi et al. ، 2020).

تم اقتراح ثلاث طرق عامة لهندسة الآليات المضادة للفيروسات باستخدام CRISPR-Cas: (1) يقوم مجمع Cas9 / sgRNA بتجنيد العناصر الوراثية الفيروسية مثل أصل النسخ المتماثل (ori) ويتجنب ارتباط البروتينات المرتبطة بالتكرار ، (2) ) يقوم مجمع Cas9 / sgRNA بتشريح الحمض النووي الفيروسي مباشرةً لمنع تكاثر الحمض النووي الفيروسي ، و (3) يحور مجمع Cas9 / sgRNA الجينوم الفيروسي في مواقع معينة من خلال الانضمام غير المتماثل (NHEJ) (Chaparro-Garcia et al. ، 2015). بالإضافة إلى Cas9 ، فإن نوكلياز Cas12a الذي تم اكتشافه مؤخرًا (يُشار إليه سابقًا باسم Cpf1) يوفر نشاط نوكلياز مزدوج باعتباره نوكلياز إندوريبوني لمعالجة الحمض النووي الريبي وباعتباره نوكلياز إندو ديوكسي ريبونوكلياز لتشريح الحمض النووي وإنتاج فواصل ds (DSB) ، على التوالي (Alok et al. ، 2020). معلم آخر في GE المستندة إلى CRISPR-Cas هو الاكتشاف الأخير لبروتين مستجيب آخر ، Cas13 ، وهو نظير RNAi في حقيقيات النوى لاستهداف جينومات RNA لفيروسات النبات بشكل مباشر (Abudayyeh et al. ، 2017). لم يتم استغلال هذا النظام حتى الآن ضد فيروسات الحمض النووي. ومع ذلك ، يمكن استخدامه لاستهداف mRNA لفيروسات الحمض النووي أثناء الإصابة (Loriato et al. ، 2020). في الفيروسات الجيمينية ، يمكن استخدام نظام CRISPR-Cas لمنع تراكم الفيروس بشكل فعال من خلال استهداف أي منطقة جينومية وتكديس sgRNAs مختلفة ضد فيروس واحد أو فيروسات متعددة وأقمار الحمض النووي المرتبطة بها (Iqbal et al.، 2016 Rahman et al.، 2017 Dahan & # x2212Meir et al.، 2018 Ali et al.، 2019 Roy et al.، 2019).

أحدثت التطورات في تقنيات NGS و GE ثورة في مجالات علم الوراثة وعلم الجينوم والبيولوجيا الجزيئية وغيرها ، بما في ذلك علم الفيروسات النباتية. ساعدت تقنيات NGS في ظهور وتطور تقنيات إسكات الجينات الحديثة وتقنيات GE ، مثل تدخل RNA (RNAi) و CRISPR-Cas ، على التوالي. في مقالة المراجعة هذه ، نناقش دور تقنيات NGS و CRISPR-Cas في علم الفيروسات النباتية.


3. الكشف عن الأحماض النووية بواسطة كريسبر كاس

تم مؤخرًا وصف مجموعة كبيرة من الطرق المختلفة القائمة على كريسبر المستخدمة للكشف عن الأحماض النووية. استخدمت التقنيات المبكرة بروتين Cas9 الكنسي لأنظمة CRISPR-Cas من النوع الثاني [52] أو بروتين Cas9 (dCas9) المعدَّل ، أو الميت ، أو بروتين Cas9 (dCas9) [53]. تمثلت القفزة الهائلة نحو تطوير التشخيصات الجزيئية المعتمدة على كريسبر في اكتشاف النشاط الجانبي للبروتين لـ Cas12 و Cas13 و Cas14 ، وهي خاصية يمكن تسخيرها لتضخيم إشارة الهدف المحددة [43]. اليوم ، تم إدخال العديد من التعديلات والتحسينات على المنصات الجزيئية المستندة إلى CRISPR والتي تعتمد على النشاط الجانبي لبروتينات CRISPR-Cas من النوع V والنوع VI ، لكن المفهوم العام لم يتغير.

حتى الآن ، يتم استخدام أنظمة CRISPR-Cas بشكل روتيني كأدوات لتحرير الجينات ، وإعادة تشكيل الإيبيجينوم ، وتنظيم نسخ الجينات ، وتصور تسلسل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية [53]. أثبت تطبيق آخر لـ CRISPR-Cas كأداة للتشخيص الجزيئي أنه ممكن فقط في السنوات الأخيرة. يبدو أن الطرق الجزيئية لاكتشاف الأحماض النووية القائمة على أنظمة CRISPR-Cas حساسة للغاية ومحددة وقادرة على اكتشاف كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي بخطوة واحدة.

3.1. الكشف عن الأحماض النووية بواسطة أنظمة كريسبر-كاس من النوع الأول

حاليًا ، هناك دراسة واحدة تُبلغ عن تطوير مقايسة تشخيص CRISPR بناءً على أنظمة I-E CRISPR. هذا الاختبار كان يسمى Cas3-Operated Nucleic Acid Detection (CONAN) [50]. أظهر يوشيمي وزملاؤه أن Cas3 يُظهر نشاطًا جانبيًا مع عدة أنواع من PAM عند التعرف على الهدف. يوفر الانقسام غير المحدد لتحقيقات الحمض النووي أحادي الجديلة عند تنشيط Cas3 وسيلة سريعة وحساسة للكشف عن الأحماض النووية. تم تطوير CONAN في شكلين ، إما مع الكشف عن الفلورسنت بواسطة قارئ الصفيحة الدقيقة أو فحص التدفق الجانبي.

3.2 الكشف عن الأحماض النووية بواسطة أنظمة كريسبر-كاس من النوع الثاني

تشانغ وآخرون. أنشأ (2017) اختبارًا تشخيصيًا يعتمد على بروتينين dCas9 مدمجين مع المجالات المنقسمة من إنزيم لوسيفيراز [54]. ينتج عن ربط بروتينين dCas9 بالحمض النووي الهدف المجاور إعادة تكوين لوسيفيراز وانبعاث إشارة الإنارة التي يمكن اكتشافها بسهولة بواسطة مقياس اللمعان. كدليل على المفهوم ، ثبت أن هذه التكنولوجيا تكتشف السل الفطري ذات نوعية عالية وحساسية عالية [54].

في عام 2017 ، قام Wang et al. طور طريقة متعددة للكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) بواسطة بروتين Cas9 الذي يستهدف الجينات الفيروسية L1 و E6 / E7 التي تم تضخيمها باستخدام PCR (ctPCR) [55]. تستخدم هذه التقنية بروتوكول اكتشاف الحمض النووي المكون من 3 خطوات: (1) تضخيم الحمض النووي باستخدام PCR (2) الانقسام النوى لأمبليكون PCR بواسطة Cas9 و (3) تضخيم الأجزاء المشقوقة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم الكشف عن منتجات PCR الناتجة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام أو التألق. وفقًا لـ Wang وزملاؤه ، تزيد هذه الطريقة من حساسية الاختبار التشخيصي وتساعد على التمييز بين سلالات HPV16 و HPV18 [55]. تمت ترقية هذا الاختبار مؤخرًا لتوفير الكشف الكمي عن HPV16 / 18 باستخدام qPCR (ctPCR3.0) [56]. هناك طريقة أخرى للاكتشاف تعتمد على Cas9 تسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي المرتبط بـ Cas9 / sgRNA [50] وتتكون من ثلاث خطوات ، وهي (1) انشقاق الحمض النووي المستهدف في موقعين بواسطة نوكلياز Cas9 الداخلي (2) الربط بين الجزيئات وداخل الجزيء للربط المشقوق. المنتجات عن طريق T4 DNA ligase و (3) تضخيم PCR للحمض النووي المرتبط. نجح CARP في اكتشاف ما لا يقل عن 0.002 & # x000a0ng من جين HPV16 L1 وتمكين التمييز المحدد للأنواع الفرعية HPV16 و HPV18.

طور باردي وزملاؤه تقنية تسمى انقسام NASBA-CRISPR (NASBACC) ، والتي تعتمد على مبدأ مستشعرات تبديل موطئ القدم وقدرة بروتين Cas9 على شق الحمض النووي المستهدف بشكل انتقائي [17]. تمثل مستشعرات تبديل موطئ القدم منظمات ريبوريغولاتر اصطناعية مبرمجة قادرة على التحكم في الترجمة عن طريق ربط RNA المشغل. Riboregulators تحمل بنية منعزلة تمنع الترجمة في رابطة الدول المستقلة عن طريق عزل موقع ربط الريبوسوم وبدء الكودون. عندما يكون منظم الريبوريتور مرتبطًا بـ RNA المشغل التكميلي ، يتم تحرير موقع ربط الريبوسوم وكودون البدء ويتم تمكين الترجمة. يتم بعد ذلك تضخيم هدف الحمض النووي الريبي بواسطة NASBA بحيث يتم نسخ RNA ذي الأهمية وربطه بـ riboregulator. يستخدم نظام التضخيم NASBA بطارية من 3 إنزيمات: النسخ العكسي ، RNase H ، و T7 بوليميريز. في طريقة NASBA ، يتم تحويل RNA الهدف إلى هجين cDNA-RNA باستخدام بادئات محددة RNase H ثم يدمر RNA في هذا الازدواج. بعد ذلك ، يتم إضافة مادة أولية إلى خليط التفاعل لإنتاج قوالب تركيبية معترف بها بواسطة T7 بوليميريز. يتم الكشف عن نتائج التفاعل عن طريق قياس الألوان [17]. تكتشف هذه التقنية بشكل فعال فيروسات زيكا وحمى الضنك بحساسية 1 & # x020133 fM.

معلم آخر في تشخيصات كريسبر كان تطوير كريسبر-تشيب [57]. تجمع رقاقة كريسبر بين مبادئ كريسبر مع ترانزستور إلكتروني مصنوع من الجرافين (طبقة واحدة من ذرات الكربون) [58]. تستخدم تقنية CRISPR-Chip بروتين dCas9 الذي يربط الحمض النووي ولكنه لا يقطعه. يتم تجميد بروتينات dCas9 على ترانزستورات الجرافين. بعد إضافة الحمض النووي المعزول من العينات البيولوجية ، يربط dCas9 الحمض النووي المستهدف ، وبالتالي يغير التوصيل الكهربائي للجرافين والخصائص الكهربائية للترانزستور. تعد شريحة CRISPR-Chip حساسة للغاية وقادرة على اكتشاف أقل من 1.7 fM من الحمض النووي المستهدف ، والإجراء سريع للغاية ، حيث يستغرق 15 & # x000a0min فقط. تم استخدام تقنية CRISPR-Chip لاكتشاف الطفرات الجينية في العينات السريرية من مرضى الحثل العضلي الدوشيني [57].

تعتبر طرق التضخيم متساوي الحرارة مهمة بشكل خاص لإجراء التشخيص الجزيئي في المناطق النائية وفي المختبرات بدون موظفين مدربين تدريباً خاصاً. تستخدم طريقة تضخيم الإزاحة بوساطة نوكلياز (CRISDA) التي يتم تشغيلها بواسطة تقنية CRISPR-Cas9 مزيجًا من تقنية CRISPR-Cas9 وطرق تضخيم متساوي الحرارة. يستخدم Cas9 Nickases (بروتينات Cas9 مع طفرة في مجال تحلل نووي واحد يجعل البروتين قادرًا على قطع خيط DNA واحد) ، وتضخيم إزاحة أحادية الخيط (SDA) لشظايا الهدف متبوعًا باكتشاف الإشارة بواسطة حمض نووي الببتيد الفلوري قياس نقطة النهاية بوساطة الغزو. يمكن قياس شدة الإشارة بواسطة مقياس التألق. تساعد تقنية CRISDA في الكشف عن الأحماض النووية المستهدفة بخصوصية 1 نيوكليوتيد [59].

وصف كوان وزملاؤه تسلسل الوفرة المنخفضة عن طريق التهجين (FLASH) ، الذي تم تطويره لاكتشاف مسببات الأمراض المقاومة للعلاج بمضادات الميكروبات [60]. يستخدم FLASH بطارية من sgRNAs جنبًا إلى جنب مع بروتينات Cas9 التي تقطع الجين محل الاهتمام إلى أجزاء صغيرة مناسبة لتسلسل الجيل التالي من Illumina. يتم حظر نهايات DNA / cDNA أولاً بواسطة الفوسفاتيز لمنع الارتباط بالمحولات المستخدمة في الخطوة التالية ثم يتم قطعها بواسطة Cas9. يتم شق الحمض النووي محلل النواة مما ينتج عنه شظايا ذات نهايات غير مسدودة وبالتالي يمكن ربطها بمحولات عالمية ، يتم تضخيمها بواسطة PCR ، وتسلسلها. أكد المؤلفون فائدة هذه التقنية في نماذج الالتهاب الرئوي الناجم عن البكتيريا موجبة الجرام بما في ذلك بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية ومسببة للملاريا المتصورة المنجلية [60] .

وبالمثل ، تجمع طريقة تفاعل التضخيم الأسي (Cas-EXPAR) التي يتم تشغيلها بواسطة CRISPR-Cas9 بين مزايا Cas9 لإدخال عمليات قطع خاصة بالموقع في الحمض النووي المستهدف مع طريقة EXPAR المتساوية مع كشف إشارة الفلورسنت [61]. مقارنة بالطرق الأخرى للتضخيم متساوي الحرارة ، مثل NASBA أو RCA أو SDA أو LAMP أو RPA ، تتميز EXPAR بكفاءة عالية نسبيًا وسرعة تضخيم المنتج. حتى الآن ، لم يتم استخدام EXPAR على نطاق واسع في التشخيص الجزيئي ، وتم تطبيقه في الغالب للكشف عن الرنا الميكروي القصير [62]. كانت هذه المنفعة المحدودة نتيجة لخاصية متأصلة في EXPAR والتي لا تسمح باستخدام تسلسل الحمض النووي الممتد ككواد أولية للتضخيم. ومع ذلك ، يمكن برمجة CRISPR-Cas9 لتقطيع جزيئات الحمض النووي إلى أجزاء قصيرة بما يكفي لتنفيذ EXPAR بنجاح. يمكن لـ SpCas9 من النوع البري أن يستهدف ويقطع جزيئات الحمض النووي المزدوجة فقط ، ولكن باستخدام ما يسمى بـ PAM-mers (قوالب الحمض النووي أحادي الجديلة المكملة للقوالب أحادية السلسلة مع تسلسل PAM) يسمح لـ SpCas9 بالتعرف على جزيئات الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي التي تقطعت بهم السبل. تبلغ الحساسية المُبلغ عنها لـ Cas-EXPAR & # x000a0

& # x000a01 amol & # x0201310 fmol ، ويتقلب حد الكشف حول 0.82 amol [61]. هذه القيم قابلة للمقارنة مع تلك التي لوحظت باستخدام تشخيص PCR. نظرًا للخصوصية العالية لـ Cas-EXPAR ، يمكن استخدام هذه التقنية للكشف عن الحمض النووي الميثلي بعد تحويل ثنائي السلفيت ، والذي يغير جميع السيتوزينات في الحمض النووي إلى اليوراسيل باستثناء السيتوزينات الميثيلية (5-ميثيل سيتوزين) ، والتي تظل سليمة. وبالتالي ، لن يتم التعرف على موقع الحمض النووي الذي يحتوي على السيتوزين المحول إلى اليوراسيل أثناء تحويل بيسلفيت بواسطة بروتين Cas9 عندما يستهدف sgRNA التسلسل الأصلي (غير المحول). نتيجة لذلك ، فإن التضخيم متساوي الحرارة لمثل هذه القوالب بواسطة EXPAR يتواصل بكفاءة منخفضة. على العكس من ذلك ، يظل 5-ميثيل سيتوزين سليمًا أثناء مواقع تحويل بيسلفيت مع 5-ميثيل سيتوزين يمكن التعرف عليه بشكل فعال وقطعه بواسطة Cas9 ، وتضخيمه بشكل فعال بواسطة EXPAR ، واكتشافه باستخدام طرق التألق التقليدية.

