معلومة

تحسين كفاءات التحويل - تحفيز الالتفاف الفائق؟

تحسين كفاءات التحويل - تحفيز الالتفاف الفائق؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

من خلال معرفتي المحدودة بالعلوم ، أعلم أن التحول يمكن أن يكون أحد أصعب خطوة في الاستنساخ ، وأنه قد تم إجراء قدر كبير من البحث / التجربة والخطأ لتحسين هذه الخطوة. لقد سمعت أن تقنية Electroporation هي أكثر التقنيات كفاءة ، على الرغم من عدم وجود مرجع ، وبالطبع تحتوي الخلية والوسائط والمدة على أجزاء حيوية تلعبها في هذه العملية.

ومع ذلك ، لم أسمع أبدًا عن الالتفاف الفائق كعامل مهم. يلعب حجم البلازميد دورًا كبيرًا في التحول ، لذلك يجعلني بديهيًا أعتقد أن الالتفاف الفائق للبلازميد قبل التحول من شأنه تحسين الكفاءة. اعتقدت أن التحول هو ببساطة انتشار الحمض النووي من خلال الثقوب ، ولكن هل أجزاء من البلازميد مطلوبة للارتباط / التفاعل مع المضيف؟

لماذا لا نقترح علينا supercoil قبل التحول؟ لدي العديد من الأفكار ولكني أخمن فقط:

  • هل لأن الجيراسي يمكن أن يعطل سلامة الحمض النووي؟
  • أم أنه مجرد إنزيم باهظ الثمن ولا يستحق الربح؟
  • أو ربما يقلل الالتواء الفائق من كفاءة المحضرات / النسخ اللاحق للبلازميد (على الرغم من أنه لن يكون لفائق الإنزيمات الطبيعية للمضيف على أي حال؟)

فيما يلي تقرير يوضح زيادة ملحوظة في كفاءة التحويل للبلازميدات الكبيرة (تم التحويل عن طريق التثقيب الكهربائي. ومع ذلك فقد تم الاستشهاد بالورقة أقل من عشر مرات ، لذا من الواضح أن التقنية لم تلتقطها.

Zhixing، Y and Nahon، J-L (1995) يحسن DNA gyrase تحويل الحمض النووي لخلايا الإشريكية القولونية ذات البلازميدات الكبيرة المؤتلفة. الدقة الأحماض النووية. 23: 3353-3354


اللف الفائق للحمض النووي

الملخص

يصف الالتواء الفائق للحمض النووي بنية DNA عالية المستوى. يستلزم التركيب الحلزوني المزدوج للحمض النووي تشابك خيطين متكاملين حول بعضهما البعض وحول محور حلزوني مشترك. إن التواء هذا المحور الحلزوني في الفضاء يحدد البنية الفائقة للحمض النووي (البنية الثلاثية للحمض النووي). بالنسبة للحمض النووي الدائري أو الحمض النووي الخطي مع نهاياته المثبتة لإنشاء حلقة ، هناك اقتران طوبولوجي محكم بين البنية الفائقة للحمض النووي والبنية الحلزونية المزدوجة (البنية الثانوية للحمض النووي). وبالتالي ، يمكن أن تؤثر الطبقة الفائقة للحمض النووي على لف / فك الحمض النووي ، مما يؤثر على الوظائف البيولوجية للحمض النووي. في الطبيعة ، توجد فئة منتشرة في كل مكان من الإنزيمات ، DNA topoisomerases ، والتي يمكن أن تتوسط التحول الطوبولوجي في جزيئات الحمض النووي.


