معلومة

كيف تميز تركيبات aminoacyl-tRNA بين الأحماض الأمينية المتشابهة؟

كيف تميز تركيبات aminoacyl-tRNA بين الأحماض الأمينية المتشابهة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كيف تتعرف تركيبات aminoacyl tRNA على الأحماض الأمينية الصحيحة لـ tRNA؟ ما هو السبب البنيوي وراء الاعتراف الانتقائي؟ أجد صعوبة في رؤية كيف ، على سبيل المثال ، يمكن التعرف على الليوسين والأيزولوسين بشكل انتقائي من خلال جيوب ربط مختلفة عندما تظهر نفس الكراهية للماء ، والحجم الجزيئي وما إلى ذلك.


تكون إنزيمات Aminoacyl-tRNA شديدة التحديد للأحماض الأمينية المقابلة لها. أولاً ، يشكل موقع التنشيط ، حيث يرتبط الحمض الأميني ، شبكة معقدة من التفاعلات بين الجزيئات. على سبيل المثال ، الثريونين ، المحفز بواسطة threonyl-tRNA synthetase ، يشبه إلى حد بعيد الفالين والسيرين. يحتوي Valine على مجموعة ميثيل بدلاً من مجموعة هيدروكسي من ثريونين ، وسيرين ، على الجانب الآخر ، ليس له مجموعة جانبية إضافية من الميثيل. بشكل فريد لتخليق threonyl-tRNA ، فإنه يحتوي على Zn2+ أيون يعرض بنية تفاعل خاصة بالثريونين. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن شحن مركب threonyl-tRNA مع السيرين لأن موقع أيون الزنك ليس محددًا بدرجة كافية ، مما يؤدي إلى 1 ٪ من الحمض الريبي النووي النقال غير المشحون. لهذا الغرض ، فإن التركيبات aminoacyl-tRNA لها ثانية ، التحرير الموقع الذي يصحح الحمض الريبي النووي النقال المشحون. يمكن لموقع التحرير التعرف على السيرين وشقها من الحمض الريبي النووي النقال.

شكل: شبكة تفاعل موقع التنشيط لمركب threonyl-tRNA في أ. بيرنيكس. يظهر threonine-AMP باللون الأخضر.

مصادر:

أ بيرج جم ، تيموكزكو جيه إل ، سترير ل. الكيمياء الحيوية. الطبعة الخامسة. نيويورك: دبليو إتش فريمان ؛ 2002. القسم 29.2 ، مواد تخليق الحمض النووي الريبي الأحماض الأمينية الناقلة للأمينو اقرأ الكود الجيني. متاح من: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22356/

ب ناجاوكا ، يوشيوكي ، وآخرون. "التطور والتعرف على الحمض النووي الريبي (tRNA) لتخليق THREONYL-tRNA من ARCHAEON شديد الحرارة ، Aeropyrum pernix K1." Viva Origino 1.31 (2003) ، http://www.origin-life.gr.jp/3101/3101062/3101062.html


Aminoacylation الحمض الريبي النووي النقال

الخطوة الثانية في aminoacylation الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) هي نقل الحمض الأميني المنشط من aa-AMP إلى A76 ribose 2′-OH (لإنزيمات الفئة الأولى) أو 3′-OH (لمعظم إنزيمات الفئة الثانية). ميكانيكيًا ، سيتم تعزيز الألفة النووية لمجموعات الهيدروكسيل هذه إلى حد كبير عن طريق نزع البروتون ، مما يشير إلى الحاجة إلى قاعدة موقع نشطة مع p كأ بالقرب من الحياد في موقع مناسب داخل المواقع النشطة لـ AARS. هذه المجموعة نفسها يمكن أن تتصرف لاحقًا للتبرع ببروتون لمجموعة مغادرة AMP بعد انقسام الرابطة. ومع ذلك ، لم يظهر أي مرشح واضح للبقايا المحفوظة التي يمكن أن تعمل كقاعدة عامة حتى عندما يتم الحفاظ على هياكل الموقع النشطة وتم تحديد الأشكال المتسلسلة لكل فئة AARS. بدلاً من ذلك ، يمكن أن يوفر التحفيز بمساعدة الركيزة ، باستخدام إما مجموعة الفوسفات في aa-AMP أو α-amine للحمض الأميني (في aa-AMP) كقاعدة ضرورية ، سيناريو ميكانيكي بديل ويكون مستقلاً عن الفئة.

لوحظ أحد الاحتمالات لقاعدة موقع نشطة محتملة من المجمع الثلاثي بين الفئة الأولى بكتريا قولونية GlnRS ، و tRNA Gln المتشابه ، ونظير الجلوتامينيل أدينيلات 5′-ا- [N- (l -glutaminyl) -sulfamoyl] الأدينوزين (QSI) ، الذي اقترح غلوتامات مدفونة (Glu34) لهذا الدور [79]. الكربوكسيل Glu34 على بعد 2.7 Å من المياه البلورية المجاورة لـ tRNA 2′-OH. سيعتمد مرحل نقل البروتون المقترح على نزع البروتون بوساطة Glu34 ، متبوعًا بنزع بروتون 2′-OH مع هجوم مصاحب على مجموعة الكربونيل من الجلوتامينيل أدينيلات المرتبط بالإنزيم. ستحتوي الحالة الانتقالية لهذا التفاعل على وسيط كربوني رباعي السطوح يُفترض أن يتم تثبيته بواسطة مجموعة guanidino في Arg260 [79]. تتناقض هذه الآلية المقترحة لنقل الأحماض الأمينية مع الاقتراح السابق ، استنادًا إلى بنية GlnRS: tRNA Gln: ATP ، بأن الأكسجين غير الجسور في Gln-AMP سوف ينزع بروتين A76 2′-OH [55]. بالنظر إلى p منخفضة للغايةكأ (1.5-2) من الأكسجين الفوسفاتي وأن Gln تم تصميمه في الهيكل ، وكان التنبؤ اللاحق بـ Glu34 كقاعدة عامة جذابًا [79]. في محاولة لتسوية السؤال الميكانيكي للإنزيم أو الركيزة المحفزة من مجموعة 2′-OH ، قام بيرونا وزملاؤه بتحور كل من Glu34 و Glu73 القريب وتقييم معدلات التفاعل من خلال نهج الحالة المستقرة وما قبل الحالة المستقرة [80]. عرضت طفرة Glu34Gln تغييرًا ضئيلًا في ككيم، معدل دوران aminoacylation الفردي (على الرغم من أن هذا الاستبدال أدى إلى ارتفاع كد للركيزة Gln). انخفض استبدال Glu73Gln المقابل ككيم بنسبة 10 3 أضعاف بالنسبة إلى GlnRS من النوع البري ، يُعزى هذا الانخفاض إلى فقدان جهات الاتصال مع المخلفات المجاورة التي تضع طرف الحمض الريبي النووي النقال 3′ في الموقع النشط. نتيجة لذلك ، تم التوصل إلى أنه لا توجد بقايا من Glu تشارك في تعزيز إزالة بروتون A76 2′-OH [80].

بدون وجود قاعدة عامة واضحة لتعزيز aminoacylation الحمض النووي الريبي في أي من إنزيمات الفئة الأولى أو الثانية ، تم توجيه الانتباه إلى إمكانية التحفيز بمساعدة الركيزة. قدم أكسيد الفوسفات غير الجسور إمكانية مثيرة للاهتمام على الرغم من انخفاض pكأ، خاصة لأن pكأ قيم منتج تفاعل AMP أعلى عند 3.8 و 6.2 (The Merck Index، Rahway، NJ). وبالتالي ، فإن الآلية المتضافرة جذابة ، مثل أن الأكسجين غير الجسور الأدينيلات يزيل البروتين 2′-OH ، ويهاجم nucleophile الأكسجين الناتج كربون adenylate carbonyl ، وينكسر رابطة CO المجاورة (الشكل 4). من المحتمل أن تكون هذه الإستراتيجية المدعومة بالركيزة عامة بالنسبة إلى إنزيمات كلتا الفئتين ، وقد تعكس آلية أسلاف موجودة مسبقًا في ظهور فئتين هيكليتين متميزتين.

الشكل 4. آلية عامة لمشاركة aa-AMP في aminoacylation الحمض الريبي النووي النقال. مستمدة من الآليات التي سبق اقتراحها [33،81]. Ado ، Adenosine R ، سلسلة جانبية من الأحماض الأمينية مشابهة لـ AARS المعطى.

الأدلة التي تدعم آلية منسقة مدعومة بالركيزة من أجل aminoacylation الحمض الريبي النووي النقال مثل تلك الموضحة في الشكل 4 متاحة لكلا الفئتين من AARSs. استخدم فرانكلين وزملاؤه بكتريا قولونية HisRS: هيكله- AMP مع الحمض النووي الريبي (tRNA) تم تصميم نموذج A76 الخاص به في الموقع النشط لاقتراح آلية مفصلة ومنسقة لـ tRNA aminoacylation [33]. في هذا النموذج ، توجد أربع بقايا رئيسية بالقرب من كل من His-AMP المرتبط والريبوز الطرفي: Arg259 و Arg113 و Gln127 و Glu83. تتفاعل بقايا Arg مع الأكسجين غير الجسور adenylate Sp و Rp ، على التوالي ، بينما يتلامس Gln مع α-carbonyl من الأدينيلات. أظهرت جميع متغيرات Arg259His و Glu83Gln و Glu83Ala معدلات نقل الأحماض الأمينية منخفضة بشكل كبير والتي يمكن أن تُعزى إلى عيوب في التحفيز أو تحديد المواقع A76. لمعالجة عدم اليقين هذا ، تم إدخال نظائر الفوسفوروثيوات للأدينيلات في كل من مواضع Sp و Rp لاستكشاف دور His-AMP في التحفيز. بالنسبة إلى HisRS من النوع البري ، أدى استبدال ATPαSp إلى فقدان نشاط قدره 10000 ضعف مقارنة بخسارة 50 ضعفًا فقط لاستبدال Rp. ولوحظت اتجاهات مماثلة مع إنزيمات متغيرة Arg259His و Glu83Gln. وبالتالي ، فإن الأكسجين Sp غير الجسور هيستيديل-أدينيلات هو القاعدة العامة المحتملة لنزع البوتون A76 3′-OH ، ويُقترح أن يكون نقل الهيستيدين تفاعلًا منسقًا ومدعومًا بالركيزة [33]. هذه الآلية مدعومة بحسابات نظرية الكثافة الوظيفية (DFT) [81].