لتجنب استخدام العديد من نوكليازات مختلفة ، وبروتينات ملحقة ، ومسبارات فلورية باهظة الثمن ، قام وانج مع المؤلفين المشاركين [63] بدمج مقايسة الحمض النووي للتدفق الجانبي مع أداة CRISPR-Cas9. تدمج هذه التقنية ، التي يطلق عليها اختبار الحمض النووي للتدفق الجانبي CRISPR-Cas9 بوساطة (CASLFA) ، نظام CRISPR-Cas9 مع جهاز التدفق الجانبي لاكتشاف dsDNA المستهدف (الشكل 1). يتم تضخيم الهدف أولاً باستخدام PCR أو طرق التضخيم متساوي الحرارة باستخدام بادئات معالجة حيوياً ، تم تحضينها باستخدام CRISPR-Cas9 RNPs ثم يتم تقطيره على وسادة العينة. على سطح الوسادة المترافقة ، ترتبط مجسات AuNP-DNA بسقالة sgRNA المعدلة. في هذه التقنية ، يتم توسيع بنية الحلقة الجذعية لـ sgRNA عن طريق إدخال نيوكليوتيدات إضافية يتم التعرف عليها بواسطة تحقيقات AuNPs-DNA العالمية. بعد ذلك ، تتدفق الأمبليونات المعالجة بيوتينيلات المعقدة مع CRISPR-Cas9 ، إلى خط الاختبار ويتم التقاط المزيج بالكامل بواسطة الستربتافيدين. يتم تصور هذه الإشارة الملونة على خط الاختبار. عند خط التحكم ، تهجين مجسات AuNP-DNA مع الستربتافيدين المطلي مسبقًا وتنتج نطاقًا ملونًا. باختصار ، CASLFA هي طريقة بسيطة ، تتكون من خطوة تضخيم PCR / RPA مع بادئات biotinylated ومقايسة تدفق جانبي قصيرة (3 & # x020135 & # x000a0min) التي تكتشف الحمض النووي المستهدف بدقة عالية وحساسية (LOD هو & # x02248 نسخ جينية متعددة ). في الختام ، يتصور المؤلفون العديد من التحسينات التقنية في CASLFA ، مثل الكشف عن تعدد الإرسال لأهداف مختلفة من خلال إدخال مواد أولية مع تسميات مختلفة ومزيج من CALSFA مع تقنية موائع جزيئية على منصة تشخيصية متقدمة.

مخططات طريقة CASLFA للتشخيص المعتمدة على CRISPR-Cas9. (أ) هيكل جهاز التدفق الجانبي. يتكون جهاز التدفق الجانبي من وسادة عينة حيث يتم تطبيق العزل ، وسادة مترافقة مع مجسات AuNP-DNA مجمعة مسبقًا ، وخط اختبار وخط تحكم. في خط الاختبار ، تتفاعل مجمعات CRISPR-Cas مع الحمض النووي المستهدف ومسبار AuNP-DNA ، المهجنة مع منطقة الحلقة الجذعية لـ sgRNA ، مع الستربتافيدين المطلي مسبقًا في لوحة الاختبار لإنتاج إشارة مرئية. في الوقت نفسه ، تتحرك مجسات AuNP-DNA أكثر وتتفاعل مع الستربتافيدين عند خط التحكم. تحتوي مجسات AuNP-DNA على ثلاث مناطق ، وهي (1) polyA-polyT (poly A المستخدمة في وضع العلامات باستخدام Au و polyT كوصلة) (2) منطقة أرجوانية للتهجين مع المسبار المدمج في خط التحكم و (3) المنطقة الصفراء تستخدم للتهجين مع منطقة حلقة الجذعية المهندسة في sgRNA. (ب) مخططات إجراء CASLFA. يتم تضخيم الحمض النووي المعزول باستخدام البادئات المعزولة حيوياً باستخدام RPA أو PCR. يتم خلط الأمبليكون مع مجمع الكشف CRISPR-Cas9 ومسبار الحمض النووي ، وبعد فترة حضانة قصيرة ، يتم تطبيقها على جهاز التدفق الجانبي. تم إنشاء الصورة في BioRender. (لتفسير الإشارات إلى اللون في وسيلة إيضاح الشكل هذه ، تتم إحالة القارئ إلى إصدار الويب من هذه المقالة.)

3.3 الكشف عن الأحماض النووية بواسطة كريسبر-كاس من النوع الخامس والسادس

في عام 2018 ، قدم Doudna وزملاؤه منصة التشخيص CRISPR-Cas المسمى CRISPR trans الذي يستهدف نوكلياز الحمض النووي (DETECTR) (الشكل 2) [51]. تعتمد هذه الطريقة على النشاط الجانبي لبروتين Cas12a الذي يتم تنشيطه بعد التعرف على الحمض النووي الريبي المستهدف بواسطة Cas12a. أظهر المؤلفون أن بروتين Cas12a من بكتيريا Lachnospiraceae ND2006(LbCas12a) يعرض نشاطًا جانبيًا غير محدد ويحلل جميع جزيئات الحمض النووي المجاورة بعد التعرف على ssDNA أو dsDNA المستهدف. إذا تم استكمال التفاعل مع بروتين Cas12a واستهداف crRNA بواسطة مراسلي DNA أحادي الجديلة (تحقيقات) ثم اختلطوا مع العينة البيولوجية ، فإن التعرف المعتمد على crRNA للأحماض النووية المسببة للأمراض بواسطة Cas12a يؤدي إلى النشاط الجانبي الذي يدمر تحقيقات الحمض النووي. تم تصميم مجسات الحمض النووي بشكل مشابه لتحقيقات TaqMan التقليدية ، حيث يكون أحد طرفي المراسل مرتبطًا بحامل الفلور والعكس مرتبط بمخمد. يؤدي تدهور مجسات الحمض النووي إلى إطلاق الفلوروفورات وينتج عنه إشارة فلورية مستقرة وقوية يتم اكتشافها بواسطة مقياس التألق. بالإضافة إلى ذلك ، تم دمج DETECTR مع خطوة تضخيم مسبق متساوي الحرارة لإثراء تسلسل الهدف (RPA). يعزز RPA الحساسية التحليلية للاختبار التشخيصي ويساعد على تجنب الحاجة إلى معدات متطورة ومكلفة.

مخططات لمنصة التشخيص CRISPR-Cas DETECTR و OR-DETECTR. (أ) خط أنابيب DETECTR. يتم تضخيم جزيء الحمض النووي باستخدام طريقة RPA للتضخيم متساوي الحرارة متبوعة بإضافة مزيج Cas12a مع sgRNA وتحقيقات الفلورسنت. يتعرف Cas12a على الحمض النووي المستهدف ويدمر مجسات الفلورسنت عن طريق النشاط الجانبي لإنتاج إشارة الفلورسنت. (ب) خط أنابيب OR-DETECTR. يتم فصل مزيج CRISPR-Cas ومزيج RT-RPA ماديًا لتجنب فتح الأنبوب والتلوث المتبادل المحتمل للعينات. تم إنشاء الصورة في BioRender.

بروتينات متعامدة أخرى من كائنات مختلفة - AsCas12a (المكورات الحمضية sp.) ، FnCas12a (فرانسييلا نوفيسيدا) ، AaCas12b (Alycyclobacillus acidoterrestris) [43] & # x02013 تمتلك أيضًا نشاطًا إضافيًا ويمكن استخدامها لإنشاء منصات تشخيص بنفس مبدأ DETECTR.

تم استخدام DETECTR مؤقتًا للكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري والتمييز بين HPV16 و HPV18 ، أكثر أنواع فيروس الورم الحليمي البشري المؤيدة للورم. في هذا الإعداد ، تم تصميم اثنين من crRNAs لاستهداف الحلقة V شديدة التغير من جين L1 ، والتي تختلف فقط بـ 6 نيوكليوتيدات بين أنواع HPV16 و HPV18. في زراعة الخلايا ، ميز DETECTR بشكل فعال بين هذه الأنواع من فيروس الورم الحليمي البشري. في مستخلصات الحمض النووي الخام ، حدد DETECTR فيروس الورم الحليمي البشري 16 في 25 حالة من 25 حالة و HPV18 في 23 حالة من 25 حالة ، تم تحديدها مؤقتًا بواسطة PCR. والجدير بالذكر أن تحليل DETECTR يستغرق فقط 1 & # x000a0h لإكمال [51].

أيضًا في 2018 ، Doudna et al. لأول مرة تميزت عائلة متنوعة للغاية من أنظمة CRISPR-Cas المشابهة لأنظمة CRISPR-Cas من النوع V [46]. في هذا النظام ، يشق البروتين المميز Cas14 PAM بشكل مستقل جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة. مثل بروتينات Cas12 ، يُظهر Cas14 نشاطًا جانبيًا ويقطع أي جزيئات DNA مجاورة ، مما يجعل بروتينات Cas14 مفيدة في التشخيصات المستندة إلى CRISPR. على عكس Cas12 ، فإن Cas14 لديه تسامح أقل مع عدم تطابق النوكليوتيدات بين sgRNA والقالب المستهدف ، فإن تسلسل البذور الداخلي حساس جدًا لعدم تطابق النيوكليوتيدات ، مما يقلل بشكل كبير من النشاط المستهدف لـ Cas14. هذه الخاصية مفيدة لاستخدام Cas14 لاكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) في الحمض النووي. يسمح استخدام Cas14 في منصة DETECTR بتحديد SNPs في جين HERC2 البشري ، المسؤول عن تلوين العين [46].

في الآونة الأخيرة ، تم استخدام نظام النوع V CRISPR-Cas لتطوير نظام الكشف عن الطور عالي الإنتاجية والحلول للكشف عن فيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV). تصيب ASFV الخنازير الأليفة والخنازير البرية ، مما يتسبب في تفشي الأمراض على نطاق واسع مع معدل وفيات يقارب 100 ٪. ASFV هو تهديد عالمي آخر يؤثر على صناعة الأغذية والإمدادات الغذائية والتجارة الدولية. يتم تنشيط بروتينات Cas12a مع crRNAs التي تستهدف DNA ASFV وتسبب في تدهور مراسلي ssDNA الفلوري بواسطة النشاط الجانبي. قدم هذا الاختبار وسيلة لاكتشاف سريع جدًا (ضمن 2 & # x000a0h) ودقيق (حد الكشف 1 & # x000a0pM) للكشف عن ASFV ، وتمييز متواليات الحمض النووي الهدف وثيقة الصلة [64]. يزيد التضخيم متساوي الحرارة من حساسية النظام مما يتيح الكشف عن تركيزات الفيمتومولار (حد الكشف 100 fM) من الحمض النووي باستخدام مقياس التألق المصمم خصيصًا. اقتران مقايسة CRISPR-Cas12a بنظام نقطة رعاية مطور مسبقًا مع ليزر محمول ومقياس طيف صغير.

بشكل عام ، هذه التقنية مناسبة لإعدادات الموارد المنخفضة والفحص الشامل. وفقًا للمؤلفين ، فإن نظام AFSV المتقدم غير مكلف وآلي وخفيف الوزن ولا يتطلب مشغلين مهرة. يعد اكتشاف ASFV باستخدام CRISPR-Cas12a أحد الأمثلة الأولى التي تعزز وحدة تشخيصات CRISPR-Cas للعلوم البيطرية.

استفادت مجموعة أخرى من بروتين Cas12a لتطوير نظام منخفض التكلفة متعدد الأغراض (HOLMES) مدته ساعة واحدة [65]. بدلاً من التضخيم متساوي الحرارة الذي تستخدمه طريقة DETECTR لإثراء الأحماض النووية المستهدفة ، يستخدم HOLMES تفاعل البوليميراز المتسلسل. باستخدام HOLMES ، اكتشف المؤلفون فيروسات الحمض النووي مثل فيروس التهاب الدماغ الياباني وفيروس مرض Aujeszky & # x02019s في 1 & # x0201310 attomolaramounts [65]. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى تضخيم PCR تتطلب معدات باهظة الثمن وتضيف خطوة إضافية تستغرق وقتًا طويلاً.

تستخدم طريقة HOLMESv2 المعدلة التضخيم متساوي الحرارة للأحماض النووية عن طريق التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) والتعرف على قوالب الحمض النووي المستهدفة مزدوجة الشريطة أو أحادية الجديلة بواسطة بروتين Cas12b متبوعًا بتدهور مجسات الحمض النووي الفلورية أحادية السلسلة بواسطة النشاط الجانبي Cas12b [ 66]. يتم الوصول إلى ذروة نشاط الضمانات في غضون 10 & # x000a0min بعد التعرف على جزيئات الحمض النووي المستهدفة أحادية الشريطة بواسطة Cas12b ، والتحول إلى 30 & # x000a0min عندما يتعرف Cas12b على الحمض النووي مزدوج الشريطة. تشير هذه الخاصية إلى الاختلافات المعقدة بين Cas12b و Cas12a ، حيث يكون البروتين السابق أكثر نشاطًا تجاه الحمض النووي المزدوج الشريطة. Alicyclobacillus acidoterrestrisيتعرف Cas12b (AacCas12b) على الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ويقطعه مع تسلسل PAM المجاور 5 & # x002b9-TTN-3 & # x002b9 ويعرض نشاطًا جانبيًا [67]. من بين القوالب المستهدفة مع مناطق PAM المختلفة ، فقط الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل مع PAM 5 & # x002b9-TTC-3 & # x002b9 و 5 & # x002b9-TAC-3 & # x002b9 التسلسل بعد القطع ينشط النشاط الجانبي Cas12b والتدهور المرتبط بتحقيقات DNA الفلورية ، مما يشير إلى أنه لا يمكن لجميع مواقع الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي يتعرف عليها Cas12b أن تؤدي بفعالية إلى النشاط الجانبي لبروتين تحرير الجينات. عند الارتباط بالحمض النووي أحادي الجديلة ، تبين أن النشاط الجانبي لـ Cas12b مستقل عن PAM ، ويتم تنشيطه دائمًا بعد التفاعل مع هدف مناسب. كان أقل تركيز للحمض النووي المستهدف أحادي الجديلة أو مزدوج الشريطة الذي اكتشفه Cas12b حوالي 1 & # x000a0nM. يوفر الجمع بين تقنيات Cas12b و LAMP كشفًا محددًا عن أقل من 0.01 fM DNA ، وهو ما يعادل حساسية Cas12a. يسمح HOMLESv2 باكتشاف كميات التتبع لكل من DNA و RNA أيضًا ، إذا تم نسخ العزلة عكسيًا أثناء تحضير العينة. لتقليل الوقت اللازم لإجراء النسخ العكسي للـ RNA والتضخيم ، اقترح المؤلفون استخدام بوليميرات الحمض النووي مع 5 & # x002b9 & # x021923 & # x002b9 بلمرة الحمض النووي ونشاط النسخ العكسي (على سبيل المثال ، DNA polymerase Bst) [68].

في عام 2017 ، قدم Feng Zhang وزملاؤه منصة SHERLOCK (الشكل 3) ، وهي منصة تشخيصية تعتمد على نظام CRISPR-Cas من النوع VI [18] ، [69]. تستند SHERLOCK على نفس مبادئ DETECTR ، ولكنها تعتمد على نشاط نوكلياز Cas13 من ليبتوتريشيا وادي. يتعرف Cas13 بشكل خاص على الحمض النووي الريبي (RNA) ويفصله فقط ، بدلاً من الحمض النووي مثل Cas12a ، وبالتالي لا يؤدي إلى تدهور أي جزيئات RNA مجاورة على وجه التحديد. يتيح النسخ المختبري للعزلة الكشف عن أهداف الحمض النووي. يمكن استخدام تقنية RPA للتضخيم المتساوي لإثراء الجزيئات المستهدفة وزيادة الحساسية. يتم خلط شظايا الحمض النووي الريبي المضخم مع تحقيقات بروتين Cas13 crRNA و RNA الفلوري. إذا كانت الجزيئات المستهدفة موجودة في العينة ، يتعرف عليها Cas13 عبر crRNA ويشق دون تمييز (عن طريق النشاط الجانبي) مجسات RNA الفلورية ، مما يعطل التفاعل بين الفلوروفور والمخمد. وبالتالي يشير وجود وشدة إشارة الفلورسنت إلى مقدار الهدف في العينة البيولوجية. أظهر المؤلفون أن SHERLOCK يكتشف فيروس زيكا وفيروس حمى الضنك والعديد من البكتيريا المسببة للأمراض و SNPs في الحمض النووي مع حساسية أتومولار. يمكن تجميد جميع مكونات تفاعل شيرلوك بالتبريد واستخدامها بعد فترات تخزين طويلة دون التأثير على حساسية ونوعية الاختبار [18]. كان لـ SHERLOCK عيب كبير: كان نوعيًا ، وليس كميًا ، ولكن بعد عام ، قدم المؤلفون الإصدار الثاني من المنصة ، SHERLOCKv2 (الشكل 3) [70]. يمكن لـ SHERLOCKv2 اكتشاف الأهداف في وقت واحد في 4 قنوات فلورية مختلفة ، لأن بروتينات Cas13 من كائنات مختلفة - LwaCas13a (وديع)، CcaCas13b (Apnocytophaga canimorsus Cc5) ، LbaCas13a (بكتيريا L.[سلالة NK4A179]) ، و PsmCas13b (بريفوتيلا ص. MA2016)) - تدمير جزيئات الحمض النووي الريبي والحمض النووي المجاورة بشكل تفضيلي في مواقع معينة من النوكليوتيدات (AU ، UC ، AC ، و GA ، في المقابل). أظهر المؤلفون قدرة SHERLOCKv2 على اكتشاف ما يصل إلى 4 أهداف ، من خلال توليد مجسات غنية بالديوكليوتيدات المختلفة وربطها بمركبات الفلوروفور المختلفة. تقوم SHERLOCKv2 أيضًا بتقييم نوعية العينات ذات الحساسية لـ 2 أتومول ، محسّنًا لينتج عنه ارتباط قوي بين كثافة الإشارة وتركيز الهدف. تمت زيادة حساسية الإشارة بشكل كبير عن تلك الموجودة في SHERLOCK عن طريق إضافة بروتين Csm6 إلى مزيج التفاعل. يصبح تضخيم الإشارة ممكنًا لأن النشاط الجانبي لـ LwaCas13a و PsmCas13b يدمر الحمض النووي الريبي ، ويولد هيدروكسيل 5 & # x002b9-نهايات ومبلمرات متجانسة خطية من الأدينين تنتهي بـ 2 & # x002b9،3 & # x002b9-cyclic phosphates. يقوم الأخير بتنشيط Csm6 ، الذي يدمر جزيئات المسبار الجديدة ويضخم الإشارة المحددة. من خلال اختبار بروتينات Csm6 من العديد من الأنواع المختلفة ، أظهر المؤلفون أن Csm6 من المكورات المعوية المائل و اللعاب الملبنة تم تنشيطها بشكل أكثر كفاءة بواسطة نهايات الفوسفات الحلقية 2 & # x002b9،3 & # x002b9. أخيرًا ، تم تصميم SHERLOCKv2 لإنتاج قراءة لونية مرئية على شرائط التدفق الجانبي التجارية التي لا تتطلب أي معدات خاصة. في هذا الإعداد ، يتم تحديد وجود الهدف من خلال فحص الشرائط بصريًا بكثافة تلطيخ مختلفة. يتم تنفيذ تفاعل SHERLOCKv2 بالكامل في خطوة واحدة عن طريق تطبيق العينة البيولوجية مباشرة على شريط الاختبار دون تنقية وعزل الأحماض النووية. في الختام ، تعد SHERLOCKv2 منصة تشخيص كمية حساسة للغاية ومناسبة لاكتشاف الإشارات المتعددة والكشف البصري / اللوني على شرائط التدفق الجانبي [70].