الملخص

كرمة (فيتيس spp.) أحد أهم محاصيل الفاكهة من الناحية الاقتصادية في جميع أنحاء العالم ، وهناك اهتمام كبير بتحسين سماته الزراعية والتشريعية الرئيسية استجابة للبيئات الزراعية المتغيرة باستمرار وطلبات المستهلكين. توفر التقنيات الوراثية الجزيئية على وجه الخصوص ، المرتبطة بالتقدم التكنولوجي السريع ، بديلاً جذابًا لأساليب التربية التقليدية لتطوير أصناف جديدة من العنب مع تحسين أداء الغلة والجودة وتحمل الإجهاد ومقاومة الأمراض. حتى الآن ، تم تحويل العديد من أنواع العنب مع الجينات المرتبطة بوظائف متنوعة من خلال القصف البيولوجي و / أو الأجرعيةتم الحصول على سلالات عنب معدلة وراثيًا باستخدام أنظمة التجديد المعمول بها. ومع ذلك ، فقد ثبت أن مجموعة واسعة من العوامل ، بما في ذلك التركيب الوراثي ومصدر النبات ووسط الاستزراع ، تؤثر على كفاءة تجديد النبات. علاوة على ذلك ، فإن اختيار واستخدام المواد المقبولة والسلالة البكتيرية وكثافة الخلية والعلامات المختارة وطرق الاختيار تؤثر أيضًا على كفاءة التحول. تقدم هذه الورقة لمحة عامة عن التطورات الحديثة في تجديد العنب والتحول الجيني ومناقشة متعمقة للعوامل المحددة الرئيسية ، وتناقش الاستراتيجيات المستقبلية الواعدة لتطوير تجديد قوي للنبات والتحول الجيني في العنب.


تحسين كفاءة التحويل الكهربائي الوتدية الجلوتاميك عن طريق إضعاف جدار الخلية وزيادة سيولة الغشاء السيتوبلازمي

لتحسين كفاءة التحول الوتدية الجلوتاميك الخلايا ذات DNA البلازميد غير المتجانسة والحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) باستخدام منهجية تعتمد على التحويل الكهربائي.

نتائج

تم اختيار وسط مفرط التوتر نصف مركب مع إضافة الجلايسين و dl -threonine لإضعاف جدران الخلايا وإضافة Tween 80 وهيدرازيد حمض isonicotinic لزيادة سيولة الغشاء السيتوبلازمي. تم تحسين محتوياتها من خلال منهجية سطح الاستجابة. كما تم تحسين نمو الخلية ، ومخزن التحول الكهربائي ، وبروتوكول التحول. أظهر تعطيل التسخين المؤقت لإنزيم تقييد العائل تأثيرًا معنويًا. أخيرًا ، كفاءة تحويل عالية تبلغ 3.57 ± 0.13 × 10 7 cfu / ميكروغرام DNA للبلازميد و 1.05 × 10 6 Str ص تم تحقيق cfu لكل 10 9 خلايا قابلة للحياة باستخدام ssDNA.

استنتاج

سلطت النتائج الضوء على التطبيق في الجينوميات الوظيفية وتحرير الجينوم C. الجلوتاميك.


مناقشة

لقد طورنا اختبارًا قائمًا على PNA والذي سمح لنا بربط البلازميدات فائقة الالتفاف بين شرائح الغطاء والخرز. لقد بحثنا في الديناميكيات الداخلية لأحزمة الحمض النووي الفردية ، كلا من البلازميدات فائقة الالتفاف ، والبلازميدات المسترخية ، والحبال الخطية ، بالإضافة إلى حلقات الحمض النووي التي يتوسطها البروتين في نظام فائق الالتفاف.

تمت مقارنة RMSDs للحمض النووي الفائق الالتفاف والمرتاح والخطي ، ووجد أن RMSD للبلازميد فائق الالتواء المتشابك كان أصغر بكثير من تلك الموجودة في البلازميد المريح والخطي ، والتي كانت قابلة للمقارنة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن البلازميد الفائق الالتفاف أظهر وقت استرخاء أسرع بكثير من البلازميد المريح والحبل الخطي ، وهو ما يماثل التجاور المحسن للموقع في حالة الالتفاف الفائق. تدعم هذه النتائج عمليات محاكاة الديناميات الجزيئية المنشورة سابقًا (19) ومقايسات النسخ في المختبر (18).