تشير الأدلة التجريبية أيضًا إلى أن الفئة الأولى AARSs تعتمد على التحفيز بمساعدة aa-AMP باستخدام الأكسجين غير الجسور لتعزيز إزالة البروتون ، في هذه الحالة من 2′-OH على الطرف 3′ من الركيزة tRNA. تم التعرف على التأثير الضار لاستبدال الكبريت إما بالأكسجين غير الجسور في α- فوسفات من ATP لنشاط MetRS في وقت مبكر من عام 1982: أحد الأيزومرات الفراغية (يسمى ATPαSA) يسبب

180 ضعف انخفاض في الخامسالأعلىبينما الآخر (ATPαSB) يقضي تمامًا على نشاط الإنزيم [82]. مع وضع الآلية الموضحة في الشكل 4 في الاعتبار ، يبدو من المحتمل أن الكبريت الموجود في ATPαSB قد حل محل الأكسجين غير الجسور الذي سيكون حاسمًا لنزع توتر مجموعة 2′-hydroxyl المهاجمة. في عام 2000 ، استخدم فيرست وزملاؤه نتائج من حركية الحالة المستقرة المفصلة لاقتراح حالة انتقال الحلقة المكونة من 6 أعضاء مع الأكسجين غير الجسر Tyr-AMP على الفوسفات المتمركز في نزع 2′-OH على tRNA Tyr [83 ]. وفي عام 2017 ، قام Aboelnga و Gauld بشكل حسابي بفحص آليات tRNA aminoacylation من بكتريا قولونية GlnRS و T. ماريتيما ND-GluRS. أدت عمليات محاكاة الديناميكيات الجزيئية ، جنبًا إلى جنب مع حسابات QM و QM / MM ، إلى اقتراح ميكانيكي مشابه لما هو موضح في الشكل 4. في هذه الحالات ، تم وضع جزيء ماء مرتب بين أكسجين الفوسفات غير الجسور في aa-AMP و 2′-OH في الحمض الريبي النووي النقال. وبالتالي ، ستستمر حالة الانتقال من خلال حلقة مكونة من 8 أعضاء وسيستمر التتابع المطلوب لنقل البروتون عبر نزع البروتون بوساطة aa-AMP لجزيء الماء هذا مع إعادة التنفيس الفوري باستخدام البروتون من 2′-OH. إن الهجوم الفوري المحب للنيوكليوفيليك على α-phosphate سيكمل الدورة [84]. لا يزال يتعين تحديد ما إذا كان الماء يشارك في نقل البروتون لجميع الفئة الأولى من AARSs أم لا.

استثناء محتمل للحالة العامة لنزع البروتون بمساعدة aa-AMP من هيدروكسيل A76 هو الفئة II ThrRS. مقارنة بكتريا قولونية ThrRS: AMP و ThrRS: tRNA Thr: تشير هياكل AMP إلى أن بقاياها المحفوظة (His309) تعيد توجيهها عند ارتباط الحمض النووي الريبي (tRNA) بالاتصال بـ A76 2′-OH [34]. أدى تحور His309 إلى انخفاض aminoacylation ، وعُزيت هذه الخسارة إلى خطوة النقل ، مع انخفاض في كعبر من & GT 200 أضعاف. يجادل المؤلفون بأن A76 2′-OH نشط أيضًا في خطوة النقل ، حيث انخفض الاستبدال بـ 2′-deoxy أو 2′-fluoro ، لكنه لم يلغي ، كعبر مع خسائر قدرها 10 2-10 3 بالنسبة إلى الحمض الريبي النووي النقال الأصلي. تم تخفيض مشاركة الأكسجين غير الجسور الأدينيلات في نزع البروتون من A76 3-OH ، حيث لم تؤثر بدائل الفوسفوروثيوات بشكل كبير على نقل الأحماض الأمينية [34]. يشير تحليل الدورة الطافرة المزدوجة بين His309Ala و 2′-deoxy أو بدائل 2′-fluoro إلى اقتران ديناميكي حراري ، مما يؤدي إلى نموذج تحفيزي لتخليق Thr-tRNA Thr الذي يستدعي مرحل البروتون من His309 إلى A76 2′-OH إلى nucleophilic A76 3 ′ -OH (الشكل 5 أ). اقترحت حسابات DFT اللاحقة بدلاً من ذلك دورًا محتملًا لمجموعة الركيزة الأمينية threonine كقاعدة عامة. يعتمد ThrRS على موقع نشط Zn 2 + العامل المساعد لاختيار الأحماض الأمينية وتنشيطها بالتنسيق مع مجموعتي α-amine و β-hydroxy في Thr (وغير المشابه Ser) (الموصوف بمزيد من التفصيل لاحقًا في هذا الفصل). إن القرب من أيون Zn 2 + والقدرة المحسوبة للرابطة بين Zn 2 + و α-amine يعززان أساس الأمين (الشكل 5 ب) [85]. لم يتم اختبار هذه الآلية الجديدة تجريبيا.

الشكل 5. آليات aminoacylation الحمض الريبي النووي النقال المقترحة من أجل ThrRS. (أ) يعمل His309 كقاعدة تحفيزية لبدء تتابع عمليات نقل البروتون الذي ينشط 3′-OH باعتباره محبًا للنواة [32]. (ب) يعمل α-amine في الركيزة Thr-AMP كقاعدة تنفصل عن 3′-OH. Thr-tRNA Thr (يمين) هو المنتج الذي سينشأ من أي من المسارين [83].


أيون الزنك بوساطة تمييز الأحماض الأمينية بواسطة threonyl-tRNA synthetase

تعتمد الترجمة الدقيقة للشفرة الجينية على قدرة التركيبات aminoacyl-tRNA على التمييز بين الأحماض الأمينية المتشابهة. من أجل التحقيق في أساس التعرف على الأحماض الأمينية وفهم الدور الذي يلعبه أيون الزنك الموجود في الموقع النشط لمركب threonyl-tRNA ، فقد حددنا الهياكل البلورية لمجمعات الشكل النشط للإنزيم مع threonyl نظير أدينيلات أو ثريونين. يشارك أيون الزنك بشكل مباشر في التعرف على الثريونين ، ويشكل وسيطًا خماسيًا مع كل من المجموعة الأمينية وهيدروكسيل السلسلة الجانبية. تكشف تجارب تنشيط الأحماض الأمينية أن الإنزيم لا يظهر أي تنشيط للفالين المتساوي ، وينشط السيرين بمعدل 1000 مرة أقل من نظيره في ثريونين. توضح هذه الدراسة أن أيون الزنك ليس تحفيزيًا ولا بنيويًا بشكل صارم وتقترح كيف يضمن أيون الزنك تنشيط الأحماض الأمينية فقط التي تمتلك مجموعة الهيدروكسيل المرتبطة بالموضع.


نتائج

مجموعة البيانات

استنادًا إلى جميع الهياكل المتاحة في PDB ، تم تحليل 424 (189 الفئة الأولى ، 235 الفئة الثانية) الهياكل ثلاثية الأبعاد من aaRSs المتبلورة بشكل مشترك مع روابط الأحماض الأمينية المقابلة لها. تغطي البيانات المختارة aaRSs لـ 56 نوعًا مختلفًا في المجموع ، 180 من حقيقيات النوى ، 213 من البكتيريا ، و 31 من العتائق (SI Appendix Fig. S1). في المجموع ، يشكل 70 هيكلًا بشريًا جزءًا من مجموعة البيانات. تم النظر في كل سلسلة بروتين تحتوي على مركب بروتيني يجند لمجال aaRS الحفاز. كانت البيانات متاحة لكل من 20 aaRSs ، بالإضافة إلى مركب aaRSs غير القياسي pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) و phosphoseryl-tRNA synthetase (SepRS). لسوء الحظ ، لا يمكن النظر في الفئة الأولى LysRS للتحليل. هيكل واحد من هذا الانزيم من بيروكوكوس هوريكوشي (PDB-ID: 1irx) ، وهو جزء من مجموعة البيانات ، لا يحتوي على أي يجند أحماض أمينية متبلورة. يتم إعطاء أعداد مجمعات البروتين-الترابط المتاحة لكل aaRS في SI Appendix Fig. S2. بالنسبة إلى اثني عشر aaRSs ، كانت مجمعات البروتين - ligand متاحة في كل من حالات تفاعل ما قبل التنشيط وبعد التنشيط ، أي متبلورة إما مع حمض أميني أو يجند aminoacyl (SI Appendix Fig. S3). من بين جميع الهياكل التي تم تحليلها ، 240 في حالة ما قبل التنشيط و 184 في حالة ما بعد التنشيط. من بين مجمعات ما بعد التنشيط ، 72 عبارة عن إسترات أدينوزين أحادي الفوسفات (AMP) و 112 عبارة عن نظائر غير قابلة للتحلل بالماء ، خاصة مشتقات السلفامويل.