مخططات منصات التشخيص CRISPR-Cas SHERLOCK / v2. خط أنابيب SHERLOCK / SHERLOCKv2. يتم تضخيم جزيئات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي متساوي الحرارة باستخدام RPA أو RT-RPA ، في المقابل. يتم نسخ الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي باستخدام تفاعل النسخ المختبري T7. يتعرف Cas13 على جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة ويشق مجسات الفلورسنت عن طريق النشاط الجانبي. يمكن استخدام تفضيلات النوكليوتيدات المختلفة لبروتينات Cas13 من أنواع مختلفة للانقسام التفضيلي لمجسات الفلورسنت في دينوكليوتيدات محددة. وبالتالي ، يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن تعدد الإرسال باستخدام مجسات مصممة. بدلاً من ذلك ، يمكن تصور نتائج التفاعل على شرائط التدفق الجانبي باستخدام تفاعل الكروموجينيك. تم إنشاء الصورة في BioRender.

تستلزم غالبية أدوات تشخيص CRISPR عدة خطوات سحب العينة ، بما في ذلك فتح أنابيب التفاعل بمنتج مضخم ومخاطر عالية لتلوث العينة. تتم معالجة هذه المشكلة بأناقة في تقنية منصة الكشف أحادية الأنبوب OR-DETECTR / OR-SHERLOCK (الشكل 2 ب) [71]. هنا ، تتم إضافة العينة المستخرجة إلى مزيج RPA في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي ، بينما يتم فصل مزيج DETECTR / SHERLOCK ماديًا على الجانب الداخلي لغطاء الأنبوب. بعد تضخيم تقنية RPA ، يتم خلط مكونات RPA ومكونات CRISPR-Cas بواسطة طرد مركزي قصير. يمكن بعد ذلك التعرف على الهدف المضخم بواسطة مجمعات CRISPR-Cas. يمكن تصور الإشارة باستخدام مقايسة التدفق الجانبي أو الفلورة.

في محاولة لتطوير اختبار وعاء واحد ، ابتكر Arizti-Sanz مع مؤلفين مشاركين إجراءً مبسطًا لتسليط الضوء على العدوى للتنقل في الأوبئة (SHINE) [72] للكشف الدقيق والمحدد عن الأحماض النووية من العينات غير المستخرجة. لقد طوروا إجراء SHERLOCK إلى تفاعل من خطوة واحدة بتركيزات مثالية من الملح الأحادي التكافؤ والمغنيسيوم والأس الهيدروجيني وتركيزات التمهيدي. على الرغم من أن الجمع بين RT-RPA و SHERLOCK يضعف بشكل كبير حساسية مقايسة الكشف عن الحمض النووي ، إلا أن إضافة RNase H عزز حساسية الاختبار عن طريق زيادة كفاءة RT. بالإضافة إلى ذلك ، فقد طوروا تطبيقًا للهواتف الذكية يضمن الاكتشاف والتفسير غير المتحيزين للمجسات المضيئة.

وبالمثل ، فإن Joung et al. [73] وصف بروتوكولًا مبسطًا للكشف عن SARS-CoV-2 في وعاء واحد يجمع بين اختبار SHERLOCK وخطوة استخراج الحمض النووي الريبي المبسطة (تركيز التحلل والخرز المغناطيسي للحمض النووي الريبي بدون خطوات غسل الإيثانول والشطف) وتضخيم متساوي الحرارة LAMP. كان من الممكن إجراء اختبار وعاء واحد باستخدام الحرارة Alicyclobacillus acidiphilus (AapCas12b) والتي يمكن أن تعمل في درجات حرارة تصل إلى 65 & # x02103. ومع ذلك ، لم يكن أداء AapCas12b جيدًا في مقايسات وعاء واحد عند 55 & # x000a0 & # x02103 وما فوق. قام Joung مع المؤلفين المشاركين بفحص 94 مادة مضافة وحددوا أن إضافة التورين يحسن حركية التفاعل. يسمى هذا البروتوكول اختبار SHERLOCK في وعاء واحد (STOP) وهو الأمثل لاكتشاف SARS-CoV-2 (STOPCovid). يمكن إجراء الاختبار على درجة حرارة واحدة (60 & # x000a0 & # x02103) في غضون ساعة. تتفوق حساسية STOPCovid على اختبار CDC RT-qPCR مع حد الكشف (LOD) و # x0224833 نسخ من الحمض النووي الريبي لكل مل. على ما يبدو ، قد يؤدي تطبيق بروتينات Cas الجديدة القابلة للحرارة مع أداء محسّن وتحسين مخاليط التفاعل إلى تحسين حساسية وسرعة وعاء واحد من تشخيصات CRISPR. في دراسة مختلفة ، تم تطوير مقايسة وعاء واحدة تسمى All-In-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) [74] للكشف السريع والمحدد عن الأحماض النووية مع الحد الأدنى من مخاطر التلوث المتبادل للأمبليكون. يحتوي AIOD-CRISPR على نظام تفاعل أحادي الوعاء يتكون من خطوة تضخيم مسبق لـ RPA ومزيج اكتشاف LbaCas12a. يتم تنفيذ جميع التفاعلات في 37 & # x02103 ، تستغرق العملية 40 & # x000a0min. AIOD-CRISPR LODs هي 1.2 نسخة من أهداف الحمض النووي و 4.6 نسخة من أهداف الحمض النووي الريبي.

قام Myhrvold وزملاؤه بإقران بروتوكول SHERLOCK بعينات تشخيصية غير مستخرجة للتسخين لطمس نوكلياز (HUDSON) ، والتي تهدف إلى اكتشاف الأحماض النووية مع تجنب الخطوة التي تستغرق وقتًا طويلاً لعزل الحمض النووي [75]. تمت إضافة بروتوكول HUDSON لإنشاء تشخيصات ميدانية قابلة للنشر ، وهي ضرورية في المناطق النائية بدون بنية تحتية متطورة وتشخيص معمل. يسلط تفشي العدوى الفيروسية مؤخرًا في إفريقيا وأمريكا الجنوبية والصين الضوء على الحاجة الملحة لتطوير اختبارات تشخيصية تتطلب الحد الأدنى من الخطوات والكواشف والمعدات. عن طريق التسخين ، وتعطيل الريبونوكلياز كيميائيًا ، وتحلل الجزيئات الفيروسية ، يسمح HUDSON بالتحليل المباشر لمسببات الأمراض الفيروسية في عينات الدم الكامل ، أو البلازما ، أو المصل ، أو البول ، أو اللعاب. يمكن استخدام HUDSON تقريبًا لأي منصة تشخيص قائمة على CRISPR ، مما يسمح بالتحليل المباشر لمسببات الأمراض الفيروسية من سوائل الجسم.

وبالمثل ، يمكن لخط أنابيب HUDSON-SHERLOCK اكتشاف عدة أهداف في عينة سريرية واحدة [75]. باستخدام عينات بيولوجية محددة مسبقًا ، أوضح المؤلفون أن الاختبار اكتشف فيروس حمى الضنك ذو الحساسية العالية (كان حد الكشف 45 نسخة من الجينوم الفيروسي في 1 & # x000a0mL من الدم الكامل ونسخة واحدة من الجينوم الفيروسي في 1 & # x000a0mL من اللعاب ) مع إجمالي وقت الاستجابة المبلغ عنه أقل من 1 & # x000a0h [75]. نظرًا لأن التنوع الفيروسي قد يؤثر على حساسية الاختبار وخصوصية الاختبار ، فقد صمم المؤلفون بعد ذلك جزيئات SHERLOCK crRNAs للتمييز بين فيروس زيكا وفيروس حمى الضنك. نجح HUDSON-SHERLOCK في تمييز 4 أنماط مصلية من فيروسات حمى الضنك وفيروس زيكا في عينات بيولوجية من مناطق مختلفة من العالم ، معظمها بخصوصية 100٪ وحساسية 100٪ واتساق 100٪ بين العينات [75].

ابتكر داي وزملاؤه نظام E-CRISPR المجهز بوحدة كشف الإشارات الكهروكيميائية باستخدام Cas12a عبر- نشاط الانقسام ومراسل ssDNA المعدل مع علامة كهروكيميائية زرقاء الميثيلين متصلة بسطح المستشعر [80]. في وجود التسلسل المستهدف ، تشق بروتينات Cas12a مراسل ssDNA-MB مما يقلل من مستوى الإشارة الكهروكيميائية التي يتم نقلها. حقق المؤلفون حساسية بيكومولار للكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري 16 والأحماض النووية بارفو B-19. علاوة على ذلك ، ابتكر المؤلفون سلسلة E-CRISPR القائمة على aptamer للكشف عن البروتين. تستخدم المنصة aptamers للبروتين المعني و Cas12a-crRNA المصمم خصيصًا لاستهداف الأبتامر. يتم تطبيق E-CRISPR لتقييم التركيز المتبقي من aptamer في العينة. أكد المؤلفون فعالية المنصة بواسطة TGF - & # x003b21 اكتشاف البروتين في العينات السريرية. وبالتالي ، يمكن استخدام تقنية E-CRISPR في مجموعة متنوعة من الأحماض النووية والبروتينات.

بالإضافة إلى E-CRISPR ، تم تصميم عدد من استراتيجيات الاختبار الجديدة الخالية من التضخيم. يستخدم اختبار CRISPR-Cas12a بوساطة الانقسام السطحي لمراسل DNA لدبابيس الشعر لاستشعار الحمض النووي الكهروكيميائي [83] مراسلين كهروكيميائيين لقصص الشعر البيني (hpDNA) مثبتين بواسطة Cas12a عند التعرف على الحمض النووي المستهدف. يغير انشقاق HpDNA الخصائص الكهروكيميائية لجهاز الاستشعار الحيوي مما ينتج عنه إشارة قوية ومحددة. مقارنةً بـ E-CRISPR ، الذي يستخدم مراسل ssDNA الخطي التقليدي كواجهة استشعار ، يتمتع hpDNA بإمكانية وصول متزايدة إلى نوكلياز Cas12a مما يحسن بشكل كبير تغيير الاستجابة الكهروكيميائية والحساسية التحليلية للطريقة. يمكن اكتشاف ما يصل إلى 30 & # x000a0pM من الحمض النووي المستهدف غير المضخم في & # x0224860 & # x000a0min.

تم استخدام ظاهرة التألق المعزز بالمعادن Au النانوية بواسطة Choi et al. [89] لتطوير اختبار خالٍ من التضخيم يعتمد على CRISPR-Cas12a. في مستشعر النانو AuNP المطور ، تم استبدال خطوة التضخيم بتحسين الإشارة عن طريق التألق المعدني المعزز لجسيمات الذهب النانوية التي تعمل بالحمض النووي. يمكن قياس الإشارة عن طريق تحليل التألق أو قياس الألوان باستخدام مقياس الضوء من 1 fM إلى 100 & # x000a0pM.

تم الإبلاغ مؤخرًا عن اختبار جديد قائم على CRISPR-Cas13 لا يحتوي على خطوة تضخيم مسبق بواسطة Fozouni مع مؤلفين مشاركين [92]. تمكن المؤلفون من زيادة تنشيط Cas13a وكثافة التألق من خلال الجمع بين عدة crRNA للهدف وقياس التألق بمرور الوقت بدلاً من مضان نقطة النهاية. يتيح الجمع بين 2 & # x020133 crRNAs اكتشاف ما لا يقل عن 30 نسخة / & # x003bcL من الهدف SARS-CoV-2 RNA. يضمن تطبيق العديد من crRNAs أيضًا خصوصية الطريقة ويزيد من فرص اكتشاف جزيئات الحمض النووي الريبي الطافرة. يستخدم هذا الاختبار كاميرا هاتف نقال مزودة بإضاءة ليزر منخفضة التكلفة ومجموعة من البصريات لاكتشاف إشارة الفلورسنت ، والأهم من ذلك أنها تترجم إشارة الفلورسنت مباشرة إلى أحمال فيروسية. من بين الأعمال المطلوبة لإدخال هذا الاختبار في الممارسة ، من الضروري إدخال بروتوكول خالٍ من الاستخراج ، وتقليل عدد الخطوات ، وتحسين الحساسية باستخدام مكونات CRISPR-Cas المحسّنة وخلائط التفاعل ، وربما تطوير مستشعر مضمن لاسلكيًا يرسل النتائج إلى الهاتف المحمول.

تم تنفيذ إستراتيجية أخرى خالية من التضخيم بواسطة Tian et al. [93] الذين طوروا مقايسة Cas13a فائقة التحديد ، وهي تفاعل من خطوة واحدة متساوي الحرارة (الشكل 4). في هذا الاختبار ، يتم احتجاز العينة المعزولة مع مزيج الكشف Cas13a في مفاعلات تشبه الخلية الحجم. يعزز حصر مزيج التفاعل التراكيز المحلية للهدف ومجمعات البروتين النووي CRISPR-Cas ويوفر & # x000a0 & # x0003e & # x000a010.000 ضعف حساسية الاختبار.يراكم التفاعل إشارة فلورية قوية في قطرة صغيرة الحجم من جزيء RNA واحد. يتم الكشف عن القطرات الدقيقة الفلورية وحسابها بواسطة الفحص المجهري الفلوري.

خط الأنابيب ومبدأ المقايسة Cas13a فائق التحديد. (أ) مخططات مقايسة Cas13a ultralocalized. يتم خلط القطيرات بحجم البيكو مع تفاعل الكشف عن الحمض النووي الريبي المستهدف و CRISPR-Cas13a. ينتج عن الإشارة الإيجابية إضاءة للقطرات التي يمكن عدها بواسطة مجهر الفلورسنت. (ب) مبدأ تأثير الحبس على التركيز المحلي للجزيئات المستهدفة. عند انخفاض الحجم التحليلي ، يزداد التركيز المحلي للجزيئات المستهدفة بشكل عكسي. تم إنشاء الصورة في BioRender.

أخيرًا ، استخدم إجراء تشخيصي CRISPR تم تطويره مؤخرًا CRISPR-ENHANCE [90] (التحليل المحسن للأحماض النووية مع ملحقات CrRNA) باستخدام crRNAs المعدلة وراثيًا مع امتدادات محددة 7-mer 3 & # x02032 تحقق حساسية أعلى بشكل ملحوظ لمقايسات CRISPR-Cas12a. أظهر Nguyen et al. ، أن تقنية CRISPR-ENHANCE يمكنها تجنب الحاجة إلى خطوة التضخيم المسبق عن طريق تعديل بسيط في crRNAs. يمكن استخدام CRISPR-ENHANCE في شكلين مختلفين: (1) فحص التدفق الجانبي و (2) فحص الفلورسنت.

تم ابتكار عدد كبير من أدوات وأساليب التشخيص الجديدة القائمة على كريسبر حتى الآن ، ولكن معظم الاختراعات المبكرة اعتمدت على أنظمة كريسبر-كاس 9 من النوع الثاني ، والتي لا تحفز بحد ذاتها إشارة قوية ومحددة تتعلق بوجود الأحماض النووية المستهدفة في العينة. بدلاً من ذلك ، استخدمت هذه التقنيات التضخيم المسبق للأحماض النووية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهو نهج يهدد المنظورات الواسعة لتشخيصات كريسبر.

تعمل الطرق الأكثر تعقيدًا ، مثل CRISDA [59] ، في ظروف متساوية الحرارة تمامًا ، ولكنها باهظة الثمن (تتطلب العديد من الإنزيمات) وتستغرق وقتًا طويلاً (إجمالي وقت الاستجابة لـ CRISDA يزيد عن 3 & # x020134 & # x000a0h). على الرغم من أنه يمكن تطبيق العديد من الطرق ، مثل FLASH [60] ، في مجالات محددة معينة من التشخيص الجزيئي ، إلا أن غالبية التقنيات المبكرة المدرجة في الجدول 2 لا تظهر أي مزايا واضحة على تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الجدول 2

أنواع أدوات التشخيص المعتمدة على CRISPR-Cas وتطبيقاتها وخصائصها.