تمت دراسة المعلمات الديناميكية الحرارية لحلقات الحمض النووي سابقًا في الجسم الحي (21 ، 22) ومن خلال تجارب جزيء واحد باستخدام الحمض النووي الخطي (14). في الدراسة الأخيرة باستخدام الحمض النووي الخطي ، أظهرت النتائج أن حلقات الحمض النووي التي تضم ستة مشغلين وستة ثنائيات CI كانت مستقرة نسبيًا ، في حين أن الحلقات التي تشتمل على أربعة ثنائيات فقط (بدون شغل OR3 و OL3) كانت أقل استقرارًا. يبدو أن الالتفاف الفائق للحمض النووي يعزز ثبات الحلقة بالمقارنة مع حلقات حبل DNA الخطي. يتم دعم النتيجة التجريبية من خلال حقيقة أن النموذج الديناميكي الحراري قدم ملاءمة ممتازة لبيانات الحمض النووي فائقة الالتفاف في المختبر ، مما أسفر عن معلمات متوافقة مع الملاحظات في الجسم الحي (21 ، 22). أكدت دراسة حديثة في المختبر باستخدام قوالب فائقة الالتفاف في اختبار النسخ تعزيز تنشيط pRM بواسطة الحلقة التي يتوسطها الأوكتامر والدور التعاوني لـ OL3 و OR3 في قمع pRM (12). تشير هذه النتائج إلى أن الالتفاف الفائق يزيد من ثبات الحلقة كما لوحظ هنا بشكل مباشر.

باختصار ، قمنا بتطوير اختبار جزيء واحد باستخدام DNA فائق الالتفاف أصلاً. لقد بحثنا في احتمالات الحلقات كدالة لتركيز CI ووجدنا انتقالًا أكثر حدة بين الحالات الحلقية وغير الملتوية مقارنةً بالحمض النووي الخطي (14). من المتوقع حدوث هذا الانتقال الأكثر حدة للشبكة التنظيمية التي تقرر بين الحالات اللايسوجينية والحالة اللايسوجينية. من خلال ملاءمة نموذج ديناميكي حراري لبياناتنا ، حصلنا على قيم للطاقات الحرة المرتبطة بتكوين الحلقة التي كانت متوافقة مع القيم المبلغ عنها في الحمض النووي الفائق أصليًا في الجسم الحي. يوفر عملنا نظرة ثاقبة حاسمة حول كيفية تغيير الالتفاف الفائق لديناميكيات مفتاح لامدا ، وأول مفتاح جيني يتم فك تشفيره والمفتاح الذي أصبح نموذجًا لتنظيم النسخ.


تبريد قائم على الالتواء بواسطة ألياف NR

لإثبات قابلية التوسع ، تم قياس التبريد أثناء فصل ألياف NR متعددة بشكل متساوي القياس. أنتجت ألياف NR ذات السبعة طبقات بقطر 2.2 مم (الشكل 2 ، D و E) أعلى حد أقصى (19.1 درجة مئوية) ومتوسط ​​(14.4 درجة مئوية) لتبريد السطح مقارنة بإطلاق امتداد 600٪ من ألياف غير ملتوية ( −12.2 درجة مئوية) (الشكل 1 ب) أو لفك التواء متساوي القياس لألياف مفردة ممتدة بنسبة 100٪ (15.5 درجة مئوية كحد أقصى ومتوسط ​​12.4 درجة مئوية) (الشكل 1C والشكل S15). أدى عدم الانطلاق من سلالات متساوية القياس حوالي 100٪ إلى إنتاج أعلى تبريد ملتوي (الشكلان S23 و S24).

واسترشادًا بالمطابقة بين التبريد الملتوي للألياف المفردة التي لها نفس الامتداد ، ومنتج مشابه لكثافة الالتواء وقطر الألياف الممتد (الشكل S17) ، وجدنا أن التبريد الملتوي المرتبط بالألياف متساوي القياس يعتمد تقريبًا على منتج كثافة الالتواء للالتفاف والقطر الفعال للحزمة (دإف = ن 0.5 × دس، أين ن هو عدد الألياف و دس هو قطر الألياف الممتد) (الشكل 2E).