ميزات التفاعل

ترد في الجدول 1 تكرارات تفاعلات موقع الارتباط غير التساهمي المرصودة فيما يتعلق بفئة aaRS ونوع التفاعل. العدد الإجمالي للتفاعلات ، بينما يتم ملاحظة الروابط الهيدروجينية بشكل متكرر في الفئة II aaRSs بمعدل 59.23٪. تمت ملاحظة خمسة أنواع من التفاعلات (روابط هيدروجينية ، تفاعلات كارهة للماء ، جسور الملح ، ( pi ) - التراص ، والمجمعات المعدنية) في aaRSs. لوحظ عدم وجود تفاعلات ( pi ) -cation متورطة في ارتباط الأحماض الأمينية. تم استبعاد جسور المياه من تحليل التفاعل. يتم حل بعض هياكل aaRS المترسبة في PDB بما في ذلك الماء ، لكن الهياكل الأخرى لا تحتوي على جزيئات الماء. في هذه الحالات ، لا يمكن اكتشاف أي جسور مائية باستخدام PLIP ، على الرغم من وجودها في الجسم الحي، مما قد يؤدي إلى تحيز تجريبي. ومع ذلك ، من المعروف أن جزيئات الماء تتوسط في تفاعلات مهمة للتعرف على الترابط 48 ولا ينبغي التقليل من دورها.

التعرف على الأحماض الأمينية

سمح التعليق التوضيحي لتفاعلات البروتين - الترابطية غير التساهمية بتوصيف تفضيلات التفاعل لكل aaRS على مستوى الذرات الفردية لروابط الأحماض الأمينية الخاصة بهم. يسلط هذا التحليل الضوء على الأنماط المفضلة للربط لكل من 22 رابطة من الأحماض الأمينية. يوضح الشكل 2 التفاعلات التي تحدث لكل aaRS بناءً على التحليل باستخدام PLIP. يتم شرح كل تفاعل مع شغلها ، أي التكرار النسبي للظهور فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للهياكل لهذا aaRS. يتم إهمال ميزات موقع الربط في هذه المرحلة وتظهر جميع التفاعلات فيما يتعلق برابطة الأحماض الأمينية.

التعرف على الأحماض الأمينية الفردية بواسطة aaRSs المعينة إلى الروابط الخاصة بهم. يتم تجميع الروابط حسب الخصائص الفيزيائية والكيميائية 49 وفئة aaRS. تم تحديد أنواع مختلفة من تفاعلات البروتين - الترابطية غير التساهمية مع PLIP 46 وتم تخصيصها للذرات الفردية للرابط باستخدام كشف تماثل الرسم البياني الفرعي 50. تُصوَّر ذرات العمود الفقري للرابط على شكل دوائر بدون أجزاء داخلية مملوءة. يتم إعطاء الإشغال النسبي لكل تفاعل فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للهياكل التي تم فحصها (الرقم بين قوسين لكل aaRS) بواسطة المخططات الدائرية. التفاعلات مع إشغال أقل من 0.1 مهملة. التفاعلات التي لا يمكن من أجلها تعيين فريد لذرة مفردة بسبب تماثل غامض ، على سبيل المثال لسلسلة الفالين الجانبية ، تم تخصيصها لذرات متعددة. ( pi ) - تظهر التفاعلات التراصية باللون الأخضر الداكن وتشير إلى جميع ذرات هياكل الحلقة العطرية في TyrRSs و TrpRSs و PheRSs. تمنع بعض أنظمة aaRS الشحن الخاطئ للـ tRNAs عن طريق آليات تصحيح الخطأ ("التحرير") 51. يتم كتابة تعليمات aaRS التي تقوم بتصحيح الأخطاء بالخط العريض.

الدرجة الأولى

بشكل عام ، تتفاعل الفئة الأولى من aaRS بشكل أساسي عبر الروابط الهيدروجينية والتفاعلات الكارهة للماء مع الترابط. تتميز ذرات العمود الفقري لجميع روابط الفئة الأولى برابطة هيدروجينية مع مجموعة الأمين الأولية. يكون شغل هذا التفاعل مرتفعًا في جميع أنحاء aaRS من الفئة الأولى ، مما يشير إلى الدور المحوري لهذا التفاعل في تثبيت الترابط. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك ذرة الأكسجين من مجموعة الكربوكسيل في الرابطة في الترابط الهيدروجيني باستثناء مركب الجلوتامينيل - الحمض الريبي النووي النقال (GlnRS) ، وتركيز إيزوليوسيل - الحمض الريبي النووي النقال (IleRS) ، وإنزيم valyl-tRNA synthetase (ValRS). تشكل نفس الذرة جسور ملح إضافية في تركيبة leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) ، وتركيب أرجينيل- tRNA (ArgRS) ، وتركيب methionyl-tRNA (MetRS) ، و glutamyl-tRNA synthetase (GluRS). ترتبط السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية الأليفاتية ، ليسين ، آيسولوسين ، وفالين حصريًا عبر التفاعلات الكارهة للماء. تشكل ArgRS و GluRS جسور الملح بين بقايا موقع الربط ومجموعات الكربوكسيل والجوانيدين المشحونة في ligand ، على التوالي. يرتبط الجلوتامين بـ GlnRS عبر روابط هيدروجينية محفوظة لمجموعة الأميد والتفاعلات الكارهة للماء مع ذرات كربون بيتا ودلتا. يتم التعرف على اثنين من الأحماض الأمينية العطرية التيروزين والتريبتوفان من خلال ( pi ) -التفاعلات المكدسة وشبكات الاتصال الواسعة الكارهة للماء. يفضل أن يكون التربتوفان مرتبطًا من جانب واحد من مجموعته الإندولية في المواضع واحد وستة وسبعة. تشكل ذرة الكبريت في مركب cysteinyl-tRNA synthetase (CysRS) مركبًا معدنيًا مع أيون الزنك في كلا الهيكلين. تربط MetRSs ترابطها بتفاعل مسعور محفوظ بدرجة عالية مع ذرة كربون بيتا.

الفئة الثانية

تتفاعل aaRS من الفئة الثانية باستمرار مع ذرات العمود الفقري للرابط عبر الروابط الهيدروجينية وجسور الملح. تشكل مجموعة الأمين الأولية روابط هيدروجينية ذات إشغال عالٍ وتشارك في تكوين معقد معدني في تركيبات threonyl-tRNA (ThrRSs) و seryl-tRNA synthetases (SerRSs). ترتبط ذرات الأكسجين الكربوكسيل الموجودة في الروابط بمزيج من الروابط الهيدروجينية وتفاعلات جسر الملح الكهروستاتيكي. يتم الحفاظ على نمط تفاعل العمود الفقري الكلي بشكل كبير داخل الفئة II aaRSs. كشف التحقيق الوثيق أن الشكل الهيكلي الموصوف سابقًا لمتبقي أرجينين 43 ، المسؤول عن تثبيت ATP ، يبدو أنه متورط في تثبيت مجموعة كربوكسيل الأحماض الأمينية مع بقايا N-terminal أرجينين. تشكل روابط الأحماض الأمينية المشحونة في مركب هيستيديل - الحمض الريبي النووي النقال (HisRS) و LysRS روابط هيدروجينية محفوظة بدرجة عالية مع بقايا موقع الربط. تشمل التفاعلات الأخرى التي تمنح الخصوصية ( pi ) - التفاعلات المكدسة والتلامس الكارهة للماء التي لوحظت في تركيب فينيل ألانين-الحمض الريبي النووي النقال (PheRS) ، وتشكيل المعادن المعقدة لـ ThrRS و SerRS مع الزنك ، وجسور الملح وكذلك الروابط الهيدروجينية للأسبارتيل-الحمض الريبي النووي النقال مركب (AspRS). الأحماض الأمينية ألانين وبرولين مرتبطة بمركبات ألانيل - الحمض الريبي النووي النقال (AlaRSs) وتركيبات البرولايل - الحمض الريبي النووي النقال (ProRSs) عبر التفاعلات الكارهة للماء. لا يمكن وصف تفاعلات منح الخصوصية لأصغر حمض أميني جلايسين بسبب عدم وجود سلسلة جانبية. ومن ثم ، فإن مركب glycyl-tRNA synthetase (GlyRS) يمكنه فقط تكوين تفاعلات مع ذرات العمود الفقري للرابط. علاوة على ذلك ، تتوسط تركيبات asparaginyl-tRNA (AsnRSs) في الروابط الهيدروجينية المحفوظة للغاية مع مجموعة الأميد لرابط الأسباراجين الخاص بهم. يرتبط الحمض الأميني غير القياسي pyrrolysine بـ PylRS عبر العديد من الروابط الهيدروجينية والتفاعلات الكارهة للماء مع مجموعة pyrroline. تستخدم SepRSs بشكل أساسي تفاعلات جسر الملح لتثبيت مجموعة الفوسفات في ليجند الفوسفوسرين.

أنماط التفاعل المحفوظة

تُظهر الفئة الأولى aaRSs حفظًا قويًا للروابط الهيدروجينية مع المجموعة الأمينية الأولية لرابطة الأحماض الأمينية مع 83.16٪ من جميع الهياكل التي تشكل هذا التفاعل. تكون التفاعلات مع مجموعة الكربوكسيل أقل حفظًا مع تكرار 32.65٪ للروابط الهيدروجينية و 28.57٪ لجسور الملح ، على التوالي. في هذا السياق ، تعتبر جسور الملح مع مجموعة الكربوكسيل شكلاً من أشكال الترابط الهيدروجيني القوي للغاية 52. أنماط التفاعل مع ذرات العمود الفقري لرابط الأحماض الأمينية متسقة بشكل لافت للنظر داخل الفئة II aaRSs. تشكل هذه الفئة روابط هيدروجينية مع مجموعة الأمين الأولية في 92.15٪ من جميع الهياكل. بالإضافة إلى ذلك ، تحدث روابط الهيدروجين مع ذرة الأكسجين لمجموعة الكربوكسيل في 65.70 ٪ من جميع الهياكل وجسور الملح مع نفس الذرة تتشكل في 39.26 ٪ من جميع مجمعات بروتين - يجند من الدرجة الثانية.