في المقابل ، يمكن اعتبار DETECTR (الشكل 2) و SHERLOCK / SHERLOCKv2 (الشكل 3) و CRISPR-Chip اختراقات في التشخيص الجزيئي ، مما يمثل اختبارات تشخيصية مثالية تقريبًا يمكن استخدامها في ظروف متساوية الحرارة تمامًا ، مع الحد الأدنى من المعدات واليدين - على تدريب العاملين. سير عمل DETECTR و SHERLOCK / v2 موصوف في الشكل 1. من المهم بشكل خاص أن تم اعتماد SHERLOCKv2 بالفعل للكشف اللوني والمرئي لمسببات الأمراض على شرائط التدفق الجانبي ، بحيث يمكن استخدام هذه الاختبارات للفحص الشامل والتشخيص السريع في أي منطقة جغرافية تقريبًا [70]. تعمل الحساسية والنوعية العالية لأنظمة CRISPR-Cas على توسيع نطاق تطبيقها المحتمل إلى ما هو أبعد من الاكتشاف النوعي والكمي لمسببات الأمراض المختلفة إلى التنميط الجيني واكتشاف النيوكلوتايد المفرد في الجينوم البشري.

في عام 2020 ، طور أكرمان وآخرون تفاعلات الصفيف الاندماجي للتقييم المتعدد للأحماض النووية (CARMEN) جنبًا إلى جنب مع طريقة اكتشاف Cas13 (CARMEN-Cas13) (الشكل 5) [95]. يعتمد CARMEN على تقنية ميكروفلويديك التي تستخدم مجموعة من مستحلبات القطيرات مع مدخلات تضخيم PCR أو RPA ومخاليط اكتشاف CRISPR-Cas (بروتين Cas13 ، crRNAs محددة والمراسلين). يتم بعد ذلك دمج كل عينة تجريبية أو مزيج اكتشاف مع رمز لون فلورسنت قائم على المحلول يعمل كمعرف بصري.

مخططات طريقة الكشف CARMEN-Cas13. (1) تضخيم الأحماض النووية المستهدفة واستحلابها برموز الألوان. (2) توليد المستحلبات بأنظمة كشف CRISPR-Cas. (3) تجميع خليطين. (4) تحميل المستحلبات المختلطة في الرقاقة. (5) تمثيل تخطيطي لقطيرة مع جزيئات مستهدفة (قطرة عينة) وقطرة بمزيج اكتشاف CRISPR / Cas (قطرة اكتشاف CRISPR). بعد الدمج ، يتفاعل نظام CRISPR-Cas مع الجزيئات المستهدفة ، مما ينتج عنه إشارة فلورية محددة. تم إنشاء الصورة في BioRender.

ثم يتم استحلاب المحاليل ذات الترميز اللوني في زيت مفلور ، ثم يتم تجميعها وأخذ عينات منها في رقائق ميكروويل. من خلال تطبيق المجال الكهربائي ، تندمج القطيرات الموجودة في الآبار معًا لبدء تفاعلات الكشف في وقت واحد في جميع الآبار. علاوة على ذلك ، أنشأ المؤلفون مجموعة من 1050 رمزًا لونيًا قائمًا على الحلول ، وبعد ذلك ، صمموا الشريحة ذات السعة الهائلة التي تسمح بإجراء أكثر من 4500 اختبار لكل شريحة وتقليل الوقت المستغرق بشكل كبير وزيادة سعة الإنتاجية. تطابقت حساسية وخصوصية CARMEN-Cas13 مع تلك الخاصة بـ SHERLOCK. وبحسب ما ورد ، يسمح CARMEN-Cas13 بالكشف المتزامن عن 169 فيروسًا يصيب البشر ، وبالتالي يمثل منصة متعددة الإرسال للغاية للكشف السريع والحساس عن مسببات الأمراض البشرية. أظهر Ackerman et al. ، أيضًا أن CARMEN-Cas13 مكّن من تحديد الطفرات الفيروسية ذات الصلة سريريًا في شكل متعدد الإرسال ، مما يوفر تصنيفًا فرعيًا شاملاً لسلالات فيروس الإنفلونزا البشرية A واكتشاف العشرات من طفرات مقاومة العقاقير المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية. نجح CARMEN-Cas13 أيضًا في اكتشاف تسلسل زيكا.

تم تطوير العديد من اختبارات CRISPR بقراءات مختلفة لتوفير اكتشاف سريع ودقيق للأحماض النووية المسببة للأمراض. مثل هذه التقنيات التي تعتمد على نظام CRISPR-Cas الذي يسمح بالقراءة بالعين المجردة (CRISPR-Cas12a-NER [81] ، opvCRISPR [86] ، CASdetec [82]) ، باستخدام المستشعرات الحيوية الكهروكيميائية (E-CRISPR [80] ، COMET chip CRISPR مقايسة Cas13a [94] ، PGMs-CRISPR [85]) ، قياس الألوان (NASBACC [17] ، CRISPR-Cas إلى جانب الجسيمات النانوية الوظيفية للحمض النووي [89]) ، قياس الجهد (CRISPR-Chip [57]) ، الفحص المجهري الفلوري (فائق التحديد مقايسة Cas13a [93]) ، الكشف البصري عن تباين الخواص (CODA [87]) ، أجهزة قراءة الفلورسنت مثل أجهزة قياس الفلور (CARMEN [95] ، CRISPR-ENHANCE [90] ، CRISPR-FDS [84] ، CALIBURN [88] ، STOPCovid [ 73] ، CDetection [79] ، CAS-EXPAR [61]) ، الهواتف الذكية (الفحص المجهري للهاتف المحمول [92] ، تألق [72]) أو فحوصات التدفق الجانبي.

فيما يتعلق بجائحة COVID-19 المستمرة ، تمت الموافقة على أدوات التشخيص الأولى المستندة إلى CRISPR من قبل إدارة الغذاء والدواء. تم تطوير SHERLOCKv2 بواسطة Zhang et al. [70] ، [96] ، أصبح أول اختبار CRISPR يتم قبوله في الاستخدام السريري. يتضمن ثلاث خطوات ، وهي (1) تضخيم متساوي الحرارة لمدة 25 دقيقة للأحماض النووية المستخرجة بواسطة RPA ، (2) اكتشاف لمدة 30 دقيقة بواسطة Cas13 و (3) حضانة لمدة دقيقتين مطلوبة لتصور النتائج في مقابس الورق. في الآونة الأخيرة ، أبلغ Broughton et al. عن اكتشاف قائم على DETECTR لـ SARS-CoV-2 RNA من مستخلصات المسحة في غضون 30 & # x0201340 & # x000a0min مع تصور النتائج على شرائط التدفق الجانبي باستخدام جزيئات مراسل FAM-biotin [97]. قبل التفاعل ، يتم تضخيم جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة مسبقًا بواسطة تضخيم RT-LAMP متساوي الحرارة. أظهرت مقارنة مقايسة CDC qRT-PCR ومقايسة التدفق الجانبي DETECTR أن الطريقة القائمة على PCR لها أداء تحليلي لنسخة واحدة لكل & # x000b5l ، بينما بالنسبة لـ DETECTR فإنها تقدر بـ 10 نسخ لكل & # x000b5l. كانت العينات السلبية الكاذبة ممكنة في التتر الفيروسي أقل من حد الكشف عن DETECTR. كان التوافق بين اكتشاف DETECTR و PCR لـ SARS-CoV-2 95 & # x02013100 ٪. وبالمثل ، قدمت Lucia et al. ، نتائج الاكتشاف السريع والحساس للغاية والمحمول لـ SARS-CoV-2 باستخدام الطريقة القائمة على LbCa12a جنبًا إلى جنب مع التضخيم المسبق متساوي الحرارة RPA [98]. معلمات نظام الكشف التي أبلغت عنها Lucia et al. [98] ، قابلة للمقارنة مع طريقة كريسبر المستندة إلى DETECTR [97]. تم إظهار CARMEN-Cas13 لإعادة توجيهه بسرعة للأغراض ذات الصلة سريريًا [95]. على هذا النحو ، تم دمج اختبار جديد للكشف عن SARS-CoV-2 بسرعة في منصة CARMEN-Cas13 ، مما يسمح بتحليل & # x000a0 & # x0003e & # x000a0400 عينة لكل شريحة. بشكل عام ، يمكن أن تستفيد أنظمة الكشف CRISPR-Cas كثيرًا عند دمجها مع تقنية CARMEN عالية التعدد والإنتاجية.

على الرغم من أن الأعمال الموصوفة تقدم منظورات مثيرة قد تنمو لتصبح منطقة ضخمة من البحث والتشخيص الجزيئي ، إلا أن العديد من التحديات تقف في طريقها. يجب اختبار النتائج المشجعة للغاية التي توضح خصوصية وحساسية المقايسات المشابهة لـ PCR في مواقف العالم الحقيقي. قد يتم إدخال العديد من التعديلات على المقايسات الحالية لزيادة حساسية الاختبارات والوقت المطلوب لإجراء الاختبارات التشخيصية. علاوة على ذلك ، قد تكون خصوصية تشخيصات CRISPR مصدر قلق أيضًا ، حيث يمكن لبروتينات Cas أن تتسامح مع عدم تطابق النيوكليوتيدات والتعرف على القوالب غير المحددة ، مما يضر بصلاحية الفحص. كما أنه ليس من الواضح تمامًا كيف يمكن أن تكون نتائج هذه الاختبارات متناقضة عند التعامل معها من قبل أفراد مختلفين أو مع اختلاف نوعية العينات البيولوجية.


أنظمة تسبب الإصرار وموت الخلايا المبرمج

السموم - مضادات السموم

تم وصف أنظمة TA من النوع الأول والنوع الثاني في الأصل على أنها "وحدات إدمانية" مشفرة في البلازميدات وتضمن استمرارها في سلالة مضيفة بعد انقسام الخلية (103 ، 104). المكون الذيفاني لجميع أنظمة TA هو بروتين يقتل الخلايا إذا تم التعبير عنه فوق مستوى معين ، في حين أن المكون المضاد للسموم يعطل السم بشكل عكسي و / أو ينظم تعبيره ، وبالتالي يمنع قتل الخلايا. على عكس السم ، يكون مضاد السموم غير مستقر من الناحية الأيضية ، لذلك ، ما لم يتم التعبير عن الترياق بشكل مستمر ، يمكن أن يتراكم السم الحر بكميات كافية لقتل الخلية (25 ، 105-108). بمجرد تسلسل الجينومات الأولى ، أصبح من الواضح أن العديد من أنظمة TA موجودة ليس فقط في البلازميدات ولكن أيضًا على كروموسومات البكتيريا والعتائق (25 ، 107).

أثار هذا الاكتشاف المفاجئ نقاشًا حول وظائف أنظمة TA الصبغية ودفع سلسلة من الدراسات الجينومية والتجريبية المقارنة التي أدت إلى اكتشاف العشرات من أنظمة TA الجديدة. تم تلخيص هذه النتائج والأفكار الحالية حول الأدوار البيولوجية لأنظمة التحليل الفني في العديد من المراجعات الحديثة (19 ، 26 ، 109-111). باختصار ، يبدو أن أنظمة TA توفر آلية لاستمرار الخلية للتعامل مع ظروف الإجهاد المختلفة (23 ، 24 ، 111). تستهدف غالبية السموم من النوع الثاني مكونات مختلفة لأنظمة الترجمة ، وخاصة mRNA (112 ، 113) ، بينما تؤثر السموم من النوع الأول على سلامة الغشاء (114). ومع ذلك ، فقد تم تحديد أهداف أخرى للسموم أيضًا ، مثل DNA gyrase (115) وانقسام الخلايا GTPase FtsZ (116). نظرًا لأن السموم من النوع الأول لم تتورط أبدًا في مقاومة الفيروسات ولا يتم ملاحظتها كثيرًا في جزر الدفاع ، فإننا لا نعتبرها هنا. بدلاً من ذلك ، نركز على أنظمة TA من النوع الثاني ، لا سيما المتغيرات سيئة التوصيف (الجدول التكميلي S3) ، ونناقش نتائج الجهود الأخيرة لتحديد عائلات TA الجديدة باستخدام في السيليكو اقتراب.

يمكن تصنيف الأساليب الحسابية للتنبؤ بأنظمة TA الجديدة إلى ثلاث مجموعات: (1) "الشعور بالذنب بالارتباط" عندما يتم التنبؤ بوجود سم أو مضاد سم جديد بحكم الارتباط ، في الجينومات البكتيرية والبدئية ، بالجينات التي تنتمي إلى مضاد سموم معروف. أو عائلات السموم (27 ، 117) (2) تحديد أزواج الجينات ذات السمات المميزة لأنظمة TA مثل الارتباط الوثيق للجينات التي تشفر البروتينات الصغيرة ، والميل إلى HGT والوجود على البلازميدات أو داخل الجزر الجينومية مع جينات الدفاع الأخرى (5 ، 27 ) و (3) التحليل الإحصائي لاستنساخ تسلسل الجينوم الكامل الذي يهدف إلى تحديد الجينات غير القابلة للتكاثر (السامة) في بكتريا قولونية ( 118 ).

عادةً ما يتم التحقق من صحة أنظمة TA الجديدة المتوقعة تجريبياً في بكتريا قولونية من خلال اختبار القتل / الإنقاذ الذي يُتوقع فيه أن يؤدي الإفراط في التعبير عن مادة سامة إلى تثبيط نمو الخلية أو قتل الخلية ، بينما يعيد التعبير المشترك للسم ومضاد السموم النمو (117). ومع ذلك ، كشفت الدراسة الشاملة الحديثة عن العديد من الجينات التي يبدو أنها غير قابلة للاستنساخ في بكتريا قولونية ولكنها لا تفي بتعريف أنظمة TA ، بما في ذلك العديد من الإنزيمات الأيضية والجينات المعلوماتية مثل بروتينات الريبوسوم (118 ، 119). على الرغم من أن جميع هذه الجينات لا تشكل عوامل ثنائية الجين التي تعتبر نموذجية لأنظمة TA ، إلا أن هذه النتائج تشير إلى أن اختلال جرعات أو سمية ركيزة وسيطة يمكن أن تؤدي إلى سمية الجين التي يمكن تخفيفها عن طريق التنظيم المناسب أو التعبير المشترك عن طريق إنزيم باستخدام منتج سام ، يحاكي سلوك TA. وبالتالي ، فإن التنبؤ بأنظمة TA الجديدة من النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النهج يتطلب الحذر ويجب أن يتضمن تقييم الوظائف المعروفة والمتوقعة والتنظيم التشغيلي للجينات المرشحة. العديد من أنظمة TA التي تم التحقق من صحتها تجريبياً (مثل GinA و GinC) لا تشكل بشكل تطوري اثنين من العوامل الجينية المحفوظة ، مما يشير إلى أنماط من الإجراءات تختلف عن آلية مضاد السموم النموذجية (120). على سبيل المثال ، GinA ، وهو متماثل قريب من بروتين Gam Mu host-nuclease المانع للعاثية ، والذي يمنع ارتباط RecBCD بنهايات dsDNA (121) ، وغالبًا ما يرتبط `` مضاد السموم '' Sak ، وهو بروتين صلب أحادي الخيط (122). إلى الإنزيمات الأخرى المشاركة في إعادة التركيب والإصلاح (120). وفقًا لذلك ، يبدو على الأرجح أن GinA و GinC متورطان في الوظائف المتعلقة بالإصلاح أيضًا. تشير هذه المضاعفات المرتبطة بتفسير الذنب من خلال تنبؤات الارتباط وتجارب التحقق القياسية إلى الحاجة إلى مناهج تجريبية إضافية لتحديد ما إذا كانت بعض الأنظمة التي تم تحديدها مؤخرًا هي أنظمة TA حسنة النية.

يتم إعطاء أمثلة إضافية لأنظمة TA سيئة الوصف (المتوقعة) في الجدول التكميلي S3. أحد أكثر أنظمة TA المتوقعة وفرة ، وهو شائع بشكل خاص في العتائق شديدة الحرارة ، يتكون من بروتين يحتوي على مجال HEPN وهو الحد الأدنى من nucleotidyltransferase (MNT). من بين المكونين لنظام TA هذا ، من المحتمل أن يكون بروتين مجال HEPN هو السم (118) الذي يُتوقع أن يعمل بمثابة RNAse ربما يستهدف RNA أثناء الترجمة (54 ، 55) ، في حين أن MNT هو مضاد السم. على الرغم من أن وحدة HEPN-MNT تشترك في جميع الخصائص النموذجية لأنظمة TA (27) ، فإن الآلية الجزيئية لهذا النظام ، وخاصة دور نشاط nucleotidyltransferase لمضاد السموم ، لا تزال غير واضحة. تنتمي بروتينات HEPN في هذه الأنظمة إلى مجموعتين ، إحداهما ممثلة بشكل مفرط في الحرارة والأخرى في mesophiles (27). غالبًا ما يتم دمج نطاقي HEPN و MNT مع بعضهما البعض ، وهذا ليس نموذجيًا لأزواج TA الأخرى. علاوة على ذلك ، فإن paRep1 / paRep8 ( البيروبكولوم ايروفيلوم عائلة مكررة) عائلة نطاقات HEPN ، والتي يتم تمثيلها بشكل حصري تقريبًا في الحرارة ويتم توسيعها بشكل خاص في crenarchaea ، لا ترتبط بـ MNT لذلك ، يبقى أن نحدد ما إذا كانت هذه البروتينات هي سموم من عائلة متميزة من أنظمة TA باستخدام لا يزال غير معروف مضاد السم.

