معلومة

أسهب في معادلات الوقت لـ ATP-sythase؟

أسهب في معادلات الوقت لـ ATP-sythase؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قرأت أنه يمكن تقسيم كل دوران 120 درجة لمركب F1 من ATP-synthase إلى دوران 30 درجة ودوران 90 درجة. بين هذين هما أوقات السكون ، واحدة قبل دوران 90 درجة تسمى وقت السكون الملزم لـ ATP والأخرى التي تليها تسمى وقت السكون المؤقت وكلاهما يسقطان بشكل أسي. ومع ذلك ، لا يمكنني العثور على اشتقاق دالة الكثافة الاحتمالية لأوقات السكون هذه ، أو هناك شكل دقيق. إذا كان أي شخص يعرف مثل هذا الاشتقاق أو مكان العثور على واحد ، فسيكون ذلك موضع تقدير كبير.


ATP يسكن وقت ملزمة

هنا اشتقاق مراوغ للغاية لوقت السكون الملزم (لاحظ أنني OP). لهذا لدينا $$ E + S rightarrow ES $$ حيث $ E $ هو الإنزيم و $ S $ هو الركيزة (مع الحفاظ على هذا العام). يمكننا كتابة معادلة السعر على النحو التالي: $$ rate = k [E] [S] $$ ولكن يمكننا أيضًا كتابة السعر على النحو التالي: $$ rate = - frac {d [E]} {dt} $$ بحيث : $$ frac {d [E]} {dt} = - ك [E] [S] $$ الآن هذا هو الشيء الذي أعتقد أنه مخادع بعض الشيء ، سنفترض أن $ [S] $ هو تقريبا ثابت. لذلك: $$ [E] = Ae ^ {- k [S] t} $$ يمكننا أن نأخذ $ n = [E] V $ لتمثيل عدد الإنزيمات المتبقية ، حيث $ V $ هو الحجم ، ثم السماح $ n_0 = VA = ثابت $: $$ n = n_0e ^ {- k [S] t} $$ يُعطى احتمال أن يكون خلال الوقت $ t $ من خلال: $$ F (t) = 1-e ^ {-k [S] t} $$ ما هي دالة التوزيع التبادلي الخاصة بنا. يؤدي اشتقاق هذا إلى دالة كثافة الاحتمال: $$ f (t) = k [S] e ^ {- k [s] t} $$

وقت الإقامة المؤقت

يتضمن وقت السكون المؤقت (ويسمى أيضًا وقت السكون التحفيزي) خطوتين [7]: 1. انقسام إنزيم ATP المرتبط بالإنزيم. 2. إطلاق المنتجات المتحللة بالماء.

سيتبع كل منها التوزيع (المماثل لما ورد أعلاه) من:

$$ p_i (t) = k_i e ^ {- k_i t_i} $$ بالنسبة إلى $ i = 1،2 $ على التوالي. تم العثور على التوزيع الاحتمالي المشترك من خلال الالتواء بين هذين [8]: $$ p_T (t) = int ^ { tau} _0 p_1 (t) p_2 ( tau-t) dt $$ والذي يعطي: $$ p_T (t) = frac {k_1 k_2} {k_1-k_2} (e ^ {- k_2 tau} -e ^ {- k_1 tau}) $$

يحرر

على الرغم من البدء من المعادلات القطعية (التي لا تهم حقًا) ، إلا أن هذه الطريقة صحيحة وبسيطة. يسمى نوع التفاعل رد الفعل الزائف من الدرجة الأولى (أو الدرجة الثانية من الدرجة الثانية) والذي يفسر تقريبي لـ $ [S] $ كان ثابتًا. انظر [9] و [10]

مصادر للحصول على معلومات إضافية

  1. https://youtu.be/X_YXTWU2maY؟list=PLbKSbFnKYVY3j6ubaW1zgTXj5C4443v8s
  2. http://www.nature.com/articles/srep08773
  3. http://www.ks.uiuc.edu/Research/atp_hydrolysis/
  4. http://www.pnas.org/content/85/17/6314.full.pdf
  5. https://books.google.co.uk/books؟id=uIxwICNmLKEC&pg=PA199&lpg=PA199&dq=catalytic+dwell+time+distribution+٪5Batp٪5D&source=bl&ots=u8oBcVNCDc&sig=PKvdVAwT0WxdqTuVwMxhU3RfSwM&hl=en&sa=X&ved=0CCAQ6AEwADgKahUKEwiGhKDalufHAhXkadsKHc54ADs#v=onepage&q= محفز٪ 20 وضع٪ 20 وقت٪ 20 توزيع٪ 20٪ 5 Batp٪ 5D & f = خطأ
  6. http://crystal.harvard.edu/PDFs/floyd_biophysj.2010.pdf
  7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16258036
  8. http://crystal.harvard.edu/PDFs/floyd_biophysj.2010.pdf
  9. http://glutxi.umassmed.edu/grad/GradKinetics.pdf
  10. http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Kinetics/Reaction_Rates/Second-Order_Reactions/Pseudo-1st-order_reactions

تحليل وقت نمط الشعاع لمجموعة متنوعة للتردد المستوي

Hui Chen ، كلية هندسة المعلومات والاتصالات ، جامعة العلوم والتكنولوجيا الإلكترونية في الصين ، رقم 2006 ، Xiyuan Ave ، West Hi-Tech Zone ، 611731 ، تشنغدو ، سيتشوان ، جمهورية الصين الشعبية.