يتطلب التعرف المماثل آليات التحرير

من المعروف أن aaRSs المختلفة تقوم بإجراء التحرير قبل أو بعد النقل (انظر عمل Perona و Gruic-Sovulj 51 للحصول على مناقشة مفصلة لآليات التحرير) من أجل ضمان التعيين المناسب للأحماض الأمينية إلى tRNAs الخاصة بهم. يشير تشابه تفضيلات التفاعل الموصوفة في الشكل 2 إلى أن مجموعات الأحماض الأمينية المتشابهة جدًا تتطلب آليات تحرير للتعامل معها بشكل صحيح. على وجه الخصوص ، ترتبط الأحماض الأمينية الأليفاتية الثلاثة ، إيزولوسين ، وليوسين ، وفالين عبر تفاعلات غير محددة وضعيفة كارهة للماء ، مما يثبت ضرورة آليات التحرير التي لوحظت بالنسبة لـ aRSs 53 وأن الكراهية المائية للركيزة لا يمكن أن تفسر تمامًا الخصوصية 54. من المقترح أن يتم التمييز بين هذه الأحماض الأمينية الثلاثة المتشابهة من خلال آلية "الغربال المزدوج" 52. على سبيل المثال بالنسبة لـ IleRS ، يتم استبعاد الأحماض الأمينية الأكبر من isoleucine باستخدام "المنخل الأول" في موقع aminoacylation ، بينما يتم فرز الأحماض الأمينية الأصغر (مثل valine و leucine) بواسطة مجال التحرير ، حيث تعمل بمثابة "غربال" دقيق. لذلك يمكن تحقيق الخصوصية عن طريق التحديد الفراغي بناءً على طول السلسلة الجانبية وشكلها في موقع التحرير 53. يمكن ملاحظة اتجاه مماثل ، على سبيل المثال ، بالنسبة لـ AlaRS 55 من أجل تمييز الألانين عن السيرين أو الجليسين.

هندسة موقع الربط وحجم التجويف

لقد بحثنا في هندسة موقع الربط وحجم التجويف من أجل تحديد مساهمتها المحتملة في التعرف على الأحماض الأمينية. تركز آليات التحرير المعروفة في aaRSs على منع أو تصحيح الشحن الخاطئ للـ tRNA ضمن فئة aaRS واحدة (داخل الفصل) ، على سبيل المثال تنتمي الأحماض الأمينية isoleucine و leucine و valine إلى الفئة الأولى. ومع ذلك ، فإن GluRSs و AspRSs لهما نمط تفاعل متشابه للغاية من الروابط الهيدروجينية وجسور الملح مع مجموعة الكربوكسيل والتفاعلات الضعيفة الكارهة للماء. كلا من aaRS لا يستخدم التحرير ويتم التعامل معه بواسطة فئات aaRS مختلفة. في هذه الحالة ، يمكن أن تعمل هندسة وحجم موقع الربط كطبقة إضافية من الانتقائية وهي آلية يتم استغلالها أيضًا بواسطة ValRS 53،56. لتقدير مساهمة هندسة موقع الربط ، تم فرض سبعة هياكل من GluRS وستة هياكل من AspRS فيما يتعلق ببنية الأدينين المشتركة باستخدام برنامج Fit3D 57. نظرًا لأن هذا التراكب يمكن حسابه فقط لمجمعات بروتين-يجند التي تشبه حالة ما بعد التفاعل ، فقد تم استخدام مجموعة فرعية فقط من الهياكل. تظهر النتائج أن روابط GluRSs و AspRSs موجهة نحو جوانب مختلفة من المستوى المحدد بواسطة البنية التحتية الأدينينية المشتركة (الشكل 3 أ). هناك فرق كبير (Mann-Whitney U ص& lt0.01) في اتجاه الترابط ، الموصوف بزاوية الالتواء بين الفوسفات والبنية التحتية للأحماض الأمينية للرابط (الشكل 3 ب). تتميز أجهزة GluRS من الفئة الأولى بزاوية التواء تبلغ 54.64 ± 7.12 (^ < circ> ) ، بينما تبلغ زاوية الالتواء من الفئة II AspRSs -65.02 ± 7.40 (^ < circ> ). علاوة على ذلك ، تم تقدير حجم الجزء الذي يمنح الخصوصية لموقع الربط (انظر الشكل 1) باستخدام خوارزمية POVME 58. يختلف اختلافًا كبيرًا (Mann-Whitney U ص& lt0.01) بين GluRS (147.00 ± 22.31 Å (^ 3 )) و AspRS (73.34 ± 17.12 Å (^ 3 )). يمكن ملاحظة هذا الاتجاه لجميع هياكل الفئة الأولى والفئة الثانية ، على التوالي. يُظهر تحليل جميع الهياكل التمثيلية للفئة الأولى والفئة الثانية من aaRS أن مواقع الربط من الفئة الأولى هي بشكل كبير (Mann-Whitney U ص& lt0.01) أكبر في المتوسط ​​(الشكل 3C). في حين أن تجاويف الربط من الفئة الأولى لها متوسط ​​حجم 143.40 ± 39.62 Å (^ 3 ) ، فإن مواقع الربط من الفئة الثانية في المتوسط ​​90.36 ± 32.09 Å (^ 3 ) في الحجم.

هندسة الربط وتحليل حجم التجويف الملزم. (أ) هندسة ملزمة لـ GluRSs و AspRS. روابط Aminoacyl من Class I GluRSs و Class II AspRSs في حالة ما بعد التنشيط المتوافقة مع Fit3D 57 فيما يتعلق بالبنية التحتية للأدينين. يتم تصوير نقاط المنتصف للتفاعلات غير التساهمية 46 مع بقايا موقع الربط على أنها كرات صغيرة. الأزرق عبارة عن رابطة هيدروجينية ، والأصفر عبارة عن جسر ملح ، والرمادي عبارة عن تفاعل مسعور. (ب) توزيع زوايا الالتواء بين البنية التحتية للفوسفات والأحماض الأمينية في الليجند. يختلف اتجاه الرابط في موقع الربط اختلافًا كبيرًا (Mann – Whitney U (p & lt0.01 )) بين GluRSs و AspRS. (ج) يختلف حجم جزء منح الخصوصية لموقع الربط ، المقدّر باستخدام خوارزمية POVME 58 ، اختلافًا كبيرًا بين الفئة الأولى والفئة الثانية من aaRS (Mann-Whitney U (p & lt0.01 )).

أنماط التفاعل من aaRSs الفردية

بالإضافة إلى التحقيق في تفضيلات التفاعل من وجهة نظر الترابط ، تم تحليل مواقع الربط لكل aaRS فيما يتعلق بالبقايا التي تشكل تفاعلات مع رابط الأحماض الأمينية. نظرًا لأن كل aaRS مدعوم ببروتينات متعددة من كائنات متنوعة ذات تسلسلات متباينة إلى حد كبير ، فقد ابتكرنا تجريدًا حسابيًا للسماح للقارئ باستنتاج الأحماض الأمينية للبروتينات الفردية عبر محاذاة تسلسل متعددة يحركها الهيكل (MSAs) (انظر قسم "الطرق") . يمكن الاستدلال على أرقام التسلسل الأصلية لكل منصب من خلال جداول التعيين المنشورة جنبًا إلى جنب مع هذه المخطوطة (انظر توفر البيانات). يتوافق كل صف في الجدول مع موضع التسلسل الاصطناعي ، بينما يعطي كل عمود الموضع الأصلي لكل بنية في مجموعة البيانات الخاصة بنا على النحو المحدد بواسطة PDB. يوضح الشكل 4 أ شعار تسلسل 59 تمثيلاً لتفاعلات موقع الربط لـ AlaRS. يمثل كل موضع ملون في شعار التسلسل التفاعلات التي تحدث في هذا الموضع. يمكن ملاحظة التفاعلات المحفوظة للغاية في الموضع المعاد ترقيمه 135. تتشكل تفاعلات رابطة الهيدروجين المقابلة وجسر الملح مع ذرات العمود الفقري للرابط. على جانب البروتين ، يتم التوسط في هذا التفاعل من خلال بقايا أرجينين محفوظة تتوافق مع بقايا N- الطرفية لعزر Arginine Tweezers 43 الموصوف سابقًا. يتشكل تفاعل بارز آخر بواسطة فالين في الموضع المعاد ترقيمه 293. تتفاعل هذه البقايا مع ذرة كربون بيتا لرابط ألانين عبر تفاعلات كارهة للماء. في بعض الهياكل ، يتم استكمال هذا التفاعل الكارثي للماء ببقايا ألانين في الموضع المعاد ترقيمه 325. حمض الأسبارتيك في الموضع المعاد ترقيمه 323 محفوظ بدرجة عالية في AlaRSs ويبدو أنه متورط في تثبيت الأحماض الأمينية عبر الرابطة الهيدروجينية لمجموعة الأمين الأولية. بشكل عام ، فإن التفاعلات التي تمنح الخصوصية مع السلسلة الجانبية الصغيرة للألانين هي ملامسات كارهة للماء. يتم إعطاء مثال للتعرف على الأحماض الأمينية في AlaRSs في الشكل 4 ب. هيكل البكتيرية الإشريكية القولونية يشكل AlaRS مجموعة كاملة من التفاعلات المرصودة. يتم تقديم شعارات التسلسل الخاصة بـ aaRSs المتبقية في SI Appendix Figs. S4 – S24. بناءً على التفاعلات بين مخلفات موقع الربط والرابط ، تم تكوين ملخص نوعي لآليات منح الخصوصية والمخلفات الرئيسية (الجدول 2). علاوة على ذلك ، تم فحص حجم الترابط وعدد التفاعلات المرصودة من أجل الاعتماد. يوجد ارتباط إيجابي ضعيف ولكنه مهم بين متوسط ​​عدد بقايا موقع الارتباط المتفاعل لكل aaRS وعدد جميع الذرات غير الهيدروجينية لرابطة الأحماض الأمينية (بيرسون) ص=0.32, ص& lt0.01). يشير هذا إلى أن عدد التفاعلات المكونة يزيد بشكل عام مع حجم الترابط. ومع ذلك ، لا تحتوي الأحماض الأمينية الأصغر بالضرورة على نمط تمييز أقل تعقيدًا. تقوم ThrRSs ، على سبيل المثال ، بربط ترابط الأحماض الأمينية الخاص بها مع أكثر من دزينة من بقايا موقع الربط ، بينما تستخدم ValRSs في المتوسط ​​خمسة من بقايا مواقع الربط. تسمح مجموعة الهيدروكسيل في ثريونين بتشكيل مجموعة ممتدة من التفاعلات غير التساهمية مع بقايا موقع الربط مقارنةً بالفالين ، حيث يمكن إنشاء جهات اتصال كارهة للماء فقط. توزيعات متبقية موقع الربط المتفاعل لكل aaRS مذكورة في SI Appendix Fig. S25.