نظام مكونان آخران يكون فيه أحد البروتينات عبارة عن nucleotidyltransferase متوقع هو DUF1814-COG5340. تم اكتشاف أكثر من 700 حالة من هذا النظام في 430 جينومًا متسلسلًا لمعظم السلالات الرئيسية من العتائق والبكتيريا بما في ذلك العديد من أنواع الميكوبلازما ذات الجينوم الصغير. تم إثبات تناظر عائلة DUF1814 مع عائلات ABI AbiG (123) وعائلات AbiE (124) (5). ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يبدو أن nucleotidyltransferase (DUF1814) يعمل كسم ، في حين أن بروتين COG5340 الذي يحتوي على مجال HTH متوقع هو الترياق المضاد للسموم [(5) ، انظر أيضًا الجدول التكميلي S4]. يبدو أن كلا نظامي ABI يعملان في مرحلة تكرار الحمض النووي للعاثية ، لكن آلياتهما الجزيئية تظل غير معروفة (22).

هناك توكسين جديد مفترض آخر هو COG2856 ، وهو بروتياز من عائلة ميتزينسين مرتبط بمضاد محتمل للسموم ، وهو بروتين مجال HTH لعائلة Xre ، وغالبًا ما يندمج مع البروتياز (125). هذه الأوبرا المفترضة وفيرة في الجينوم البكتيري والبدئي ، العاثيات والبلازميدات ، مع تمددات خاصة بالنسب في العديد من البكتيريا. ومن المثير للاهتمام ، في البكتيريا Deinococcus radiodurans ، جين COG2856 ( آر إي ) هو أحد المحددات الرئيسية لمقاومة الإشعاع (126).

يؤدي التحليل الجيني المقارن الشامل للتوزيع والتواجد المشترك للعائلات المعروفة والمتوقعة من السموم ومضادات السموم إلى الاستنتاجات الرئيسية التالية:

تتناسب وفرة أنظمة TA في الجينوم بشكل فائق مع حجم الجينوم (5 ، 27).

حتى الآن ، لم يتم اكتشاف أي أنظمة TA في معظم المتعايشين الداخليين ، وبين العتائق ، في ثيرموبلازما ، والعديد من الميثانوتروف مع جينومات صغيرة ، والأركون التكافلي الوحيد المعروف ، Nanoarchaeum equitans ( 27 , 117 , 127 , 128 ).

من الواضح أن توزيع أنظمة التحليل الفني عبر الشعب غير منتظم ، مع وجود العديد من الأنظمة ممثلة بشكل زائد أو ناقص في مختلف الأصناف (27 ، 117).

يُظهر التواجد الجيني لأنظمة TA تباينًا استثنائيًا حتى في الجينومات وثيقة الصلة (27 ، 117).

أنظمة TA عرضة لـ HGT ويمكن اعتبارها جزءًا من Mobilome بدائية النواة (27).

تحتوي شبكة الارتباطات بين عائلات مختلفة من السموم ومضادات السموم على مكون عملاق متصل وعدد قليل من الأنظمة المعزولة (الشكل 5). يرجع وجود مثل هذه الشبكة المتصلة بقوة إلى نمطية أنظمة TA حيث يمكن أن يكون للسموم ومضادات السموم عادة أكثر من شريك واحد. المحاور الرئيسية لشبكة أنظمة TA هي السموم PIN و RelE ومضادات السموم RHH و Xre (الشكل 5) (27).

يشير الانتشار المرتفع للسموم المستقلة والجينات المضادة للسموم (& gt50٪ من الجينات في العائلات الكبيرة لا تنتمي إلى أزواج TA) في العابرة التفاعل بين السموم ومضادات السموم التي لا يزال يتعين اكتشافها تجريبياً (27 ، 117 ، 128).

رسم بياني شبكي للعلاقات بين عائلات السموم ومضادات السموم المختلفة. السموم المعروفة والمتوقعة (الأرجواني) (الدوائر الحمراء) ومضادات السموم (الدوائر الزرقاء) ومنظمات الأوبرا الخاصة بهم. تربط الحواف الجينات بخمسة أو أكثر من العوامل المكونة من عنصرين والتي حددت أن سمك الحافة يتناسب مع وفرة المشغل المعني.

رسم بياني شبكي للعلاقات بين عائلات السموم ومضادات السموم المختلفة. السموم المعروفة والمتوقعة (الأرجواني) (الدوائر الحمراء) ومضادات السموم (الدوائر الزرقاء) ومنظمات الأوبرا الخاصة بهم.تربط الحواف الجينات بخمسة أو أكثر من العوامل المكونة من عنصرين والتي حددت أن سمك الحافة يتناسب مع وفرة المشغل المعني.

مجتمعة ، تشير كل هذه النتائج إلى أن أنظمة TA تتكون من شبكة معقدة للغاية ومتعددة الاستخدامات وبالتأكيد لم يتم التحقيق فيها بشكل كامل من العناصر المتنقلة "شبه الأنانية" التي تتخلل عالم بدائية النواة. يبدو أن الدور الرئيسي لأنظمة TA في البكتيريا والعتائق هو تحريض السكون أو موت الخلايا المبرمج استجابة للإجهاد ، وخاصة عدوى الفيروس. ومع ذلك ، من المستحيل حاليًا استبعاد أن أنظمة TA تؤدي وظائف خلوية إضافية.

أنظمة ABI (استبعاد العاثيات)

تمثل أنظمة ABI (استبعاد العاثيات) مجموعة أخرى واسعة الانتشار من آليات الدفاع التي تلغي عدوى الفيروس في مراحل مختلفة ، غالبًا عن طريق التسبب في موت الخلية المصابة (21 ، 22). علاوة على ذلك ، فإن بعض أنظمة ABI عبارة عن وحدات مكونة من عنصرين مع جميع خصائص أنظمة TA (مثل أنظمة Type III TA المذكورة أعلاه). تم التعرف على العديد من أنظمة ABI بالطرق الجينية في بكتيريا حمض اللاكتيك و بكتريا قولونية ، ولكن بالنسبة لعدد قليل منهم فقط ، تُعرف الآلية الجزيئية (21). يلخص الجدول التكميلي S4 بإيجاز المعلومات المتاحة عن هذه الأنظمة مع نتائج التحليل الحسابي الذي يمكن أن يساعد في مزيد من الدراسة التجريبية. تشير هذه النتائج إلى مشاركة واسعة النطاق بين أنظمة ABI و TA وتدعم الملاحظة التي مفادها أن معظم أنظمة كلا الفئتين تعمل عن طريق تحفيز موت الخلية أو السكون. على سبيل المثال ، من المتوقع أن يعمل نظام AbiG المكون من عنصرين والمذكور أعلاه كنظام TA (5). تنتمي العديد من بروتينات ABI أو مجالات العائلة الفائقة بما في ذلك AbiD و AbiF و AbiJ و AbiU2 و AbiV والمجال الطرفي C لـ AbiA إلى HEPN endoribonuclease ومن المتوقع أن تستهدف نظام الترجمة (54). من المتوقع أيضًا أن يكون مجال HEPN مسؤولاً عن نشاط anticodon tRNase لـ PrrC و RloC [(54) ، الشكل 6]. AbiI ، nuclease ribonuclease H superfamily nuclease ، لديه إمكانات مماثلة. غالبًا ما تتسبب العديد من أنظمة ABI الغشائية في تسرب الغشاء بشكل مشابه لأنظمة Type I TA (129 ، 130). غالبًا ما ترتبط العديد من أنظمة ABI بما في ذلك AbiU1 و AbiL و AbiR وقد تتفاعل مع أنظمة R-M (5 ، 131). أخيرًا ، هناك ارتباط قوي بالعناصر المتنقلة من خلال مجال النسخ العكسي لبروتينات AbiA و AbiK (132) ، على الرغم من أنه ، على عكس النسخ العكسي النموذجي ، يحفز AbiK التوليف غير النموذجي لتسلسل الحمض النووي العشوائي الذي يظل مرتبطًا تساهميًا بالبروتين ويساهم إلى ABI (133).

أمثلة لمواقع الجينوم التي تشفر أنظمة مناعة مختلفة وتحتوي على مجالات HEPN و PD- (D / E) xK. تم تصوير الجينات على شكل أسهم كتلة ملونة. يظهر مجال HEPN بشكل أخضر فاتح مع مخطط أحمر. يظهر المجال PD- (D / E) xK (يشبه RecB) بشكل أصفر مع مخطط أحمر. HEPN ، مجال ربط نيوكليوتيدات بدائيات النوى أعلى ، توقع إندوريبونوكلياز (54) Sir2 ، ParB و PD- (D / E) xK ، DEDD هي نوكليازات من عائلات فائقة متميزة. تتبع أسماء الجينات CRISPR-Cas التسمية والتصنيف من (18) اسمًا من R-M تتبع التسمية والتصنيف من (38). ( أ ) جمعيات مجال HEPN. ( ب ) PD- (D / E) جمعيات مجال xK.

أمثلة لمواقع الجينوم التي تشفر أنظمة مناعة مختلفة وتحتوي على مجالات HEPN و PD- (D / E) xK. تم تصوير الجينات على شكل أسهم كتلة ملونة. يظهر مجال HEPN بشكل أخضر فاتح مع مخطط أحمر. يظهر المجال PD- (D / E) xK (يشبه RecB) بشكل أصفر مع مخطط أحمر. HEPN ، مجال ربط نيوكليوتيدات بدائيات النوى أعلى ، توقع إندوريبونوكلياز (54) Sir2 ، ParB و PD- (D / E) xK ، DEDD هي نوكليازات من عائلات فائقة متميزة. تتبع أسماء الجينات CRISPR-Cas التسمية والتصنيف من (18) اسمًا من R-M تتبع التسمية والتصنيف من (38). ( أ ) جمعيات مجال HEPN. ( ب ) PD- (D / E) جمعيات مجال xK.

تأتي أنظمة ABI -30 المعروفة حاليًا من كائنين نموذجيين فقط ، مما يشير إلى أنها تمثل جزءًا صغيرًا فقط من التنوع الكلي لهذا النوع من وحدات الدفاع في البكتيريا والعتائق. في الواقع ، يكشف تحليل الجزر الدفاعية المختارة عن العديد من عائلات الجينات غير المميزة التي يمكن أن تكون مرشحة لأنظمة الدفاع الشبيهة بـ ABI (5).


الملخص

ارتفعت الأبحاث حول تكاثر الطحالب والبكتيريا الزرقاء الضارة (HABs و CHABs) بشكل كبير بسبب زيادة توزيعها وتواترها وشدتها على مستوى العالم. تعرض هذه الإزهار للخطر الصحة العامة ووظيفة النظام البيئي والاستدامة ويمكن أن يكون لها آثار اقتصادية سلبية. تم إنشاء العديد من برامج المراقبة باستخدام المجهر الضوئي والكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بمقياس الطيف الكتلي (LC-MS) و ELISA والقياس الطيفي لمراقبة تفشي HABs / CHABs. في الآونة الأخيرة ، تم دمج الأساليب الجزيئية القائمة على الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في هذه البرامج لاستبدال أو استكمال الطرق التقليدية من خلال تحليل الحمض النووي البيئي والحمض النووي الريبي (eDNA / eRNA) بتقنيات مثل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) ، التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ) ، ومقايسة تهجين شطيرة (SHA) ، وطرق التضخيم متساوي الحرارة ، والمصفوفات الدقيقة. وقد مكّن ذلك من اكتشاف الأنواع النادرة أو الخفية ، وتحسين إنتاجية العينات ، وخفض التكاليف والحاجة إلى الخبرة التصنيفية المرئية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها قيود ، مثل الحاجة إلى استثمار رأسمالي كبير في المعدات أو عدم اليقين في الكشف ، بما في ذلك تحديد ما إذا كانت الكائنات الحية قابلة للحياة. في هذه المراجعة ، نناقش إمكانات تقنية التشخيص الجزيئي المطورة حديثًا استنادًا إلى تكرارات متناظرة قصيرة متباعدة ومتباعدة بانتظام / بروتينات Cas (CRISPR / Cas) ، والتي تستخدم أنظمة المناعة التكيفية بدائية النواة للبكتيريا والعتائق. يمكن للمنصات المستندة إلى Cas12 و Cas13 اكتشاف كل من DNA و RNA بحساسية أتومولار في غضون ساعة. تعد تقنية CRISPR / Cas التشخيصية تقنية سريعة وغير مكلفة ومحددة وحساسة للغاية ، والتي ، مع بعض التطوير الإضافي ، ستوفر العديد من المنصات الجديدة التي يمكن استخدامها في عمليات المراقبة الحيوية والبحوث الخاصة بـ HABs / CHABs.


Cobián Güemes AG، Youle M، Cantú VA، Felts B، Nulton J، Rohwer F. الفيروسات كفائزين في لعبة الحياة. Annu Rev Virol. 20163 (1): 197-214. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-100114-054952.

Reyes A و Haynes M و Hanson N و Angly FE و Heath AC و Rohwer F و Gordon JI. الفيروسات في الميكروبات البرازية للتوائم أحادية الزيجوت وأمهاتهم. طبيعة سجية. 2010466 (7304): 334–8. https://doi.org/10.1038/nature09199.

Breitbart M ، Hewson I ، Felts B ، Mahaffy JM ، Nulton J ، Salamon P ، Rohwer F. تحليلات Metagenomic لمجتمع فيروسي غير مثقف من براز الإنسان. J باكتيريول. 2003185 (20): 6220-3. https://doi.org/10.1128/JB.185.20.6220-6223.2003.

Koonin EV و Dolja VV و Krupovic M و Varsani A و Wolf YI و Yutin N و Zerbini FM و Kuhn JH. منظمة عالمية و Megataxonomy مقترح لعالم الفيروسات. ميكروبيول مول بيول القس .202084 (2): e00061–19.

Barr JJ و Auro R و Furlan M و Whiteson KL و Erb ML و Pogliano J و Stotland A و Wolkowicz R و Cutting AS و Doran KS و Salamon P و Youle M و Rohwer F. حصانة. بروك ناتل أكاد علوم. 2013110 (26): 10771–6. https://doi.org/10.1073/pnas.1305923110.

Roach DR، Leung CY، Henry M، Morello E، Singh D، Di Santo JP، Weitz JS، Debarbieux L. يعد التآزر بين الجهاز المناعي المضيف والعاثية أمرًا ضروريًا لنجاح العلاج بالعاثيات ضد مسببات الأمراض التنفسية الحادة. ميكروب مضيف الخلية. 201722 (1): 38-47.e34.

Moreno-Gallego JL، Chou S-P، Di Rienzi SC، Goodrich JK، Spector TD، Bell JT، Youngblut ND، Hewson I، Reyes A، Ley RE. يرتبط التنوع الفيروسي بتنوع الميكروبيوم المعوي في التوائم أحادية الزيجوت البالغة. ميكروب مضيف الخلية. 201925 (2): 261-272.e265.

Gogokhia L ، Buhrke K ، Bell R ، Hoffman B ، Brown DG ، Hanke-Gogokhia C ، Ajami NJ ، Wong MC ، Ghazaryan A ، Valentine JF ، et al. يرتبط توسع العاثيات بتفاقم التهاب الأمعاء والتهاب القولون. ميكروب مضيف الخلية. 201925 (2): 285-299 هـ 288.

Waller AS ، Yamada T ، Kristensen DM ، Kultima JR ، Sunagawa S ، Koonin EV ، Bork P. ISME J. 20148 (7): 1391-402. https://doi.org/10.1038/ismej.2014.30.

مينوت S ، بريسون أ ، شهود سي ، وو جي دي ، لويس جيه دي ، بوشمان فد. التطور السريع لفيروم الأمعاء البشرية. بروك ناتل أكاد علوم. 2013110 (30): 12450-5. https://doi.org/10.1073/pnas.1300833110.

Shkoporov AN ، Clooney AG ، Sutton TDS ، Ryan FJ ، Daly KM ، Nolan JA ، McDonnell SA ، Khokhlova EV ، Draper LA ، Forde A ، et al. إن القناة الهضمية البشرية متنوعة للغاية ومستقرة ومخصصة للفرد. ميكروب مضيف الخلية. 201926 (4): 527-541 ، 525.

Casjens SR ، Gilcrease EB. تحديد استراتيجية تغليف الحمض النووي عن طريق تحليل نهاية الكروموسومات في فيريونات الجراثيم الذيل. في: البكتيريا: الأساليب والبروتوكولات ، المجلد 2 ، الجوانب الجزيئية والتطبيقية. حرره كلوكي إم أر جيه ، كروبنسكي آم. توتوا ، نيوجيرسي: هيومانا برس 2009: 91-111.