تحسين كفاءات التحويل - تحفيز الالتفاف الفائق؟ - مادة الاحياء

في حين أنه من المعروف أن الالتفاف الفائق لقالب الحمض النووي يمكن أن يحدث عن طريق النسخ ، فإن آلية وكفاءة هذه العملية في الجسم الحي ليست مفهومة تمامًا. لقد أبلغنا هنا أن نسخ الجينات المشفرة لـ 16 S rRNA ، أو نوع RNA مستقر ، أو polypeptides السيتوبلازمية يؤدي إلى القليل جدًا أو معدومًا من اللفائف الفائقة للحمض النووي حتى في ظل الظروف المثلى في Escherichia coli. يشير هذا إلى أن السحب الهيدروديناميكي على مجمع النسخ (بما في ذلك بوليميريز الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي الناشئ ، والريبوسومات ، وعديد البيبتيدات الوليدة) لا يكفي لترسيخ بوليميريز الحمض النووي الريبي أثناء ترجمة النسخ المقترنة. من ناحية أخرى ، يؤدي نسخ الجينات المرتبطة بالغشاء التي تشفر الغشاء الداخلي المتكامل أو عديد الببتيدات المحيطية المصدرة إلى الالتفاف الفائق الظاهر للحمض النووي. يؤدي نسخ الجينات التي تشفر عديد ببتيدات غشاء داخلي متكامل إلى ترسيخ أكبر بكثير لبوليميراز الحمض النووي الريبي مقارنة بنسخ الجينات التي تشفر البولي ببتيدات المحيطية. قد يعكس هذا الاختلافات في اقتران ترجمة النسخ مع ارتباط الغشاء أثناء التعبير عن هاتين الفئتين من عديد الببتيدات. تم تقديم أدلة أخرى تشير إلى أن تثبيت بوليميراز الحمض النووي الريبي ربما يتحقق من خلال تفاعل البولي ببتيدات الوليدة مع السطح السيتوبلازمي للغشاء الداخلي أثناء ترجمة النسخ المقترنة. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي نسخ الجين المرتبط بالغشاء ، في ظل ظروف معينة ، إلى تثبيت طوبولوجي لبوليميراز الحمض النووي الريبي الذي يقوم بنسخ الجين المجاور الذي لا يرتبط عادةً بالغشاء. أخيرًا ، تمت مناقشة العواقب البيولوجية المحتملة لنتائجنا.


مراجع

جيانغ دبليو ، مارافيني لوس أنجلوس. كريسبر كاس: أدوات جديدة للتلاعب الجيني من أنظمة المناعة البكتيرية. Annu Rev Microbiol. 201569: 209 - 28.

Deltcheva E و Chylinski K و Sharma CM و Gonzales K و Chao Y و Pirzada ZA و Eckert MR و Vogel J و Charpentier E. CRISPR نضج الحمض النووي الريبي بواسطة RNA الصغير المشفر وعامل المضيف RNase III. طبيعة سجية. 2011471: 602–7.

Jinek M ، Chylinski K ، Fonfara I ، Hauer M ، Doudna JA ، Charpentier E. نواة داخلية DNA مزدوجة قابلة للبرمجة موجهة من الحمض النووي الريبي في المناعة البكتيرية التكيفية. علم. 2012337: 816–21.

Cong L، Ran FA، Cox D، Lin S، Barretto R، Habib N، Hsu PD، Wu X، Jiang W، Marraffini LA، Zhang F. هندسة الجينوم المتعددة باستخدام أنظمة CRISPR / Cas. علم. 2013339: 819–23.

ما X ، تشو س ، تشن واي ، ليو وايج. منصات CRISPR / Cas9 لتحرير الجينوم في النباتات: التطورات والتطبيقات. مصنع مول. 20169: 961–74.