أنماط تفاعل الأرس. (أ) شعار 59 من التسلسلات التمثيلية لـ AlaRSs. يشار إلى التفاعلات غير التساهمية مع رابطة الأحماض الأمينية التي تحدث في مواضع معينة بواسطة دوائر ملونة. الدوائر المملوءة هي تفاعلات مع ذرات السلسلة الجانبية ، بينما الدوائر المجوفة هي تفاعلات مع أي من ذرات العمود الفقري لرابطة الأحماض الأمينية. الأزرق عبارة عن رابطة هيدروجينية ، والأصفر عبارة عن جسر ملح ، والرمادي عبارة عن تفاعل مسعور. (ب) تصوير التفاعلات في موقع الربط (نموذج العصا الزرقاء) من AlaRS من الإشريكية القولونية (PDB: 3hxz chain A) مع ligand (نموذج العصا البرتقالية). هنا ، يتم إنشاء روابط هيدروجينية (خطوط زرقاء صلبة) وتفاعلات كارهة للماء (خطوط رمادية متقطعة). يتم إعطاء مواضع التسلسل للمخلفات المتفاعلة وفقًا لـ MSA (أسود) وكذلك الهيكل الأصلي (أحمر). تم إنشاء الشكل باستخدام PyMol 60. يتم الإشارة إلى الروابط المزدوجة بواسطة مقاطع مستقيمة متوازية ، روابط عطرية بخطوط متقطعة دائرية.

المقارنة الكمية للتعرف على الترابط

للسماح بالتحليل الكمي ومقارنة التعرف على الترابط بين العديد من أنظمة aaRS ، تم تمثيل ميزات موقع التفاعل والربط كنواقل ثنائية ، ما يسمى ببصمات التفاعل (انظر قسم "الطرق"). بناءً على بصمات الأصابع هذه ، تم حساب مسافة Jaccard لكل زوج من الهياكل لتمثيل الاختلاف في التعرف على الترابط. بعد ذلك ، تم استخدام خوارزمية التقريب والإسقاط الموحد لتقليل الأبعاد (UMAP) 61 لتقليل الأبعاد وتضمين بصمات الأصابع عالية الأبعاد في بعدين للتصور. يعتبر هذا التضمين أن يكون مساحة التعرف من aaRSs. يمكن رؤية التصور ثنائي الأبعاد لمساحة التعرف هذه (الشكل 5) كخريطة تصف التشابه في التعرف على الترابط عبر جميع أنظمة aaRS. وبالتالي ، تتوافق كل نقطة بيانات مع موقع ربط أحماض أمينية واحد يتميز بميزات موقع التفاعل والترابط. In general, a similar recognition mechanism between two aaRSs can be assumed if they are located close to each other in this map. The more distant two aaRSs are from each other, the less similar their amino acid recognition. However, it has to be noted that the applied dimension reduction does not perfectly conserve distances. Figure 5A shows the embedding results for all aaRSs in the dataset colored according to the aaRS classes. A Principal Component Analysis (PCA) of the same data is given in SI Appendix Fig. S26. For each aaRS the average position of all data points in the embedding space was calculated and is shown as one-letter code label. Figure 5B shows the same data colored according to the physicochemical properties of the amino acid ligand, i.e. positive (lysine, arginine, and histidine), aromatic (phenylalanine, tyrosine, and tryptophan), negative (aspartic acid and glutamic acid), polar (asparagine, cysteine, glutamine, proline, serine, and threonine), and unpolar (glycine, alanine, isoleucine, leucine, methionine, and valine).

Recognition space analysis of all aaRSs. (أ) Embedding 61 space of interaction fingerprints for all aaRS structures in the dataset. Scaling is in arbitrary units. The data points are colored according to the aaRS class. One letter code labels are given for each aaRS based on the averaged coordinates in the embedding space. An asterisk indicates the non-standard amino acids phosphoserine (J*) and pyrrolysine (O*). (ب) Embedding space of interaction fingerprints for all aaRS structures in the dataset except phosphoserine and pyrrolysine. Scaling is in arbitrary units. One-letter codes of amino acid ligands are used to identify each aaRS. Every data point represents an individual protein-ligand complex. The color of the data points encodes the physicochemical properties 49 of the ligand.

الدرجة الأولى

In terms of amino acid binding both aaRS classes seem to employ different overall mechanism they separate almost perfectly in the embedding space. Especially aromatic amino acid recognition in Class I tryptophanyl-tRNA synthetases (TrpRSs) and tyrosyl-tRNA synthetases (TyrRSs) is distinct from Class II aaRSs and forms two outgroups in the embedding space. Remarkably, two different recognition mechanisms exist for TrpRSs, indicated by two clusters approximately at positions (−2.0,6.0) and (1.0,8.5) of the embedding space, respectively. The cluster at position (−2.0,6.0) is formed by structures from bacteria and archaea, while the cluster at position (1.0,8.5) is formed by eukaryotes and archaea and is in proximity to TyrRSs. Closer investigation of two representatives from these clusters shows two distinct forms of amino acid recognition for TrpRSs. Human aaRSs employ a tyrosine residue in order to bind the amine group of the indole ring, while prokaryotes employ different residues (SI Appendix Fig. S27). The Class I aaRSs that are closest to Class II are GluRSs and CysRSs. A cluster of high density is formed by Class I IleRS, MetRS, and ValRS, which handle aliphatic amino acids. This indicates closely related recognition mechanisms and difficult discrimination between these amino acids.

الفئة الثانية

For Class II aaRSs the recognition space is less structured. Nonetheless, clusters are formed that coincide with individual Class II aaRSs, e.g. a distinct recognition mechanism in AlaRSs. The aaRSs handling the small and polar amino acids threonine, serine, and proline are closely neighbored in the embedding space. Recognition of GlyRSs seems to be diverse GlyRSs are not grouped in the embedding space. However, the recognition of glycine, which has no side chain, is limited by definition and thus the fingerprinting approach might fail to capture subtle recognition features. AspRSs and AsnRSs are located next to each other in the embedding space. Their recognition mechanisms seem to be very similar as the only difference between these two amino acids is the carboxylate and amide group, respectively.

Mechanisms that drive specificity

In order to quantify the influence of different aspects of binding site evolution on amino acid recognition by aaRSs, different interaction fingerprint designs were compared against each other. Each design includes varying levels of information and combinations thereof: the sequence composition of the enzyme’s binding site (Seq), non-covalent interactions formed between side chains of the enzyme’s binding site and the amino acid ligand (Int), whether pre- or post-transfer correction (i.e. “editing”) is conducted (Ed), and the overall volume of the enzyme’s binding cavity (Vol). To assess the segregation power of each fingerprint variant, the mean silhouette coefficient 62 , a quantification for the error in clustering methods, over all data points was calculated. This score allows to assess to which extent the recognition of one aaRS differs from other aaRSs and how similar it is within its own group. Perfect discrimination between all amino acids would give a value close to one, while a totally random assignment corresponds to a value of zero. Negative values indicate that the recognition of a different aaRS is rated to be more similar than the recognition of the same aaRS. Figure 6 shows the results of this comparison. When using fingerprints describing the sequence composition of the enzyme’s binding site (Seq (_ ext ) ), the mean silhouette coefficient over all samples is −0.0510, which indicates many overlapping data points and unspecific recognition. By including non-covalent interactions (Seq, Int) the value increases to 0.1361. If pre- or post-transfer correction mechanisms are considered (Seq, Int, Ed), the silhouette coefficient improves further to 0.2731. Adding information about the binding cavity volume (Seq, Int, Ed, Vol) slightly increases the quality of the embedding to 0.2757. The silhouette coefficients for error correction and volume-based fingerprints were calculated as baseline comparison. If only pre- or post-transfer correction mechanisms (Ed) are considered the mean silhouette coefficient amounts to −0.3027. For binding cavity volume (Vol) the mean silhouette coefficient is −0.4682.

Relation to physicochemical properties of the ligands

In order to investigate whether the fingerprinting approach is a simple encoding of the physicochemical properties of the amino acids, the results were related to experimentally determined phase transfer free energies for the side chains of amino acids from water ( (Delta G_) ) and vapor ( (Delta G_) ) to cyclohexane 3,63 . These energies are descriptors for the size and polarity of amino acid side chains and underlie both, the rules of protein folding and the genetic code 64 . The Spearman’s rank correlation between pairwise distances for each aaRS in the recognition space and physicochemical property space is weak with ( ho ) =0.2564 and ص (<0.01) (see SI Appendix Fig. S28). This indicates that the fingerprinting approach used in this study is a true high-dimensional representation of the complex binding mechanisms of amino acid recognition in aaRSs. This assumption is supported by a PCA (SI Appendix Fig. S26) of the fingerprint data, where the first two principal components account for only 9.24% and 8.44% of the covered variance, respectively.