Al-Shayeb B و Sachdeva R و Chen L-X و Ward F و Munk P و Devoto A و Castelle CJ و Olm MR و Bouma-Gregson K و Amano Y et al. مجموعات من العاثيات الضخمة من جميع أنحاء النظم البيئية للأرض. طبيعة سجية. 2020578 (7795): 425-31. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2007-4.

Shkoporov AN و Ryan FJ و Draper LA و Forde A و Stockdale SR و Daly KM و McDonnell SA و Nolan JA و Sutton TDS و Dalmasso M et al. بروتوكولات قابلة للاستنساخ للتحليل الميتاجينومي للعاثيات البراز البشرية. ميكروبيوم. 20186 (1): 68. https://doi.org/10.1186/s40168-018-0446-z.

أنتيبوف د ، رايكو م ، لابيدوس أ ، بيفزنر با. كشف وتجميع البلازميد في مجموعات البيانات الجينومية والميتاجينومية. الدقة الجينوم. 201929 (6): 961–8. https://doi.org/10.1101/gr.241299.118.

أنتيبوف د ، رايكو م ، لابيدوس أ ، بيفزنر با. metaviralSPAdes: تجميع الفيروسات من البيانات الميتاجينومية. المعلوماتية الحيوية. 202036 (14): 4126–9. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btaa490.

جدعون س ج ، رايت أ. فصل الحمض النووي في البكتيريا. Annu Rev Microbiol. 200054 (1): 681-708.

De Sordi L، Lourenço M، Debarbieux L. المعركة داخل: تفاعلات العاثيات والبكتيريا في الجهاز الهضمي. ميكروب مضيف الخلية. 201925 (2): 210–8. https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.01.018.

Beller L، Matthijnssens J. ما هو (غير معروف) عن ديناميكيات القناة الهضمية البشرية في الصحة والمرض. العملة Opin Virol. 201937: 52-7. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2019.05.013.

Simmonds P، Adams MJ، Benkő M، Breitbart M، Brister JR، Carstens EB، Davison AJ، Delwart E، Gorbalenya AE، Harrach B، Hull R، King AMQ، Koonin EV، Krupovic M، Kuhn JH، Lefkowitz EJ، Nibert ML ، Orton R ، Roossinck MJ ، Sabanadzovic S ، Sullivan MB ، Suttle CA ، Tesh RB ، van der Vlugt RA ، Varsani A ، Zerbini FM. تصنيف الفيروسات في عصر الميتاجينوميات. نات ريف ميكروبيول. 201715 (3): 161–8. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.177.

Lu S و Wang J و Chitsaz F و Derbyshire MK و Geer RC و Gonzales NR و Gwadz M و Hurwitz DI و Marchler GH و Song JS et al. CDD / SPARCLE: قاعدة بيانات المجال المحفوظة في عام 2020. الأحماض النووية الدقة. 201948 (D1): D265–8.

Yutin N و Benler S و Shmakov SA و Wolf YI و Tolstoy I و Rayko M et al. يكشف تحليل الجينومات الفيروسية المجمعة من الميتاجينوم من الأمعاء البشرية عن عاثيات افتراضية متنوعة تشبه CrAss بسمات جينومية فريدة. نات كومون. 202112: 1044

حياة د ، تشين جي إل ، لوكاشيو بي إف ، لاند إم إل ، لاريمر أف دبليو ، هاوزر إل جي. الضال: التعرف على الجينات بدائية النواة وتحديد موقع بدء الترجمة. المعلوماتية الحيوية BMC. 201011 (1): 119. https://doi.org/10.1186/1471-2105-11-119.

Lowe TM ، Eddy SR. tRNAscan-SE: برنامج لتحسين الكشف عن نقل جينات الحمض النووي الريبي في التسلسل الجيني. الدقة الأحماض النووية. 199725 (5): 955–64. https://doi.org/10.1093/nar/25.5.955.

Devoto AE و Santini JM و Olm MR و Anantharaman K و Munk P و Tung J و Archie EA و Turnbaugh PJ و Seed KD و Blekhman R و Aarestrup FM و Thomas BC و Banfield JF. تصيب Megaphages بريفوتيلا ، وتنتشر المتغيرات في ميكروبات الأمعاء. نات ميكروبيول. 20194 (4): 693-700. https://doi.org/10.1038/s41564-018-0338-9.

إيفانوفا إن إن ، شوينتيك ف ، تريب إتش جيه ، رينك سي ، باتي إيه ، هانتيمان إم ، فيسيل إيه ، وويكي تي ، كيربيديس إن سي ، روبين إم. أوقف عمليات إعادة تعيين الكودون في البرية. علم. 2014344 (6186): 909-13. https://doi.org/10.1126/science.1250691.

Auslander N ، Gussow AB ، Benler S ، Wolf YI ، Koonin EV. الباحث: تحديد الجينومات العاثية بدون محاذاة عن طريق التعلم العميق. أبحاث الأحماض النووية 202048 (21): e121-e121

Kans J. Entrez direct: أدوات مساعدة إلكترونية على سطر أوامر Unix. بيثيسدا: المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية 2010.

أولم إم آر ، براون سي تي ، بروكس ب ، بانفيلد جي. dRep: أداة للمقارنات الجينية السريعة والدقيقة التي تمكن من تحسين استعادة الجينوم من metagenomes من خلال إلغاء التكرار. ISME J. 201711 (12): 2864–8. https://doi.org/10.1038/ismej.2017.126.

Ondov BD ، Starrett GJ ، Sappington A ، Kostic A ، Koren S ، Buck CB ، Phillippy AM. شاشة الهريس: تقدير احتواء تسلسل عالي الإنتاجية لاكتشاف الجينوم. جينوم بيول. 201920 (1): 232. https://doi.org/10.1186/s13059-019-1841-x.

جاين سي ، رودريغيز- آر إل إم ، فيليبي إيه إم ، كونستانتينيديس كي تي ، ألورو إس.تحليل ANI عالي الإنتاجية لجينومات بدائية النواة 90 ألفًا يكشف عن حدود واضحة للأنواع. نات كومون. 20189 (1): 5114. https://doi.org/10.1038/s41467-018-07641-9.

Steinegger M، Söding J. تجميع مجموعات متوالية بروتينية ضخمة في وقت خطي. نات كومون. 20189 (1): 2542. https://doi.org/10.1038/s41467-018-04964-5.

Altschul SF ، Madden TL ، Schäffer AA ، Zhang J ، Zhang Z ، Miller W ، Lipman DJ. Gapped BLAST و PSI-BLAST: جيل جديد من برامج البحث في قواعد بيانات البروتين. الدقة الأحماض النووية. 199725 (17): 3389-402. https://doi.org/10.1093/nar/25.17.3389.

Wolf YI و Kazlauskas D و Iranzo J و Lucía-Sanz A و Kuhn JH و Krupovic M و Dolja VV و Koonin EV. أصول وتطور فيروم الحمض النووي الريبي العالمي. مبيو. 20189 (6): e02329–18.

إدغار آر سي. العضلات: محاذاة تسلسل متعدد بدقة عالية وإنتاجية عالية. الدقة الأحماض النووية. 200432 (5): 1792-7. https://doi.org/10.1093/nar/gkh340.

Steinegger M ، Meier M ، Mirdita M ، Vöhringer H ، Haunsberger SJ ، Söding J. HH-suite3 لاكتشاف التماثل عن بُعد السريع والتعليق التوضيحي العميق للبروتين. المعلوماتية الحيوية BMC. 201920 (1): 473. https://doi.org/10.1186/s12859-019-3019-7.

Yutin N ، Makarova KS ، Mekhedov SL ، Wolf YI ، Koonin EV. الجذور البدائية العميقة لحقيقيات النوى. مول بيول إيفول. 200825 (8): 1619–30. https://doi.org/10.1093/molbev/msn108.

السعر MN، Dehal PS، Arkin AP. FastTree 2 - أشجار ذات احتمالية قصوى تقريبًا للمحاذاة الكبيرة. بلوس واحد. 20105 (3): e9490. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009490.

بن جانغ هـ ، بولدوك ب ، زابلوكي أو ، كون جيه إتش ، رو إس ، أدريانسنس إم ، بريستر جيه آر ، كروبنسكي آم ، كروبوفيتش إم ، لافين آر ، تيرنر د ، سوليفان إم بي. يتم تمكين التخصيص التصنيفي لجينومات فيروس بدائية النواة غير المزروعة من خلال شبكات مشاركة الجينات. Nat Biotechnol. 201937 (6): 632-9. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0100-8.

Shannon P، Markiel A، Ozier O، Baliga NS، Wang JT، Ramage D، Amin N، Schwikowski B، Ideker T. Cytoscape: بيئة برمجية للنماذج المتكاملة لشبكات التفاعل الجزيئي الحيوي. الدقة الجينوم. 200313 (11): 2498-504. https://doi.org/10.1101/gr.1239303.

Mirdita M ، von den Driesch L ، Galiez C ، Martin MJ ، Söding J ، Steinegger M. قواعد بيانات Uniclust لتسلسلات ومحاذاة البروتين المجمعة والمفصلة بعمق. الدقة الأحماض النووية. 201645 (D1): D170–6. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1081.

أيها Y. تحديد العناصر الرجعية المولدة للتنوع في الميكروبيوم البشري. علوم Int J Mol. 201415 (8): 14234–46.

لانجميد ب ، سالزبيرج سي. محاذاة سريعة للقراءة مع Bowtie 2. طرق Nat. 20129 (4): 357–9. https://doi.org/10.1038/nmeth.1923.

Chen S و Zhou Y و Chen Y و Gu J. fastp: معالج مسبق سريع الكل في واحد FASTQ. المعلوماتية الحيوية. 201834 (17): i884–90. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty560.

شماكوف سا ، سيتنيك الخامس ، ماكاروفا كانساس ، وولف يي ، سيفيرينوف ك في ، كونين إي في. تهيمن على فضاء المباعد CRISPR تسلسلات من الموصلات الخاصة بالأنواع. مبيو. 20178 (5): e01397–17.

شماكوف سا ، وولف يي ، سافيتسكايا إي ، سيفرينوف ك في ، كونين إي في. يكشف رسم خرائط فضاء كريسبر عن فيروسات واسعة خاصة بالمضيف من بدائيات النوى. كومون بيول. 20203 (1): 321. https://doi.org/10.1038/s42003-020-1014-1.

Morgulis A، Coulouris G، Raytselis Y، Madden TL، Agarwala R، Schäffer AA. فهرسة قاعدة البيانات لعمليات البحث MegaBLAST الإنتاج. المعلوماتية الحيوية. 200824 (16): 1757–64. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btn322.

Gussow AB ، Park AE ، Borges AL ، Shmakov SA ، Makarova KS ، Wolf YI ، Bondy-Denomy J ، Koonin EV. يوسع نهج التعلم الآلي ذخيرة عائلات البروتين المضادة لـ CRISPR. نات كومون. 202011 (1): 3784. https://doi.org/10.1038/s41467-020-17652-0.

Luque A ، Benler S ، Lee DY ، Brown C ، White S. لاقمات الذيل المفقودة: التنبؤ بمرشحات قفيصة صغيرة. الكائنات الدقيقة. 20208 (12): 1944. https://doi.org/10.3390/microorganisms8121944.

Soto-Perez P ، Bisanz JE ، Berry JD ، Lam KN ، Bondy-Denomy J ، Turnbaugh PJ. يكشف نظام CRISPR-Cas لبكتيريا الأمعاء البشرية السائدة عن استهداف مفرط ضد العاثيات في كتالوج الفيروس البشري. ميكروب مضيف الخلية. 201926 (3): 325-335. e325.

Hynes AP ، Rousseau GM ، Agudelo D ، Goulet A ، Amigues B ، Loehr J ، Romero DA ، Fremaux C ، Horvath P ، Doyon Y ، Cambillau C ، Moineau S. البروتينات المضادة لـ CRISPR واسعة الانتشار في البكتيريا الضارة تمنع مجموعة من بروتينات Cas9 . نات كومون. 20189 (1): 2919. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05092-w.

Marino ND، Zhang JY، Borges AL، Sousa AA، Leon LM، Rauch BJ، Walton RT، Berry JD، Joung JK، Kleinstiver BP، Bondy-Denomy J. اكتشاف مثبطات النوع الأول والنوع V CRISPR-Cas. علم. 2018362 (6411): 240-2. https://doi.org/10.1126/science.aau5174.

باولوك أ ، ديفيدسون أر ، ماكسويل كوالا لمبور. Anti-CRISPR: الاكتشاف والآلية والوظيفة. نات ريف ميكروبيول. 201816 (1): 12-7. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.120.

هوانج إس ، ماكسويل كوالا لمبور. تعرف على مضادات CRISPRs: مثبطات البروتين واسعة الانتشار لأنظمة CRISPR-Cas. كريسبر جي 20192 (1): 23-30. https://doi.org/10.1089/crispr.2018.0052.

Osuna BA، Karambelkar S، Mahendra C، Christie KA، Garcia B، Davidson AR، Kleinstiver BP، Kilcher S، Bondy-Denomy J.تحفز العاثيات الليسترية على تدهور Cas9 لحماية الجينومات اللايسوجينية. ميكروب مضيف الخلية. 202028 (1): 31-40 هـ. https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.04.001.

Osuna BA ، Karambelkar S ، Mahendra C ، Sarbach A ، Johnson MC ، Kilcher S ، Bondy-Denomy J. القمع الحرج لمكافحة CRISPR بواسطة مثبط Cas9 ثنائي الوظيفة. ميكروب مضيف الخلية. 202028 (1): 23-30. هـ. https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.04.002.

ستانلي سي ، بورخيس أل ، تشين كيه إتش ، سواني دل ، كروغان نيوجيرسي ، بوندي دينومي جي ، ديفيدسون أر. البروتينات المرتبطة بمضادات كريسبر هي مثبطات حاسمة للنسخ المضاد لـ كريسبر. زنزانة. 2019178 (6): 1452-1464 هـ 1413.

Roux S ، Krupovic M ، Daly RA ، Borges AL ، Nayfach S ، Schulz F ، Sharrar A ، Matheus Carnevali PB ، Cheng JF ، Ivanova NN ، Bondy-Denomy J ، Wrighton KC ، Woyke T ، Visel A ، Kyrpides NC ، Eloe- فدروش EA. تم الكشف عن فيروسات inovirus الخفية على أنها منتشرة في البكتيريا والعتائق عبر المناطق الأحيائية للأرض. نات ميكروبيول. 20194 (11): 1895-906. https://doi.org/10.1038/s41564-019-0510-x.

يكشف Wang H و Ling Y و Shan T و Yang S و Xu H و Deng X و Delwart E و Zhang W. Gut virome للثدييات والطيور تنوعًا وراثيًا عاليًا لعائلة Microviridae. تطور الفيروس. 20195 (1): vez013.

Koonin EV ، Yutin N. مجموعة العاثيات الشبيهة بالصدمات: كيف أعادت الميتاجينوميات تشكيل الفيروس البشري اتجاهات ميكروبيول. 202028 (5): 349-59. https://doi.org/10.1016/j.tim.2020.01.010.

إيرانزو ي ، كروبوفيتش إم ، كونين إي في. الغلاف الفيروسي للحمض النووي مزدوج الشريطة كشبكة هرمية معيارية لمشاركة الجينات. مبيو. 20167 (4): e00978–16.

Aiewsakun P ، Adriaenssens EM ، Lavigne R ، Kropinski AM ، Simmonds P. تقييم التنوع الجيني للفيروسات التي تصيب البكتيريا والعتيقات وحقيقيات النوى باستخدام منصة معلومات بيولوجية مشتركة: خطوات نحو تصنيف موحد. ياء الجنرال فيرول. 201899 (9): 1331–43. https://doi.org/10.1099/jgv.0.001110.

Barylski J و Enault F و Dutilh BE و Schuller MB و Edwards RA و Gillis A و Klumpp J و Knezevic P و Krupovic M و Kuhn JH وآخرون. تحليل فيروسات spounavirus كدراسة حالة لإعادة التصنيف المتأخرة للعاقمات الذيل. سيست بيول. 201969 (1): 110-23.

Low SJ، Džunková M، Chaumeil P-A، Parks DH، Hugenholtz P. تقييم سلالة بروتينية متسلسلة لتصنيف فيروسات DNA مزدوجة الذيل التي تنتمي إلى رتبة Caudovirales. نات ميكروبيول. 20194 (8): 1306-15. https://doi.org/10.1038/s41564-019-0448-z.

Yutin N ، Makarova KS ، Gussow AB ، Krupovic M ، Segall A ، Edwards RA ، Koonin EV. اكتشاف عائلة عاثية واسعة تضم أكثر الفيروسات وفرة من الأمعاء البشرية. نات ميكروبيول. 20183 (1): 38-46. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0053-y.