Mali P، Yang L، Esvelt KM، Aach J، Guell M، DiCarlo JE، Norville JE، Church GM. هندسة الجينوم البشري الموجهة RNA عبر Cas9. علم. 2013339: 823-6.

Bosher JM ، Labouesse M. تداخل الحمض النووي الريبي: العصا الجينية والرقابة الجينية. نات سيل بيول. 20002: E31–6.

Brodersen P ، Voinnet O. تنوع مسارات إسكات الحمض النووي الريبي في النباتات. اتجاهات الجينات. 200622: 268-80.

برنشتاين إي ، كاودي إيه إيه ، هاموند إس إم ، هانون جي جي. دور نوكلياز ثنائي الطور في خطوة بدء تدخل الحمض النووي الريبي. طبيعة سجية. 2001409: 363-6.

Schauer SE ، Jacobsen SE ، Meinke DW ، Ray A. DICER-LIKE1: الرجال الأعمى والأفيال في تطوير Arabidopsis. اتجاهات نباتية. 20027: 487-91.

رينهارت بج ، وينشتاين إي جي ، رودس إم دبليو ، بارتيل بي ، بارتيل دي بي. MicroRNAs في النباتات. تطوير الجينات. 200216: 1616–26.

Xie Z و Johansen LK و Gustafson AM و Kasschau KD و Lellis AD و Zilberman D و Jacobsen SE و Carrington JC. التنويع الجيني والوظيفي لمسارات الحمض النووي الريبي الصغيرة في النباتات. بلوس بيول. 20042: E104.

Deleris A ، Gallego-Bartolome J ، Bao J ، Kasschau KD ، Carrington JC ، Voinnet O. العمل الهرمي وتثبيط البروتينات الشبيهة بـ Dicer في الدفاع المضاد للفيروسات. علم. 2006313: 68-71.

Hutvagner G ، Simard MJ. بروتينات الأرجونوت: اللاعبون الرئيسيون في إسكات الحمض النووي الريبي. بيول ريف مول خلية نات. 20089: 22-32.

هاموند إس إم ، برنشتاين إي ، بيتش د ، هانون جي جي. يتوسط نوكلياز موجه من الحمض النووي الريبي في إسكات الجينات بعد النسخ في خلايا ذبابة الفاكهة. طبيعة سجية. 2000404: 293-6.

Mi S و Cai T و Hu Y و Chen Y و Hodges E و Ni F و Wu L و Li S و Zhou H و Long C et al. يتم توجيه فرز الحمض النووي الريبي الصغير إلى مجمعات أرجونوت أرابيدوبسيس بواسطة النيوكليوتيدات الطرفية 5. زنزانة. 2008133: 116-27.

سينغ آر كيه ، باندي إس بي. تطور التنويع الهيكلي والوظيفي بين نباتات Argonautes. سلوك إشارة النبات. 201510: e1069455.

كاربونيل أ ، كارينجتون جي سي. الأدوار المضادة للفيروسات من نبات الأرجون. Biol النبات بالعملة. 201527: 111-7.

Scholthof HB ، Alvarado VY ، Vega-Arreguin JC ، Ciomperlik J ، Odokonyero D ، Brosseau C ، Jaubert M ، Zamora A ، Moffett P. تحديد ARGONAUTE لإسكات الحمض النووي الريبي المضاد للفيروسات في Nicotiana benthamiana. نبات فيزيول. 2011156: 1548–55.

وانغ إكس بي ، جوفيل جي ، أودومبورن بي ، وانغ واي ، وو كيو ، لي دبليو إكس ، جاسكيولي الخامس ، فوشيريت إتش ، دينج إس دبليو. إن 21 نيوكليوتيد ، ولكن ليس 22 نيوكليوتيد ، فيروسي ثانوي صغير متداخل من الحمض النووي الريبي المباشر دفاع قوي مضاد للفيروسات من قبل اثنين من الأرجون المتعاونين في Arabidopsis thaliana. الخلية النباتية. 201123: 1625-1638.