Comparison of different fingerprint designs that include the sequence composition of the enzyme’s binding site (Seq), non-covalent interactions formed between side chains of the enzyme’s binding site and the amino acid ligand (Int), pre- or post-transfer correction (i.e. “editing”) mechanisms (Ed), and volume of the enzyme’s binding cavity (Vol). Simple sequence-based fingerprints (Seq (_ ext ) ) are a 20-dimensional representation of binding site composition. The line plot shows the silhouette coefficient 62 for each embedding. Points represent mean values, error bars are calculated based on all silhouette coefficients for each data point.


مناقشة

In this study, we characterize the translocation of threonine, α-aminobutyrate, and cysteine during editing by ValRS. For all three amino acids, the translocation rates are similar to their respective overall editing rates (2.7–3.5 s −1 ). The rate of translocation is considerably slower than the maximum rate of hydrolysis of exogenously added misacylated tRNA Val (20–40 s −1 ) (18, 19). Thus, once the misactivated amino acid is translocated to the site for editing, the chemical step for hydrolysis is relatively instantaneous. Consequently, under normal circumstances where a noncognate amino acid is mixed with tRNA Val , translocation is rate-limiting for editing.

The close similarities in the translocation rate constants measured for threonine and cysteine establish that the editing domain is not designed to select a specific misactivated amino acid. This possibility is supported by our observation that α-aminobutyrate also is efficiently translocated during editing, even though it is an unnatural amino acid in بكتريا قولونية (hence, the existence of evolutionary pressure on the بكتريا قولونية editing domain to select α-aminobutyrate as a substrate is not obvious). Instead, to carry out its role as the “fine sieve” in the double-sieve-editing model, the editing domain probably is structured to accept all misactivated amino acids and to strictly prevent the entrance of the activated cognate amino acid.

The translocation of misactivated amino acid during ValRS editing is thought to occur primarily by the posttransfer pathway, that is, by the deacylation of mischarged tRNA Val (20). A possible molecular mechanism for posttransfer editing in IleRS has been inferred from the structure of IleRS complexed to tRNA Ile (9). Specifically, the last three nucleotides of the tRNA (74–76) are proposed to adopt two conformations in the IleRS⋅tRNA Ile complex. The hairpinned conformation projects the A 76 nucleotide into the active site of the enzyme, where it can be aminoacylated, whereas the stacked conformation places the A 76 nucleotide in the editing domain, where an incorrect amino acid (attached to A 76 ) can be hydrolyzed. The switch from the hairpinned to the stacked conformation could therefore provide the mechanism for translocation during editing.

A similar mechanism might be responsible for the translocation of misactivated amino acids during editing by ValRS. In such a mechanism, the rate of translocation will depend primarily on the rate of the tRNA switching from the hairpinned to the stacked conformation, and not on the side chain of the amino acid attached to the tRNA. This prediction is consistent with our observation that threonine, α-aminobutyrate, and cysteine are translocated with similar efficiencies. It also implies that there is no physical contact between the amino acid side chain and the surface of the enzyme that lies between the synthetic active site and the editing site. If the side chain of an aminoacyl group made contact with the enzyme during translocation, then the difference between the more polar threonine and cysteine, on the one hand, and the hydrophobic α-aminobutyrate, on the other, would probably be reflected in different rates of translocation. Thus, we infer that the amino acid side chain points out, away from the surface of the protein during translocation.


How do aminoacyl-tRNA synthases distinguish between similar amino acids? - مادة الاحياء

a School of Biology, Biomedical Sciences Research Complex, University of St Andrews, St Andrews, Fife KY16 9ST, UK
بريد الالكتروني: [email protected]

b Arab Academy for Science, Technology, and Maritime Transport (AASTMT), Cairo Campus, Egypt

c Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, University of Edinburgh, Waddington 1 Building, King's Buildings, Edinburgh, UK

الملخص

Cyclodipeptide synthases (CDPSs) produce a variety of cyclic dipeptide products by utilising two aminoacylated tRNA substrates. We sought to investigate the minimal requirements for substrate usage in this class of enzymes as the relationship between CDPSs and their substrates remains elusive. Here, we investigated the Bacillus thermoamylovorans enzyme, BtCDPS, which synthesises cyclo(إل-Leu–إل-Leu). We systematically tested where specificity arises and, in the process, uncovered small molecules (activated amino esters) that will suffice as substrates, although catalytically poor. We solved the structure of BtCDPS to 1.7 Å and combining crystallography, enzymatic assays and substrate docking experiments propose a model for how the minimal substrates interact with the enzyme. This work is the first report of a CDPS enzyme utilizing a molecule other than aa-tRNA as a substrate providing insights into substrate requirements and setting the stage for the design of improved simpler substrates.


Avalos J, Corrochano LM, Brenner S (1991) Cysteinyl-tRNA synthetase is a direct descendant of the first aminoacyl-tRNA synthetase. FEBS Lett 286:176–180

Campbell J (1991) An RNA replisome as the ancestor of the ribosome. J Mol Evol 32:3–5

Crick FHC (1968) The origin of the genetic code. J Mol Biol 38:367–379

Crick FHC, Brenner S, Klug A, Pieczenik G (1976) A speculation on the origin of protein synthesis. Orig Life 7:389–397

Cusack S (1993) Sequence, structure and evolutionary relationships between class 2 aminoacyl-tRNA synthetases—an update. Biochimie 75:1077–1081

Cusack S, Berthet-Colominas C, Hartlein M, Nassar N, Leberman R (1990) A second class of synthetase structure revealed by X-ray analysis of Escherichia coli seryl-tRNA synthetase at 2.5Å. Nature 347:249–255

Cusack S, Härtlein M, Leberman R (1991) Sequence, structural and evolutionary relationships between class 2 aminoacyl-tRNA synthetases. Nucleic Acids Res 19:3489–3498

Doolittle RF (1979) Protein evolution. In: Neurath H, Hill RL (eds). The proteins. Academic Press, New York, p 1

Doolittle RF (1987) Of urfs and orfs. University Science Books, Mill Valley, CA, pp 26–28

Doolittle RF (1994) Convergent evolution: the need to be explicit. Trends Biochem Sci 19:15–18

Doolittle RF, Feng DF (1990) Nearest neighbor procedure for relating progressively aligned amino acid sequences. Methods Enzymol 183:659–669

Eriani G, Delarue M, Poch O, Gangloff J, Moras D (1990) Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs. Nature 347:203–206

Eriani G, Dirheimer G, Gangloff J (1991) Cysteinyl-tRNA synthetase: determination of the last E. coli aminoacyl-tRNA synthetase primary structure. Nucleic Acids Res 19:265–269

Feng DF, Doolittle RF (1990) Progressive alignment of phylogenetic tree construction of protein sequences. Methods Enzymol 183:375–387

Hou Y-M, Shiba K, Mottes C, Schimmel P (1991) Sequence determination and modeling of structural motifs for the smallest monomeric Amnoacyl-tRNA synthetase. Proc Natl Acad Sci USA 88:976–980

Hountondji C, Blanquet S, Lederer F (1985) Methionyl tRNA synthetase from الإشريكية القولونية: primary structure at the binding site for the 3′end of tRNA-fMet. Biochemistry 24:1175–1180

Jacobo-Molina A, Peterson R, Yang DCH (1989) cDNA sequences, predicted primary structure and evolving amphiphilic helix of human aspartyl-tRNA synthetase. J Biol Chem 264:16608–16612

Lamour V, Quevillon S, Diriong S, N'Guyen VC, Lipinski M, Mirande M (1994) Evolution of the Glx-tRNA synthetase family: the glutaminyl-enzyme as a case of horizontal gene transfer. Proc Natl Acad Sci USA (in press)

Majerfeld I, Yarus M (1994) An RNA pocket for an aliphatic hydrophobe. Nature Struct Biol 1:287–292

Moras D (1992a) Aminoacyl-tRNA synthetases. Curr Opin Struct Biol 2:138–142

Moras D (1992b) Structural and functional relationships between aminoacyl-tRNA synthetases. Trends Biochem Sci 17:159–164

Mosyak L, Safro M (1993) Phenylalanyl-tRNA synthetase from ثيرموفيلوس has four antiparallel folds of which only two are catalytically functional. Biochemie 75:1091–1098

Nagel GM, Doolittle RF (1991) Evolution and relatedness in two aminoacyl-tRNA synthetase families. Proc Natl Acad Sci USA 88:8121–8125

Orgel LE (1968) Evolution of the genetic apparatus. J Mol Biol 38:381–393

Orgel LE (1989) The origin of polynucleotide-directed protein synthesis. J Mol Evol 29:465–474

Ruff M, Krishnaswamy S, Boeglin M, Poterszman A, Mitschler A, Podjarny A, Rees B, Thierry JC, Moras D (1991) Class II aminoacyl transfer RNA synthetases: crystal structure of yeast aspartyl-tRNA synthetase complex with tRNA (Asp). Science 252:1682–1689

Schimmel P (1991) Classes of Amnoacyl-tRNA synthetases and the establishment of the genetic code. Trends Biochem Sci 16:1–3

Schimmel P, Giegét R, Moras D, Yokoyama S (1993) An operational RNA code for amino acids and possible relationship to genetic code. Proc Natl Acad Sci USA 90:8763–8768

Szathmáry E (1993) Coding coenzyme handles: a hypothesis for the origin of the genetic code. Proc Natl Acad Sci USA 90:9916–9920

Taylor FJR, Coates D (1989) The code within the codons. Biosystems 22:177–187

Walker EJ, Jeffrey PD (1988) Sequence comparisons in the aminoacyl-tRNA synthetases with emphasis on regions of likely homology with sequences in the Rossmann fold in the methionyl and tyrosyl enzymes. Protein Seq Data Anal 1:187–193