Dutilh BE، Cassman N، McNair K، Sanchez SE، Silva GGZ، Boling L، Barr JJ، Speth DR، Seguritan V، Aziz RK، Felts B، Dinsdale EA، Mokili JL، Edwards RA. تم اكتشاف بكتيريا بكتيرية وفيرة للغاية في التسلسلات غير المعروفة لميتاجينوم البراز البشري. نات كومون. 20145 (1): 4498. https://doi.org/10.1038/ncomms5498.

Edwards RA ، Vega AA ، Norman HM ، Ohaeri M ، Levi K ، Dinsdale EA ، Cinek O ، عزيز RK ، McNair K ، Barr JJ ، Bibby K ، Brouns SJJ ، Cazares A ، de Jonge PA ، Desnues C ، Díaz Muñoz SL ، Fineran PC و Kurilshikov A و Lavigne R و Mazankova K و McCarthy DT و Nobrega FL و Reyes Muñoz A و Tapia G و Trefault N و Tyakht AV و Vinuesa P و Wagemans J و Zhernakova A و Aarestrup FM و Ahmadov G و Alassaf A و Anton J، Asangba A، Billings EK، Cantu VA، Carlton JM، Cazares D، Cho GS، Condeff T، Cortés P، Cranfield M، Cuevas DA، de la Iglesia R، Decewicz P، Doane MP، Dominy NJ، Dziewit L، Elwasila BM و Eren AM و Franz C و Fu J و Garcia-Aljaro C و Ghedin E و Gulino KM و Haggerty JM و Head SR و Hendriksen RS و Hill C و Hyöty H و Ilina EN و Irwin MT و Jeffries TC و Jofre J و Junge RE، Kelley ST، Khan Mirzaei M، Kowalewski M، Kumaresan D، Leigh SR، Lipson D، Lisitsyna ES، Llagostera M، Maritz JM، Marr LC، McCann A، Molshanski-Mor S، Monteiro S، Moreira-Grez B، Morris M ، Mugisha L ، Muniesa M ، Neve H ، Nguyen NP ، Nigro OD ، Nilsson AS ، O'Connell T ، Odeh R ، أوليفر A ، Piuri M ، Prussin II AJ ، Qimron U ، Quan ZX ، Rainetova P ، Ramírez-Rojas A ، Raya R ، Reasor K ، Rice GAO ، Rossi A ، Santos R ، Shimashita J ، Stachler EN ، Stene LC ، Strain R ، Stumpf R ، Torres PJ ، Twaddle A ، Ugochi Ibekwe MA ، Villagra N ، Wandro S ، White B ، Whiteley A ، Whiteson KL ، Wijmenga C ، Zambrano MM ، Zschach H ، Dutilh BE. علم الجغرافيا الأرضية والتطور القديم لانتشار فيروس الأمعاء البشري المنتشر. نات ميكروبيول. 20194 (10): 1727–36. https://doi.org/10.1038/s41564-019-0494-6.

Schumacher MA ، Tonthat NK ، Kwong SM ، Chinnam N ، Liu MA ، Skurray RA ، Firth N. آلية تجميع أصل تكاثر البلازميد متعدد المقاومة العنقودية بواسطة بروتين RepA. بروك ناتل أكاد علوم. 2014111 (25): 9121–6. https://doi.org/10.1073/pnas.1406065111.

Botstein D ، Lew KK ، Jarvik V ، Swanson CA. دور مضاد الانضغاط في التحكم الثنائي للقمع والمناعة بواسطة العاثية P22. J مول بيول. 197591 (4): 439-62. https://doi.org/10.1016/0022-2836(75)90271-5.

Argov T، Sapir SR، Pasechnek A، Azulay G، Stadnyuk O، Rabinovich L، Sigal N، Borovok I، Herskovits AA. يدعم تنسيق عناصر الملتهمة المتعاشرة التعاون بين البكتيريا والعاثية. نات كومون. 201910 (1): 1-4.

Davis-Richardson AG ، Ardissone AN ، Dias R ، Simell V ، Leonard MT ، Kemppainen KM ، Drew JC ، Schatz D ، Atkinson MA ، Kolaczkowski B ، et al. تهيمن Bacteroides dorei على ميكروبيوم الأمعاء قبل المناعة الذاتية لدى الأطفال الفنلنديين المعرضين لخطر الإصابة بمرض السكري من النوع 1. ميكروبيول أمامي. 20145: 678.

كامبل أ. البيولوجيا الجزيئية المقارنة للعاقمات اللمبي. Annu Rev Microbiol. 199448 (1): 193-222.

Wu L و Gingery M و Abebe M و Arambula D و Czornyj E و Handa S و Khan H و Liu M و Pohlschroder M و Shaw KL وآخرون. العناصر الرجعية المولدة للتنوع: التباين الطبيعي والتصنيف والتطور المستدل عليه من مسح جينومي واسع النطاق. الدقة الأحماض النووية. 201746 (1): 11-24.

Handa S و Jiang Y و Tao S و Foreman R و Schinazi RF و Miller JF و Ghosh P. الدقة الأحماض النووية. 201846 (18): 9711-25. https://doi.org/10.1093/nar/gky620.

Miller JL ، Coq JL ، Hodes A ، Barbalat R ، Miller JF ، Ghosh P. التعرف على الروابط الانتقائية من خلال بروتين متغير متغير مكون من عنصر رجعي. بلوس بيول. 20086 (6): e131. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060131.

Liu M ، Deora R ، Doulatov SR ، Gingery M ، Eiserling FA ، Preston A ، Maskell DJ ، Simons RW ، Cotter PA ، Parkhill J ، Miller JF. التحويل المداري بوساطة النسخ العكسي في عاثية بورديتيلا. علم. 2002295 (5562): 2091-4. https://doi.org/10.1126/science.1067467.

Xu J ، Hendrix RW ، Duda RL. الحفاظ على تغيير الإطار الترجمي في جينات تجميع ذيل عاثيات dsDNA. خلية مول. 200416 (1): 11-21. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2004.09.006.

ليفين مي ، هندريكس أر دبليو ، كاسجينز ريال. مطلوب تغيير الإطار الترجمي المبرمج لتخليق بروتين تجميع ذيل العاثية. J مول بيول. 1993234 (1): 124–39. https://doi.org/10.1006/jmbi.1993.1568.

بارانوف PV ، فايت O ، هندريكس RW ، أتكينز جي إف. إعادة الترميز في العاثيات وعناصر IS البكتيرية. اتجاهات الجينات. 200622 (3): 174-81. https://doi.org/10.1016/j.tig.2006.01.005.

McNair K، Zhou C، Dinsdale EA، Souza B، Edwards RA. PHANOTATE: نهج جديد لتحديد الجينات في جينومات العاثيات. المعلوماتية الحيوية. 201935 (22): 4537–42. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btz265.

Doulatov S ، Hodes A ، Dai L ، Mandhana N ، Liu M ، Deora R ، Simons RW ، Zimmerly S ، Miller JF. يُحدِّد تبديل Tropism في Bordetella العاثية عائلة من العناصر الرجعية المولدة للتنوع. طبيعة سجية. 2004431 (7007): 476-81. https://doi.org/10.1038/nature02833.

Meineke B، Shuman S. محددات السمية الخلوية للنيوكلياز المضاد للكودون PrrC وتحسينه عن طريق إصلاح الحمض الريبي النووي النقال. RNA. 201218 (1): 145–54. https://doi.org/10.1261/rna.030171.111.

de Jonge PA، von Meijenfeldt FAB، van Rooijen LE، Brouns SJJ، Dutilh BE. تطور ترادف مجال BACON يتكرر في الانهيار وسلاسل البكتيريا المعوية الجديدة. الفيروسات. 201911 (12): 1085. https://doi.org/10.3390/v11121085.

Pell LG و Gasmi-Seabrook GMC و Morais M و Neudecker P و Kanelis V و Bona D و Donaldson LW و Edwards AM و Howell PL و Davidson AR و Maxwell KL. هيكل محلول المجال الشبيه بـ C- الطرفية لبروتين أنبوب الذيل للعاثيات. J مول بيول. 2010403 (3): 468–79. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2010.08.044.

فريزر جي إس ، يو زي ، ماكسويل كوالالمبور ، ديفيدسون أر. المجالات التي تشبه Ig على العاثيات: قصة الاختلاط والخداع. J مول بيول. 2006359 (2): 496-507. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2006.03.043.

Barr JJ و Auro R و Sam-Soon N و Kassegne S و Peters G و Bonilla N و Hatay M و Mourtada S و Bailey B و Youle M و Felts B و Baljon A و Nulton J و Salamon P و Rohwer F. تزيد العاثية في الأسطح المخاطية من تكرار المواجهات البكتيرية. بروك ناتل أكاد علوم. 2015112 (44): 13675–80. https://doi.org/10.1073/pnas.1508355112.

Nasko DJ ، Chopyk J ، Sakowski EG ، Ferrell BD ، Polson SW ، Wommack KE. يكشف تطور نسالة بوليميراز الحمض النووي للعائلة عن التنوع وتنظيم الجين المتماثل في العوالق الفيروسية. ميكروبيول أمامي. 20189: 3053.

كامبل TL ، براون ED. توصيف استنفاد 2-C-methyl-d-erythritol-2،4-cyclodiphosphate synthase في Escherichia coli و Bacillus subtilis. J باكتيريول. 2002184 (20): 5609–18. https://doi.org/10.1128/JB.184.20.5609-5618.2002.

Heuston S ، Begley M ، Gahan CGM ، Hill C. التخليق الحيوي Isoprenoid في مسببات الأمراض البكتيرية. علم الاحياء المجهري. 2012158 (6): 1389-401. https://doi.org/10.1099/mic.0.051599-0.

Zhang J-R ، Idanpaan-Heikkila I ، Fischer W ، Tuomanen EI. يشارك جين المكورات الرئوية LicD2 في استقلاب الفوسفوريلكولين. مول ميكروبيول. 199931 (5): 1477–1488. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.1999.01291.x.

Lopez R ، Garcia E ، Garcia P ، Ronda C ، Tomasz A. مستقبلات البكتيريا المحتوية على الكولين في العقدية الرئوية. J باكتيريول. 1982151 (3): 1581–90. https://doi.org/10.1128/JB.151.3.1581-1590.1982.

Odom AR. خمسة أسئلة حول التخليق الحيوي للأيزوبرينويد غير الميفالونات. بلوس باثوج. 20117 (12): e1002323. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002323.

إم بريتبارت ، سي بونين ، مالكي ك ، ساوايا ، NA. سادة دمية Phage في عالم الميكروبات البحرية. نات ميكروبيول. 20183 (7): 754–66. https://doi.org/10.1038/s41564-018-0166-y.

Łobocka MB ، Rose DJ ، Plunkett G ، Rusin M ، Samojedny A ، Lehnherr H ، Yarmolinsky MB ، Blattner FR. جينوم البكتيريا P1. J باكتيريول. 2004186 (21): 7032–68. https://doi.org/10.1128/JB.186.21.7032-7068.2004.

McNair K، Bailey BA، Edwards RA. PHACTS ، نهج حسابي لتصنيف نمط حياة العاثيات. المعلوماتية الحيوية. 201228 (5): 614-8. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts014.

هولمفلدت ك ، سولونينكو إن ، شاه إم ، كوريير ك ، ريمان إل ، فيربركموس إن سي ، سوليفان إم بي. اثنا عشر جنسًا من البكتيريا غير المعروفة سابقًا موجودة في كل مكان في المحيطات العالمية. بروك ناتل أكاد علوم. 2013110 (31): 12798-803. https://doi.org/10.1073/pnas.1305956110.

Kyrkou I و Byth Carstens A و Ellegaard-Jensen L و Kot W و Zervas A و Djurhuus AM و Neve H و Hansen M و Hestbjerg Hansen L. أفراد. الفيروسات. 201911 (7): 611. https://doi.org/10.3390/v11070611.

روشا إير ، سيلبي تي ، كولمان جي بي ، سميث سي جيه. استجابة الإجهاد التأكسدي في اللاهوائية ، Bacteroides fragilis: دور الكاتلاز في الحماية ضد بيروكسيد الهيدروجين. J باكتيريول. 1996178 (23): 6895-903. https://doi.org/10.1128/JB.178.23.6895-6903.1996.

بيتكين مي ، روشا إير ، سميث سي جيه. يتوسط Dps و DpsL البقاء في المختبر وفي الجسم الحي أثناء استجابة الإجهاد التأكسدي لفترات طويلة في Bacteroides fragilis. J باكتيريول. 2015197 (20): 3329–38. https://doi.org/10.1128/JB.00342-15.

Gauss GH، Reott MA، Rocha ER، Young MJ، Douglas T، Smith CJ، Lawrence CM. يحدد توصيف منتج الجين Bacteroides fragilis بروتينًا بكتيريًا شبيهًا بـ DPS ويقترح روابط تطورية في عائلة الفيريتين. J باكتيريول. 2012194 (1): 15-27. https://doi.org/10.1128/JB.05260-11.

Germain E ، Castro-Roa D ، Zenkin N ، Gerdes K. الآلية الجزيئية للثبات البكتيري بواسطة HipA. خلية مول. 201352 (2): 248–54. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2013.08.045.

هوانغ سي واي ، جونزاليس لوبيز سي ، هنري سي ، ميجاكوفيتش الأول ، ريان كر. تتوسط أنظمة مضادات السموم الهيب بي في الثبات في Caulobacter crescentus. مندوب علوم .202010 (1): 2865. https://doi.org/10.1038/s41598-020-59283-x.

Rahmsdorf HJ، Pai SH، Ponta P، Herrlich P، Roskoski R، Schweiger M، Studier FW. تحريض بروتين كيناز في الإشريكية القولونية بواسطة العاثية T7. بروك ناتل أكاد علوم. 197471 (2): 586-9. https://doi.org/10.1073/pnas.71.2.586.

ذهب S ، Alfonso-Prieto M ، Paudyal S ، Nicholson AW. آلية التنظيم التحفيزي للريبونوكلياز III عن طريق الفسفرة السيرين. مندوب علوم .2016 (1): 25448. https://doi.org/10.1038/srep25448.

Severinova E ، Severinov K. توطين Escherichia coli RNA polymerase β ′ بقايا الوحدة الفرعية المفسفرة بواسطة البكتيريا T7 كيناز Gp0.7. J باكتيريول. 2006188 (10): 3470-6. https://doi.org/10.1128/JB.188.10.3470-3476.2006.

فريدمان دي ، موزولا سي سي ، بيري ك ، كو سي سي ، رينولدز جيه إل. يؤدي تنشيط التيروزين كيناز المشفر بالوقاية عن طريق الملتهمة غير المتجانسة إلى إصابة ذاتية فاشلة. مول ميكروبيول. 201182 (3): 567–77. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2011.07847.x.

Miller ES، Kutter E، Mosig G، Arisaka F، Kunisawa T، Rüger W. Bacteriophage T4 genome. ميكروبيول مول بيول القس 200367 (1): 86-156. https://doi.org/10.1128/MMBR.67.1.86-156.2003.

Casjens S. Prophages والجينوميات البكتيرية: ما الذي تعلمناه حتى الآن؟ مول ميكروبيول. 200349 (2): 277-300. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2003.03580.x.

Whitfield C ، Wear SS ، Sande C. تجميع السكريات المحفظة البكتيرية والسكريات الخارجية. Annu Rev Microbiol. 202074 (1): 521–43. https://doi.org/10.1146/annurev-micro-011420-075607.

Porter NT، Hryckowian AJ، Merrill BD، Fuentes JJ، Gardner JO، Glowacki RWP، Singh S، Crawford RD، Snitkin ES، Sonnenburg JL، Martens EC. تعدل السكريات المحفظة المتغيرة الطور والبروتينات الدهنية قابلية الإصابة بالعاثيات في Bacteroides thetaiotaomicron. نات ميكروبيول. 20205 (9): 1170–81. https://doi.org/10.1038/s41564-020-0746-5.

هاتفول GF. الأكتينوبكتريوفاج: الجينوميات والديناميات والتطبيقات. Annu Rev Virol. 20207 (1): 37-61. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-122019-070009.

شابيرو جي دبليو ، بوتونتي سي. تعكس شبكات التواجد المشترك للجينات بيئة العاثية وتطورها. مبيو. 20189 (2): e01870–17.

مينوت إس ، جرونبيرج إس ، وو جي دي ، لويس جد ، بوشمان فد. مواضع متغيرة في القناة الهضمية البشرية. بروك ناتل أكاد علوم. 2012109 (10): 3962–6. https://doi.org/10.1073/pnas.1119061109.

Huttenhower C، Gevers D، Knight R، Abubucker S، Badger JH، Chinwalla AT، Creasy HH، Earl AM، FitzGerald MG، Fulton RS، et al. هيكل ووظيفة وتنوع الميكروبيوم البشري السليم. طبيعة سجية. 2012486 (7402): 207-14.

Hryckowian AJ، Merrill BD، Porter NT، Van Treuren W، Nelson EJ، Garlena RA، Russell DA، Martens EC، Sonnenburg JL. Bacteroides thetaiotaomicron- المعزولة العاثية التي تصيب البكتيريا تخبر عن تنبؤات نطاق المضيف المستندة إلى التسلسل. ميكروب مضيف الخلية. 202028 (3): 371–379.e375.