Zilberman D، Cao X، Jacobsen SE. ARGONAUTE4 يتحكم في تراكم siRNA الخاص بالموقع ومثيل الحمض النووي والهيستون. علم. 2003299: 716-9.

Raja P، Sanville BC، Buchmann RC، Bisaro DM. مثيلة الجينوم الفيروسي كدفاع جيني ضد الفيروسات الجينية. ياء فيرول. 200882: 8997-9007.

Pumplin N ، Voinnet O. RNA إخماد إخماد مسببات الأمراض النباتية: الدفاع والدفاع المضاد والدفاع المضاد. نات ريف ميكروبيول. 201311: 745-60.

Csorba T، Kontra L، Burgyan J. مثبطات إسكات الفيروسات: أدوات مزورة لضبط التعايش بين المضيف والممرض. علم الفيروسات. 2015479-480: 85-103.

Silhavy D ، Molnar A ، Lucioli A ، Szittya G ، Hornyik C ، Tavazza M ، Burgyan J. يمنع البروتين الفيروسي إسكات الحمض النووي الريبي (RNA) ويربط إسكات الحمض النووي الريبي المتولد ، 21 إلى 25 نيوكليوتيد مزدوج تقطعت بهم السبل. EMBO J. 200221: 3070–80.

روث بي إم ، بروس جي جي ، فانس في بي. المثبطات الفيروسية النباتية لإسكات الحمض النووي الريبي. دقة الفيروس. 2004102: 97-108.

Gao SJ و Damaj MB و Park JW و Beyene G و Buenrostro-Nava MT و Molina J و Wang X و Ciomperlik JJ و Manabayeva SA و Alvarado VY وآخرون. تحسين التعبير الجيني في قصب السكر عن طريق التعبير المشترك عن مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي المشفر بالفيروس. بلوس واحد. 20138: e66046.

سينثيل كومار م ، ميسور كانساس. يمكن أن يستمر إسكات الجينات الناجم عن الفيروسات لأكثر من عامين ويمكن أن ينتقل أيضًا إلى نسل الشتلات في Nicotiana benthamiana والطماطم. التكنولوجيا الحيوية النباتية ج. 20119: 797-806.

Saxena P، Hsieh YC، Alvarado VY، Sainsbury F، Saunders K، Lomonossoff GP، Scholthof HB. تحسين التعبير الجيني الأجنبي في النباتات باستخدام مثبط مشفر بالفيروس لإسكات الحمض النووي الريبي المعدل ليكون غير ضار من الناحية التنموية. التكنولوجيا الحيوية النباتية ج. 20109: 703-12.

تشابمان إي جيه ، بروكنفسكي إيه آي ، جوبيناث ك ، دولجا ف في ، كارينجتون جيه سي. مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي الفيروسي تمنع مسار الرنا الميكروي في خطوة وسيطة. تطوير الجينات. 200418: 1179–86.

Chen J، Li WX، Xie D، Peng JR، Ding SW. يقوم بروتين الفوعة الفيروسي بقمع الدفاع عن طريق إسكات الحمض النووي الريبي (RNA) ولكنه ينظم دور microrna في التعبير الجيني للمضيف. الخلية النباتية. 200416: 1302-13.

ماو واي ، بوتيلا جونيور ، تشو كيه. وراثة التعديلات الجينية المستهدفة التي تحدثها أنظمة كريسبر المحسنة للنبات. علوم الحياة مول الخلية. 201674: 1075-1093.

Mao Y، Zhang H، Xu N، Zhang B، Gou F، Zhu JK. تطبيق نظام CRISPR-Cas لهندسة الجينوم الفعالة في النباتات. مصنع مول. 20136: 2008-11.

ميكي D ، Zhu P ، Zhang W ، Mao Y ، Feng Z ، Huang H ، Zhang H ، Li Y ، Liu R ، Qi Y ، Zhu JK. يتطلب التوليد الفعال من الحمض الريبي النووي النقال مكونات في مسار إسكات الجينات بعد النسخ. مندوب علوم .2017: 301.