Weiner AM, Maizels N (1987) tRNA-like structures tag the 3′ ends of genomic RNA molecules for replication: implications for the origin of protein synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 84:7383–7387

Wetzel R (1978) Aminoacyl-tRNA synthetase families and their significance to the origin of the genetic code. Orig Life 9:39–50

Woese CR (1967) The genetic code. Harper & Roe, New York

Wong JT (1975) A co-evolution theory of the genetic code. Proc Natl Acad Sci USA 72:1909–1912

Wong JT (1991) Origin of genetically encoded protein synthesis: a model based on selection for RNA peptidation. Orig Life 21:165–176

Yarns M (1988) A specific amino acid binding site composed of RNA. Science 240:1751–1758


Quality control of the translation machinery

Faithful translation of the mRNA codons into protein is essential for cellular physiology. The fidelity of the translation machinery firstly depends on the specific coupling of amino acids to their cognate tRNA species, which is catalyzed by aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs) (Fig 4a and 4b). aaRS is capable of discriminating its cognate substrates from structurally analogous tRNAs and amino acids [39]. Subsequently, eukaryotic elongation factor 1A (eEF-1A) or prokaryotic EF-Tu delivers the aminoacyl-tRNA to the ribosome A site for elongation of nascent peptide chain after proper codon–anticodon recognition [40]. Thus, aaRSs are cardinal in protecting protein synthesis against misacylation [39], but their specificity is not absolute. على سبيل المثال ، في ه. القولونية, four types of misacylated-tRNA—including Cys-tRNA Pro , Ser-tRNA Thr , Glu-tRNA Gln , and Asp-tRNA Asn —do not evoke a correctional reaction [41]. In both mice and bacteria, serine is prone to be misacylated by alanyl-tRNA synthetases (AlaRSs) [42]. In mycobacteria, an increase in the substitution of glutamic acid→glutamine and aspartic acid→asparagine by translational misincorporation has been linked to phenotypic resistance to rifampicin treatment [43]. Thus, beneficial mistranslation in both prokaryotes and eukaryotes may exist and improve their survival or facilitate drug resistance [43–45]. Apart from misdecoding, misacylation of amino acids to tRNA molecules is another important source of mistranslated proteins, despite the presence of mechanisms preventing such events.

(a) aa-tRNAs are synthesized by sampling from the amino acid pool and tRNA pool and require catalysis by aaRSs. This process may accidently introduce misacylated aa-tRNAs, because the types of tRNAs and amino acids are difficult to be distinguished by involved aminoacyl synthetase because of analogous structures. (b) During elongation, tRNA wobbling will increase translation efficiency. Misincorporation can also be introduced because of tRNA misdecoding (amino acid misincorporation caused by excessive wobble decoding), especially when certain codon-paired tRNA species are missing. Finally, the fidelity of translation machinery will be impaired and produce mutated proteome, including RNA and DNA polymerases, aaRSs, and accessories. (c) Mistranslation of RdRP in RNA viruses will augment generation of a mutated virome (quasispecies) and facilitate viral evolution and adaption. (d) Similarly, mistranslation of cellular DNA replication-related enzymes and relative proteins amplifies mutagenesis in the genome and contributes to cancer development. aaRS, aminoacyl-tRNA synthetase aa-tRNA, aminoacyl-tRNA RdRP, RNA-dependent RNA polymerase tRNA, transfer RNA.

How could tRNA wobbling guarantee faithful decoding by the codon–anticodon duplex? During elongation, eEF-1A or EF-Tu delivers amino acid–coupled tRNA to the ribosome A site [40]. Subsequently, the ribosome rechecks the codon–anticodon duplex that involves the highly conserved G530, A1492, and A1493 of 16S RNA via stabilization of the first two Watson-Crick pairs of the duplex [31, 46]. A correct confirmation of the codon–anticodon duplex will induce a conformational domain closure in the ribosome and result in the formation of the appropriate peptide bond and elongate the nascent protein [47]. Analysis of X-ray structures suggests that the positions 1 and 2 of the A codon are obligatory Watson-Crick base pairs. In prokaryotes, when U•G and G•U wobbles at the first or second codon–anticodon position, the decoding center forces this pair to adopt the geometry close to that of a canonical C•G pair [40]. Using nuclear magnetic resonance (NMR) relaxation dispersion, it has recently been revealed that dG•dT misincorporation during replication is likely mediated via tautomerization and ionization [37]. As discussed, these Watson-Crick-like mismatches may further contribute to tRNA wobbling and consequently misdecoding [5]. Although the hydrogen bond is the major force to form codon–anticodon pairs [1], the van der Waals forces, steric complementarity, and shape acceptance may concurrently contribute to the codon–anticodon recognition essentially for quality control [3, 40].


Not an inside job: non-coded amino acids compromise the genetic code

The sophistication of the editing mechanisms that prevent gene translation errors indicates that amino acid misincorporation is generally a problem to be avoided. Mistranslation is considered invariably deleterious and often caused by confusion between similar proteogenic amino acids. These views are being challenged. The evidence linking misincorporation of dietary non-proteogenic amino acids to human disease continues to grow, and a report in this issue of The EMBO Journal demonstrates the importance of preventing non-proteogenic amino acid misincorporation for cellular homeostasis (Cvetesic etਊl, 2014).

أنظر أيضا: N Cvetesic وآخرون (August 2014)

The genetic code holds the key to translate 64 codons into 20-odd amino acids. The enzymes that aminoacylate tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases (ARS), are the keepers of the code as they create the molecular link between amino acids and triplet information in the tRNA. ARS form two families of enzymes with a peculiar symmetric organization that clusters them in groups that recognize chemically similar amino acids. These two families possibly emerged from an ancestral complex of two proteins around a single tRNA molecule that evolved to increase the number of cognate substrates as the genetic code grew to its extant size. This expansion in cognate substrates logically involved the gradual incorporation of relatively similar side chains to those that were previously used (Ribas de Pouplana & Schimmel, 2001).

The extent to which some proteogenic amino acids are similar to each other𠅊s well as the structural organization of the ARS themselves𠅎xplain the difficulty in discriminating between certain residues during tRNA aminoacylation. To make matters worse, several nonprotein amino acids, which are ubiquitous in many cellular metabolic pathways, can also be mistakenly incorporated into proteins through ARS recognition errors that also require editing reactions to be corrected (Jakubowski, 2012).

Linus Pauling was the first to note that the chemical proximity between some side chains makes it impossible for ARS to discriminate between them with a tolerable error rate (Pauling, 1958). Hence the necessity of editing activities to remove incorrectly charged amino acids was postulated. A “second sieve” model for aminoacylation editing was proposed by Alan Fersht, and later proven to exist in several ARS (reviewed in Yadavalli & Ibba, 2012).

Valine, isoleucine, and leucine are good examples of amino acids requiring proofreading due to their chemical similarity. The discovery of a common editing domain shared by the ARS cognate to these three residues reinforced the notion that misincorporations would mostly involve related proteogenic amino acids, and that such errors always need to be corrected. However, mistranslation need not be limited to proteogenic amino acids and, in some cases, it may offer adaptive advantages to cells.

In this issue of The EMBO Journal Gruic-Sovulj and colleagues elegantly demonstrate that the editing domain of leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) is not designed to fend off the misincorporation of isoleucine, as was previously thought. Earlier reports that suggested otherwise were marred by an unsuspected contamination of leucine in commercial preparations of isoleucine. Once the contaminating cognate amino acid is removed from the reaction the authors clearly show, by kinetic, structural, thermodynamic and في الجسم الحي approaches, that isoleucine is in fact a very poor substrate for LeuRS, which gets discriminated early in the reaction cycle and is not incorporated (substantially) to tRNA (Cvetesic etਊl, 2014). This clearly obviates a need for isoleucine editing (Fig ​ (Fig1 1 ).

Contrary to previous belief isoleucine is very effectively discriminated by the synthetic active site of LeuRS, and is not activated nor transferred to tRNALeu. Norvaline is easily charged to tRNA, and requires a posterior docking into the editing domain of the enzyme to prevent its incorporation into proteins.

Norvaline, a non proteogenic amino acid that in microaerobic conditions accumulates in the cytosol of E.਌oli (Soini etਊl, 2008) is, on the other hand, an excellent analog of leucine and is readily mischarged to tRNA Leu by LeuRS. However, accumulation of norvaline-tRNA Leu is prevented by the editing domain of LeuRS (Cvetesic etਊl, 2012).

A beautiful physiologic explanation to this biochemistry is offered in the paper when the authors show that E.਌oli grown under aerobic conditions do not require editing by LeuRS, whereas this activity becomes essential when intracellular concentrations of norvaline increase as a result of growth in microaerobic conditions.

Norvaline thus joins the ranks of non-proteogenic amino acids that can be misincorporated into proteins and cause toxicity. Indeed, recent reports have established links between several types of human neurodegeneration and the ingestion of non-proteogenic amino acids. For example, beta-methylamino-L-alanine is an amino acid analog taken up in the diet, and mischarged by seryl-tRNA synthetases respectively due to its similarity to serine (Dunlop etਊl، 2013). It is still unclear why the nervous system is more affected by this insult than other tissues.

Opposite to the previous examples, a body of literature is also starting to accumulate that reports on cellular strategies that utilize mistranslation to improve biologic fitness. For example, the adaptive nature of random variations in the proteome caused by amino acid misincorporation has been demonstrated in المبيضات البيض. The proteome of this pathogenic fungus undergoes generalized serine to leucine substitutions as an adaptive strategy that increases the virulence of this species (Moura etਊl, 2010).

The existence of an adaptive mistranslation has been confirmed in bacteria and human cells, and we now know that the mis-methiolation of proteins is a strategy used across the phylogenetic tree to minimize the damage caused by oxidative stress (Pan, 2013). Thus, amino acid misincorporation needs not be a deleterious mistake, but can sometimes be seen as a beneficial relaxation in translation fidelity that increases the fitness of the organism.