Roux S و Paul BG و Bagby SC و Allen MA و Attwood G و Cavicchioli R و Chistoserdova L و Hallam SJ و Hernandez ME و Hess M et al. أهداف البيئة والجزيئية للطفرات المفرطة في الميكروبيوم العالمي. bioRxiv. 2020: 2020.2004.2001.020958.

Cornuault JK و Petit M-A و Mariadassou M و Benevides L و Moncaut E و Langella P و Sokol H و De Paepe M. تنتمي العاثيات التي تصيب Faecalibacterium prausnitzii إلى أجناس فيروسية جديدة تساعد على فك رموز الفيروسات المعوية. ميكروبيوم. 20186 (1): 65. https://doi.org/10.1186/s40168-018-0452-1.

Benler S، Cobián-Güemes AG، McNair K، Hung S-H، Levi K، Edwards R، Rohwer F. عنصر رجعي مولّد للتنوع مشفر بواسطة عاثيات بكتيرويد منتشرة عالميًا. ميكروبيوم. 20186 (1): 191. https://doi.org/10.1186/s40168-018-0573-6.

Kaur G ، Burroughs AM ، Iyer LM ، Aravind L. منظم للغاية ، ومتنوع أنظمة الصراع البيولوجي المعتمدة على NTP مع الآثار المترتبة على ظهور تعددية الخلايا. إليفي. 20209. https://doi.org/10.7554/eLife.52696.

Vallota-Eastman A و Arrington EC و Meeken S و Roux S و Dasari K و Rosen S و Miller JF و Valentine DL و Paul BG. دور العناصر الرجعية المولدة للتنوع لضبط المسار التنظيمي في البكتيريا الزرقاء. bioRxiv. 2020: 2020.2005.2026.117283.

Valguarnera E، Wardenburg JB. ساءت الأمور الجيدة: سم واحد بعيدًا عن المرض لبكتيرويد فراجيليس. J مول بيول. 2020432 (4): 765-85. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2019.12.003.

Friedman ES و Bittinger K و Esipova TV و Hou L و Chau L و Jiang J و Mesaros C و Lund PJ و Liang X و FitzGerald GA وآخرون. الميكروبات مقابل الكيمياء في أصل تجويف الأمعاء اللاهوائية. بروك ناتل أكاد علوم. 2018115 (16): 4170-5. https://doi.org/10.1073/pnas.1718635115.

Albenberg L ، Esipova TV ، Judge CP ، Bittinger K ، Chen J ، Laughlin A ، Grunberg S ، Baldassano RN ، Lewis JD ، Li H ، et al. العلاقة بين تدرج الأكسجين داخل اللمعة والتقسيم الشعاعي للميكروبات المعوية. أمراض الجهاز الهضمي. 2014147 (5): 1055-1063.e1058.

دونالدسون جي بي ، لي إس إم ، مازمانيان إس كي. الجغرافيا الحيوية للأمعاء للميكروبات البكتيرية. نات ريف ميكروبيول. 201614 (1): 20–32. https://doi.org/10.1038/nrmicro3552.


المواد والأساليب

P. furiosus سلالات وظروف النمو

تم سرد السلالات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي S1. Pyrococcus furiosus نمت سلالات لاهوائية عند 95 درجة مئوية في وسط محدد مع سيلوبيوز كمصدر للكربون (69). نمت الثقافات إما بين عشية وضحاها في زجاجات الثقافة اللاهوائية أو لمدة 65 ساعة على وسط مقوى بنسبة 1 ٪ بالوزن / المجلد من الجلريت (Research Product International). لنمو سلالات uracil auxotrophic ، احتوى الوسط المحدد على 20 ميكرومتر من اليوراسيل. لنمو السلالات المتحولة مع البلازميدات ترباب، الوسط المحدد يفتقر إلى التربتوفان. تم إجراء تحويل البلازميد كما هو موضح سابقًا (69). تم إجراء جميع الاختبارات بثلاث مكررات.

البناء البلازميد

تم بناء البلازميدات بواسطة تقنيات الاستنساخ القياسية. تظهر تسلسلات أليغنوكليوتيدات الحمض النووي المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي S2 وتظهر البلازميدات في الجدول التكميلي S3. لتوليد البلازميدات المستهدفة ، تم تلدين أليغنوكليوتيدات ثم هضمها بواسطة BamHI و NdeI.لبناء البلازميدات بأشرطة تكامل الجينوم (pMS030 و pMS088) ، تم تضخيم المناطق المتجانسة من P. furiosus JFW02 الجينوم و gdh-المروجين-بيرف تم تضخيمه من البلازميد pJFW18. تم تجميع المنتجات المضخمة عن طريق تفاعل البوليميراز المتداخل المتداخل (PCR) وربطها في بلازميد pHSG298 باستخدام مجموعة الاستنساخ غير الملحومة GENEART (Thermo Fisher). لإنشاء أشرطة الإفراط في التعبير ، Cas1 ، Cas2 ، Cas4-1 ، كاس 4-تم تضخيم مناطق الترميز 2 و Cas3 ومناطق المروج من P. furiosus البرية من النوع (WT) الجينوم و ثيرموكوكوس كوداكارينسيس (Tko) WT الجينوم. تم تجميع المنتجات المضخمة عن طريق تداخل PCR وربطها ببلازميد pJE47 (Cas1 ، Cas2 ، Cas4-1 ، كاس 4-2 كاسيت الإفراط في التعبير: Tko CSG المروج- Cas2 (PF1117) ، Tko gdh المروج- Cas4-2 (PF1793) ، slp المروج- Cas4-1 (PF1119) ، PRP synthetase المروج- Cas1 (PF1118)) أو pJE64 (Cas3 overexpression cassette: Tko CSG المروج Cas3 (PF1120)) ، على التوالي. تم هضم شرائط التعبير الزائد بواسطة NotI و EcoRV وربطها بـ pMS030 أو pMS088 لإنتاج بلازميدات تكامل الجينوم. تم تحوير المواقع النشطة لـ HD nuclease و helicase لـ Cas3 (الشكل التكميلي S1) عبر QuikChange PCR باستخدام البلازميد pMS098 كقالب. تم تسلسل البلازميدات لتأكيد تسلسل الإدخال.

سلالة البناء

لإنشاء Cas1 / Cas2 / Cas4-1 سلالات overexpression و Cas4-تم تحويل سلالة الحذف 1 ، pMS032 الخطي NruI أو pMS087 إلى TPF. يتم سرد البلازميدات في الجدول التكميلي S3. تم إجراء جولتين من تنقية المستعمرات عن طريق طلاء 10 3 تخفيفات من الثقافات المحولة على وسط لوحة انتقائي (بدون اليوراسيل) واختيار المستعمرات المعزولة في وسط سائل انتقائي. بعد استبدال العلامة للمنطقة محل الاهتمام ، تم استخدام 5-FOA ، ركيزة pyrF السامة ، لاختيار الخلايا التي خضعت للانبثاق من علامة pyrF عن طريق إعادة التركيب المتماثل. Cas1 / Cas2 / Cas4-1 / كاس 4-2 سلالة الحذف (ad) و Cas4-تم إنشاء سلالة 2 باستخدام استراتيجية استبدال العلامة المنبثقة كما هو موضح سابقًا (70). تم إنشاء منتجات PCR المحولة بواسطة تداخل PCR. يظهر تسلسل أليغنوكليوتيدات الحمض النووي المستخدم في الجدول التكميلي S2.

فحوصات تدخل البلازميد

ثقافات الوسائط السائلة المحددة لـ P. furiosus سمح للنمو بين عشية وضحاها عند 90 درجة مئوية لمدة 16 ساعة (مرحلة تسجيل النمو من منتصف إلى أواخر). في الظروف الهوائية ، تم تحويل 200 نانوغرام من بلازميد التحكم غير المستهدف أو البلازميد المستهدف (الذي يحتوي على بروتوسفاسر يتوافق مع 7.01 كرنا) إلى 100 ميكرولتر من ثقافة ليلية وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة إلى ساعة واحدة. تم تقسيم هذه التحولات وطليها على ثلاث ألواح وسائط صلبة محددة تفتقر إلى اليوراسيل (لاختيار البلازميد المحول). تم إغلاق الألواح اللاهوائية في غرف وحضنت عند 90 درجة مئوية لمدة 3 أيام. لوحظ نمو المستعمرة وحسابها.

مقايسة التكيف وتسلسل الإنتاجية العالية لمنتجات الصفيف الموسعة PCR

تم إجراء التحولات ونمو المستعمرة وإعداد مكتبات amplicon للتكيف كما هو موضح سابقًا (63). باختصار ، تم عزل الحمض النووي الجيني من P. furiosus تم تضخيم الخلايا من 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة أدوات miniprep السريعة (Zymo Research) و CRISPR بواسطة PCR باستخدام مجموعة من البادئات التي تم فيها تلدين التمهيدي الأمامي داخل المنطقة الرائدة في مجموعة CRISPR وتم تلدين التمهيدي العكسي إلى الفاصل الحالي الأقرب إلى القائد. تم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الموسع عن المنتجات غير الممتدة بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام متبوعًا باستعادة الحمض النووي (Zymo Research). اشتملت بادئات PCR على عبء يتوافق مع جزء من المحول ضروري لتسلسل Illumina تم إجراء PCRs إضافية لمزيد من التحديد لمنتجات المصفوفة الموسعة ولإضافة رموز Illumina الشريطية. تم تجميع مكتبات amplicon النهائية المنقية بالهلام وفقًا لشدة النطاق ، وتم تطبيعها وفقًا للتركيز وعدد العينات الممثلة في البركة وتسلسلها على Illumina MiSeq لإنتاج 250 × 50 قراءة نهائية مقترنة ، تم استخدام 250 قاعدة قراءة 1 تسلسل في هذا دراسة. بعد التسلسل ، تم إلغاء تعدد إرسال العينات بواسطة الفهرس وتم استخراج التسلسل المقابل لفاصل جديد من كل قراءة. تم بعد ذلك محاذاة وتحليل تسلسلات المباعد ، كما هو موضح سابقًا ، لتوصيف توزيع حجم المباعد ، ومصدر البروتوسفاسر ، و PAM وأنماط توزيع الفواصل الأولية على طول الجينوم وأي بلازميدات مستخدمة في الفحص (63).

مسارات كثافة المباعد

لإنشاء مسارات كثافة المباعد ، تم استخدام محاذاة المباعدة الإجمالية لإنشاء ملفات تغطية أساسية (أدوات السرير ، (71)) ، ثم تم عرضها على محور مسار مخصص على متصفح الجينوم UCSC (https://genome.ucsc.edu/ cgi-bin / hgHubConnect). بالنسبة لمسار كثافة PAM ، تم إنشاء ملف محاذاة في السيليكو لتشمل بروتوسفاسر واحد 37 نقطة أساس مجاور لكل NGG PAM في الجينوم والبلازميد. تم تحويل ملف المحاذاة هذا إلى ملف تغطية أساسي وعرضه على UCSC Genome Browser جنبًا إلى جنب مع مسارات كثافة المباعد. بالنسبة لكل من مسارات كثافة الفاصل PAM والمباعد ، تم تطبيق خيار النافذة "المتوسط" على قيم تغطية الحاوية للعرض.


10. خاتمة ومقترحات للعمل المستقبلي

في هذه المراجعة ، حددنا نطاقًا واسعًا من العمل التجريبي والنظري على نظام CRISPR-Cas بدائيات النوى. يمكن وصف الآليات الثلاث للتكيف والتعبير والتداخل بأنها عملية ماركوف ، وهي تستخدم مجموعة متنوعة من البروتينات الخاصة بكريسبر لحماية الخلية المضيفة. تتحقق المناعة ضد العناصر الوراثية المتنقلة من خلال تسلسل المباعدة المؤرخة في موضع كريسبر. تساعد هياكل التسلسل المعياري في crRNA: مجمع بروتين Cas في التعرف على الهدف بشكل فعال ومحدد ، وتنظم التغييرات المطابقة للبروتين الانقسام المستهدف. يبدو أن HGT قد سهلت المشاركة الأولية لأنظمة CRISPR-Cas بين الأنواع المتنوعة ، ولكن هناك اختيارًا ضد CRISPR في الكائنات الحية التي تعتمد حاليًا على HGT للإمراضية. بشكل عام ، تعد فعالية CRISPR-Cas عاملاً محددًا لتطور المواقع أو القضاء عليها. يحدث التنويع السكاني لمواقع كريسبر بسرعة ، لأن كل سلالة تتكيف مع مهاجميها الفرديين. ساعدت النمذجة الرياضية في فهمنا لديناميات التطور المشترك لبكتيريا CRISPR والعاثية. يتم تنظيم نشاط CRISPR لتقليل التكلفة المرتبطة بالتحضير للتهديدات المتنوعة وزيادة كفاءة الطاقة إلى أقصى حد. تستخدم بعض الأنواع أنظمة CRISPR الخاصة بها لتنظيم الجينات الذاتية والفوعة ، وسيتم اكتشاف استخدامات فريدة إضافية بلا شك. يوفر CRISPR-Cas منصة متعددة الاستخدامات لمجموعة من تحرير الجينات وتنظيم الجينات والتصوير لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية في البكتيريا والنباتات والبشر.

10.1. آليات المناعة التكيفية

  • ما هو الجدول الزمني الدقيق لاكتساب البكتيريا واستخدامها لمناعة CRISPR-Cas ، وكيف يتوافق ذلك مع النطاق الزمني لعدوى العاثيات؟
  • هل يمثل نموذج ماركوف عمليات كريسبر بشكل عادل؟ اقترحت بعض الأعمال التجريبية المزيد من تشابك الآليات ، وحدوث عمليات مثل التكيف الأولي ، مما يعني ضمنيًا إما الاعتماد على التاريخ أو مساحة أكبر للدولة.
  • لقد ثبت أن موضع كريسبر له أقصى طول للفواصل ، ويحدث حذف المباعد للسماح بعمليات اقتناء جديدة. يمكن أن يستكشف العمل النظري معقولية وجود خلية بكتيرية ذات طول أقصى ديناميكي للموقع ، وقابل للتكيف مع المواقف البيئية المختلفة. ماذا ستكون العلاقة بين العدد الأقصى للفواصل في الموقع ومعدل تنوع وتطور الملتهمة في البيئة؟

10.2. تطور موقع CRISPR-Cas

  • ما هي المبادئ التي تحكم تطور أنواع وأنواع كريسبر شديدة التنوع في الأنواع المختلفة؟
  • لكي يكون نظام المناعة CRISPR-Cas فعالًا ، يجب أن يحتوي على فواصل تحمي البكتيريا من العاثية التي تستهدفها على وجه التحديد. ما هي الفائدة النسبية من الحصول على نظام CRISPR كامل مع أو بدون فواصل مفيدة من خلال HGT مقابل وجود نظام CRISPR بالفعل بدون فواصل مفيدة والحاجة إلى الحصول على فواصل مفيدة جديدة؟ من الممكن أن يكون لأحداث HGT احتمالية أقل ، ولكنها ذات صلة على نطاقات زمنية أطول.
  • Phage قادرة على الهروب من التعرف على CRISPR-Cas من خلال تحور البروتوسفاسر. أعلى من معدل طفرة لاقمية عتبة معينة ، يُفترض أن كريسبر لم يعد مفيدًا في البكتيريا. إذا كانت البكتيريا في بيئة بها أنواع متعددة من العاثيات ذات معدلات متفاوتة من الطفرات ، في ظل أي ظروف يكون احتمال إصابة البكتيريا بكريسبر أكثر أو أقل؟

10.3. الاستقرار والنشاط غير المستهدف

  • تعتبر طريقة التسليم وخلفية المرض من العوامل المهمة التي يجب مراعاتها عند محاولة تنفيذ العلاجات القائمة على كريسبر في البشر. هل يمكن لنماذج مناعة بروتين Cas تحديد التفاعل المناعي للفرد والمساعدة في تصميم أنظمة تحرير CRISPR-Cas مستقرة وقابلة للتسليم بشكل فعال؟
  • هناك حاجة إلى نمذجة أكثر دقة لتوزيع التأثيرات غير المستهدفة لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية ، وخاصة في الخلايا البشرية. ما هو مستوى التفاصيل في النمذجة الرياضية أو المحاكاة الحسابية الضروري للتنبؤ بخصوصية Cas9: sgRNA؟
  • يُعد Cas9 حاليًا أكثر بروتينات CRISPR شيوعًا المستخدمة في الهندسة الجينومية ، نظرًا لقدرته على الارتباط المزدوج بالحمض النووي وقدرته على الانقسام. على الرغم من أن آلية التداخل لأنظمة CRISPR الأخرى قد يكون من الصعب تسخيرها ، أي تنسيق ربط Cascade وانقسام Cas3 ، إلا أنها توفر تحكمًا أكثر تحديدًا ، حيث أن إزالة إحدى الوحدات الفرعية يمكن أن تزيل الارتباط غير المستهدف. كيف يؤثر استخدام Cascade المعدل على حركية الربط بين sgRNA المصمم هندسيًا وتسلسل الحمض النووي المستهدف وكفاءة انشقاق Cas3؟


شاهد الفيديو: كل شئ عن كورونا بإختصار (شهر فبراير 2023).