Morel JB، Godon C، Mourrain P، Beclin C، Boutet S، Feuerbach F، Proux F، Vaucheret H. Fertile hypomorphic ARGONAUTE (ago1) طفرات معطلة في إسكات الجينات بعد النسخ ومقاومة الفيروسات. الخلية النباتية. 200214: 629-39.

Schott G ، Mari-Ordonez A ، Himber C ، Alioua A ، Voinnet O ، Dunoyer P. التأثيرات التفاضلية لمثبطات إسكات الفيروس على تحميل siRNA و miRNA تدعم وجود مجموعتين خلويتين متميزتين من ARGONAUTE1. EMBO J. 201534: 2593–4.

Vargason JM ، Szittya G ، Burgyan J ، Hall TM. التعرف الانتقائي على حجم siRNA بواسطة مثبط إسكات RNA. زنزانة. 2003115: 799-811.

دانيلسون دي سي ، بيزاكي جي بي. دراسة مسار إسكات الحمض النووي الريبي ببروتين p19. FEBS ليت. 2013587: 1198-205.

Varallyay E ، Valoczi A ، Agyi A ، Burgyan J ، Havelda Z. يرتبط التحريض بوساطة فيروس النبات لـ miR168 بقمع تراكم ARGONAUTE1. EMBO J. 201029: 3507–19.

Liu W، Zhu X، Lei M، Xia Q، Botella JR، Zhu J-K، Mao Y. إجراء تفصيلي لتحرير الجينات CRISPR / Cas9 بوساطة في Arabidopsis thaliana. نشرة العلوم. 201560: 1332-1347.

Lobbes D ، Rallapalli G ، Schmidt DD ، Martin C ، Clarke J. SERRATE: لاعب جديد في مشهد microRNA للنبات. ممثل EMBO .20067: 1052–8.

Duan CG و Zhang H و Tang K و Zhu X و Qian W و Hou YJ و Wang B و Lang Z و Zhao Y و Wang X وآخرون. وظائف محددة ولكن مترابطة لـ Arabidopsis AGO4 و AGO6 في مثيلة الحمض النووي الريبي الموجهة. EMBO J. 201434: 581–92.

هندرسون IR ، Zhang X ، Lu C ، Johnson L ، Meyers BC ، Green PJ ، Jacobsen SE. تشريح وظيفة Arabidopsis thaliana DICER في معالجة RNA الصغيرة ، وإسكات الجينات ونمذجة مثيلة الحمض النووي. نات جينيه. 200638: 721-5.

Mao Y و Zhang Z و Feng Z و Wei P و Zhang H و Botella JR و Zhu JK. تطوير أنظمة CRISPR-Cas9 الخاصة بخط الجراثيم لتحسين إنتاج تعديلات الجينات القابلة للتوريث في نبات الأرابيدوبسيس. ياء التكنولوجيا الحيوية النباتية 201514: 519–32.

Zhang X ، Henriques R ، Lin SS ، Niu QW ، Chua NH. تحول الأجرعية بوساطة أرابيدوبسيس ثاليانا باستخدام طريقة غمس الأزهار. نات بروتوك. 20061: 641-6.

شميتجن تد ، ليفاك KJ. تحليل بيانات PCR في الوقت الحقيقي بطريقة المقارنة C (T). نات بروتوك. 20083: 1101–8.