The return of pretransfer editing in protein synthesis

The accuracy with which the genetic information contained in protein-coding genes is faithfully translated into the corresponding sequence of amino acids has long fascinated biologists. Before the mechanisms of transcription and protein synthesis had been uncovered in the exquisite molecular detail we know today, some of the inherent problems of faithful gene expression were obvious. Crick's seminal adaptor hypothesis (1) predicted the existence of many then-unknown components of translation, including the aminoacyl-tRNA synthetases. The aminoacyl-tRNA synthetases in effect define the genetic code by catalyzing a 2-step reaction that pairs amino acids with their cognate tRNAs to provide substrates for ribosomal protein synthesis. In the first step, an amino acid is condensed with ATP to form an aminoacyl-adenylate. In the second reaction, the aminoacyl group is transferred to the 3′ end of the tRNA. The aminoacyl-tRNA synthetases also provide a critical safeguard to maintain fidelity during translation of the genetic code by discriminating against and, when necessary, editing noncognate amino acids. Crick was quick to point out that specificity would be of paramount importance to the synthetases, because their function in protein synthesis would require them to precisely distinguish similar amino acids such as isoleucine and valine. Linus Pauling (2), who reasoned that small differences in binding energy between aliphatic amino acids would not provide the level of discrimination necessary for faithful protein synthesis, had also noted this particular problem in molecular recognition. This discrepancy, between the specificity achievable during recognition and the accuracy required for translation, was resolved with the discovery of editing.

It was observed that although isoleucyl-tRNA synthetase did indeed recognize and activate valine, the intermediate valyl-adenylate was subsequently hydrolyzed in a tRNA-dependent reaction (3). The net result is that although isoleucyl-tRNA synthetase can use both isoleucine and valine, only the cognate product isoleucyl-tRNA Ile accumulates. Numerous studies of isoleucyl-tRNA and other synthetases have provided a general picture of the structure and mechanism of editing (Fig. 1). It had long been known that editing could occur either before (pretransfer) or after (posttransfer) amino acids are covalently attached to tRNA, an essential component of the protein synthesis machinery. In both cases the net result is the same, synthesis and release of noncognate aminoacyl-tRNA is prevented and translational accuracy is maintained. In recent years the biological relevance of the pretransfer route had come under question, and the prevailing dogma was that, with a few notable exceptions, editing was essentially a posttransfer process. In this issue of PNAS, Martinis and coworkers (4) now show that posttransfer editing can mask pretransfer editing activity, a finding with far-reaching implications for both quality control and the evolution of protein synthesis.

Posttransfer editing can mask pretransfer editing activity.

Pretransfer and posttransfer editing of noncognate amino acids by aminoacyl-tRNA synthetases. The amino acid (AA) is activated in an ATP-dependent reaction at the active site (AS) to form an enzyme-bound aminoacyl-adenylate (AA-AMP). In pretransfer editing, AA-AMP is hydrolyzed directly, thereby preventing the synthesis of a noncognate aminoacyl-tRNA. In posttransfer editing, AA-AMP is a substrate for esterification of the 3′ end of the tRNA, which then translocates to the editing site (ES) where the AA is removed. PPi, pyrophosphate.

The posttransfer reaction either occurs in cis, before the noncognate aminoacyl-tRNA is released, or in trans catalyzed by synthetases or specific hydrolases (5). A large number of biochemical and structural studies have clearly shown that this reaction occurs in a second active site that is distinct from the ancient catalytic core. Less frequently, the noncognate aminoacyl-adenylate will be hydrolyzed before tRNA esterifcation in a so-called pretransfer reaction (6). However, the relationship between these 2 pretransfer and posttransfer editing pathways has remained unclear in most systems. In particular, the mechanism and physiological relevance of pretransfer editing has continued to be contentious. Many of the points of dispute arise from the inherent instability of aminoacyl-adenylates, which makes their study difficult in vitro and almost impossible in vivo. In addition, much of the controversy surrounding the pretransfer pathway had come from difficulties in envisioning the molecular mechanism by which an unstable aminoacyl-adenylate could translocate some 30 Å from the active site before hydrolysis. Indeed, several examples of pretransfer editing by synthetases that lack a separate editing domain have been reported (7 ⇓ –9).

Leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) presents an ideal model system for studying the relationship between, and relative significance of, pretransfer and posttransfer editing. In addition to the well-documented modularity of the conserved CP1 editing domain (10 ⇓ –12), different LeuRSs show widely divergent editing mechanisms. على سبيل المثال، الإشريكية القولونية LeuRS is known to use a posttransfer editing mechanism to deacylate tRNAs charged with a variety of noncognate amino acids, including isoleucine, valine, norvaline, and methionine. Most notably for the present study, although it has been proposed that the yeast enzyme predominantly relies on pretransfer editing, the بكتريا قولونية enzyme shows no such activity and solely uses posttransfer editing (13). In their study, Martinis and coworkers (4) set out to exploit the known properties of the بكتريا قولونية enzyme to probe the relationship between pretransfer and posttransfer editing in more detail.

Previous studies had suggested that particular residues are needed for the effective transfer of editing substrates from the synthetic active site to the hydrolytic editing site in the CP1 module of LeuRS (14). To study this postulated translocation pathway Martinis and coworkers (4) used a combination of LeuRS mutants defective in posttransfer editing and CP1 deletion mutants of both بكتريا قولونية (ecΔCP1) and yeast mitochondrial (ymΔCP1) LeuRSs. The ΔCP1 deletion mutants were found to retain significant cognate aminoacylation activity (Leu-tRNA Leu synthesis), although they did show some loss compared with the wild type. This modest loss in leucylation by the ΔCP1 mutants was not unexpected and was consistent with suggestions that the CP1 domain stabilizes enzyme–tRNA interactions. When tested for hydrolysis in trans of noncognate Ile-tRNA Leu , both of the ΔCP1 deletion mutants display negligible levels of deacylation, confirming that, as expected, these mutants retain little or no posttransfer editing activity. Martinis and coworkers next performed a final control and tested the ability of the mutants to synthesize mischarged tRNAs, a typical property of enzymes in which posttransfer editing has been disrupted. Whereas the editing-site mutant T252Y showed robust Ile-tRNA Ile synthesis as predicted, the ecΔCP1 and ymΔCP1 mutants were incapable of mischarging tRNA Leu with Ile. Pyrophosphate exchange assays performed to test the misactivation of Ile and other noncognate substrates showed that the ecΔCP1 mutant misactivated Ile to a level comparable with that of wild type. The ability of ecΔCP1 to misactivate Ile, together with its inability to form Ile-tRNA, suggested the existence of a dormant pretransfer editing activity, which is only apparent when the posttransfer editing CP1 domain is removed. Finally, by using inactive tRNAs modified to lack the site for amino acid attachment, pretransfer editing activity was shown to be strongly stimulated by tRNA despite the absence of the CP1 domain.

In unveiling pretransfer editing activity in بكتريا قولونية LeuRS, an enzyme believed to solely depend on posttransfer editing for quality control, Martinis and coworkers (4) raise a number of questions about the origin and function of editing. The most immediate result of their study is to force a reassessment of tRNA-dependent pretransfer editing. Their work clearly shows that translocation to a distinct editing domain is not a prerequisite for tRNA-dependent pretransfer editing as had previously been proposed, which, in turn, raises the question as to how tRNA facilitates editing without itself being aminoacylated. Presumably this would involve increasing the rate of hydrolysis within the active site itself and/or accelerating adenylate dissociation as a prelude to spontaneous hydrolysis, both of which were recently shown to contribute to tRNA-independent editing by prolyl-tRNA synthetase (6). However this particular pretransfer editing mechanism is eventually resolved, the observation that the extant بكتريا قولونية LeuRS:tRNA Leu pair contains the functional remnants of a rudimentary ribonucleoprotein has some interesting evolutionary implications. The tRNA dependence of this hidden pretransfer editing activity is consistent with the coevolution of tRNAs and quality-control mechanisms, helping to explain how structurally similar amino acids were added to the genetic code without compromising the fidelity of translation.

The biggest remaining mystery of this study is why the بكتريا قولونية LeuRS has retained a “hidden” capacity for pretransfer editing that would appear to be redundant given that it already has robust posttransfer activity. Editing is not ubiquitous to synthetases as illustrated by the fact that some enzymes, including human mitochondrial LeuRS, have lost their proofreading capacity and rely instead on accurate substrate recognition (15 ⇓ –17). In this context, the retention of 2 distinct editing pathways is all the more surprising and would seem to suggest that the pretransfer reaction of بكتريا قولونية LeuRS may actually be required for an activity other than translational quality control. No matter what this activity might turn out to be, to paraphrase Mark Twain, reports of the death of pretransfer editing are greatly exaggerated.


شاهد الفيديو: Amino Acids classification - الأحماض الأمينية وتصنيفها - Bio chemistry - تعلم بالعربي (سبتمبر 2022).


تعليقات:

  1. Baptiste

    انت على حق تماما. يتعلق الأمر بشيء مختلف وفكرة حفظ.

  2. Johannes

    يمكنني أن أوصي بالحضور إلى الموقع ، حيث يوجد الكثير من المعلومات حول هذه المسألة.

  3. Sorel

    هل تعتبر نفسك شخصًا عصريًا وتريد أن تعرف كل شيء عن السلع والخدمات التي يزخر بها سوق المستهلك اليوم؟ تفضل بزيارة موقعنا على الويب لمجموعة متنوعة من المقالات التي ستوفر لك الرأي المهني لأي منتج تقريبًا في السوق اليوم.

  4. Kelby

    في رأيي ، أنت مخطئ. يمكنني إثبات ذلك. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا على PM.

  5. Fortun

    فكرت وحذفت الرسالة



اكتب رسالة