تحويل النبات: مشاكل واستراتيجيات للتطبيق العملي

الملخصيعد تحول النبات الآن أداة بحث أساسية في بيولوجيا النبات وأداة عملية لتحسين الصنف. هناك طرق تم التحقق منها للإدخال المستقر للجينات الجديدة في الجينوم النووي لأكثر من 120 نوعًا نباتيًا متنوعًا. تبحث هذه المراجعة في معايير التحقق من تحول النبات ، والمتطلبات البيولوجية والعملية لأنظمة التحويل ، ودمج زراعة الأنسجة ، ونقل الجينات ، والاختيار ، واستراتيجيات التعبير عن الجينات لتحقيق التحول في الأنواع المتمردة والقيود الأخرى على تحول النبات بما في ذلك البيئة التنظيمية ، والتصورات العامة والملكية الفكرية والاقتصاد. نظرًا لأن تكاليف فحص المجموعات السكانية التي تظهر تغيرات جينية متنوعة يمكن أن تتجاوز بكثير تكاليف التحول ، فمن المهم التمييز بين كفاءات التحول المطلقة والمفيدة. يتمثل التحدي التقني الرئيسي الذي يواجه بيولوجيا تحول النبات في تطوير الأساليب والبنى لإنتاج نسبة عالية من النباتات تظهر تعبيرًا يمكن التنبؤ به للجينات المحورة دون حدوث أضرار وراثية جانبية. سيتطلب ذلك إجابات لسلسلة من الأسئلة البيولوجية والتقنية ، والتي تم تعريف بعضها.


نصائح وأسئلة وأجوبة

إذا لم تكن مهتمًا بكفاءة التحول (مثل عندما يكون لديك أنبوب من DNA البلازميد وتحتاج فقط إلى تحويل البكتيريا حتى تتمكن من نمو المزيد من البلازميد) يمكنك توفير الكثير من الوقت عن طريق تقصير أو تخطي العديد من الخطوات و ستظل تحصل على مستعمرات كافية لخطوتك التالية. تذكر أن كل من هذه الاختصارات ستقلل من كفاءة التحويل ، لذلك عندما تكون هناك حاجة إلى كفاءة أعلى ، اتبع البروتوكول الكامل.

  • قم بإذابة الثلج من الخلايا المختصة في يدك بدلاً من الثلج
  • قلل الخطوة 4 من 20 - 30 دقيقة إلى دقيقتين على الجليد قبل الصدمة الحرارية

تقصير أو تخطي النتيجة (بالنسبة لمقاومة الأمبيسلين ، لا بأس من تخطي النمو تمامًا ، بالنسبة للمضادات الحيوية الأخرى ، من الجيد التخلص منها لمدة 20-30 دقيقة على الأقل)

تتميز الخلايا المختصة كيميائيًا بالسرعة وسهولة الاستخدام ، ولكنها أقل كفاءة في تناول البلازميدات الأكبر حجمًا. إذا كنت بحاجة إلى تحويل البلازميدات الكبيرة ، فمن الجيد استخدام الخلايا ذات الكفاءة الكهربية. بدلاً من الاعتماد على الصدمة الحرارية لتسبب الخلايا في امتصاص الحمض النووي ، يتم تطبيق مجال كهرومغناطيسي على خليط الخلية / الحمض النووي للحث على نفاذية الغشاء. للقيام بذلك ، سوف تحتاج إلى الوصول إلى جهاز كهربائي والأنابيب المناسبة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لكل منها.

تأكد من قيامك بالطلاء على صفيحة LB Agar تحتوي على المضاد الحيوي الصحيح. يجب أن يتطابق جين المقاومة على البلازميد مع المضاد الحيوي الموجود على الطبق. يجب عليك أيضًا إضافة عنصر تحكم إيجابي (تتضمن العديد من الشركات بلازميد تحكم إيجابي بخلاياها المختصة) للتأكد من أن إجراء التحول الخاص بك يعمل.

على الرغم من أنه قد يكون غير بديهي ، ستحصل غالبًا على كفاءات تحويل أعلى مع القليل من الحمض النووي ، خاصة عند استخدام خلايا عالية الكفاءة. إذا استخدمت 100-1000 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي في الربط ، فغالبًا ما تحصل على المزيد من الخلايا إذا كنت تستخدم 1 ميكرولتر من التخفيف 1: 5 أو 1:10 بدلاً من 1 ميكرولتر مباشرةً.


شاهد الفيديو: مضاعفة القدرات وبناء المهارات الشخصية (ديسمبر 2022).