كلية هندسة المعلومات والاتصالات ، جامعة العلوم والتكنولوجيا الإلكترونية في الصين ، تشنغدو ، سيتشوان ، الصين

كلية هندسة المعلومات والاتصالات ، جامعة العلوم والتكنولوجيا الإلكترونية في الصين ، تشنغدو ، سيتشوان ، الصين

كلية هندسة المعلومات والاتصالات ، جامعة العلوم والتكنولوجيا الإلكترونية في الصين ، تشنغدو ، سيتشوان ، الصين

المختبر الدقيق لتكنولوجيا نظام الرادار للقياس في مقاطعة سيتشوان ، قوانغيوان ، سيتشوان ، الصين

Hui Chen ، كلية هندسة المعلومات والاتصالات ، جامعة العلوم والتكنولوجيا الإلكترونية في الصين ، رقم 2006 ، Xiyuan Ave ، West Hi-Tech Zone ، 611731 ، تشنغدو ، سيتشوان ، جمهورية الصين الشعبية.

كلية هندسة المعلومات والاتصالات ، جامعة العلوم والتكنولوجيا الإلكترونية في الصين ، تشنغدو ، سيتشوان ، الصين

كلية هندسة المعلومات والاتصالات ، جامعة العلوم والتكنولوجيا الإلكترونية في الصين ، تشنغدو ، سيتشوان ، الصين


أسهب في معادلات الوقت لـ ATP-sythase؟ - مادة الاحياء

للوقت الذي يقضيه جزيء براوني متفاعل داخل نطاق دقيق محدود العديد من التطبيقات في البيولوجيا الخلوية ، لأن عدد الحدود هو إشارة كمية ، والتي يمكن أن تبدأ سلسلة من التفاعلات الكيميائية وبالتالي لها عواقب فسيولوجية. في هذه المقالة ، نقترح تقدير متوسط ​​الوقت الذي يقضيه جزيء براوني داخل نطاق دقيق يحتوي على ثقوب صغيرة على الحدود والجزيئات الناهضة الموجودة بداخله. وجدنا أن متوسط ​​الوقت يعتمد على العديد من المعلمات مثل معدل الارتباط العكسي (مع جزيئات ناهض) ، ومتوسط ​​وقت الهروب من النطاق الصغير ومتوسط ​​الوقت الذي يصل فيه الجزيء إلى مواقع الربط (معدل الربط الأمامي). بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نقدر المتوسط ​​والتباين في عدد الحدود التي يصنعها الجزيء قبل أن يخرج من $ Omega $. تعتمد هذه التقديرات على تحليل الطبقة الحدودية للمتوسط ​​الشرطي لوقت المرور الأول ، وحل معادلة تفاضلية جزئية فردية. على وجه الخصوص ، نطبق النتائج الحالية للحصول على تقدير لمتوسط ​​الوقت الذي يقضيه (Dwell time) بواسطة مستقبل براوني داخل مجال متشابك ، عندما يتحرك بحرية عن طريق الانتشار الجانبي على سطح الخلية العصبية ويتفاعل محليًا مع جزيئات السقالات.


بارانجو ، آر وآخرون. توفر كريسبر مقاومة مكتسبة ضد الفيروسات في بدائيات النوى. علم 315, 1709–1712 (2007).

Yosef، I.، Goren، M.G & amp Qimron، U. البروتينات وعناصر الحمض النووي الأساسية لعملية تكيف CRISPR في الإشريكية القولونية. الدقة الأحماض النووية. 40, 5569–5576 (2012).

نونيز ، ج. ك وآخرون. يتوسط التكوين المعقد Cas1 – Cas2 اكتساب المباعد خلال المناعة التكيفية CRISPR-Cas. نات. هيكل. مول. بيول. 21, 528–534 (2014).

Nuñez ، J.K ، Lee ، A. S. ، Engelman ، A. & amp Doudna ، J.A Integrase-mediated spacer اكتساب خلال مناعة CRISPR-Cas التكيفية. طبيعة سجية 519, 193–198 (2015).

Makarova ، KS ، Grishin ، NV ، Shabalina ، SA ، Wolf ، YI & amp Koonin ، EV جهاز مناعي مفترض قائم على تداخل الحمض النووي الريبي في بدائيات النوى: التحليل الحسابي للآلة الأنزيمية المتوقعة ، والتشبيهات الوظيفية مع RNAi حقيقية النواة ، والآليات الافتراضية للعمل . بيول. مباشر 1, 7 (2006).

Bolotin، A.، Quinquis، B.، Sorokin، A. & amp Ehrlich، S.D. تحتوي التكرارات المتناظرة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPRs) على فواصل من أصل خارج الصبغيات. علم الاحياء المجهري 151, 2551–2561 (2005).

Mojica ، F. J. ، García-Martínez ، J. & amp Soria ، E. تستمد المتواليات المتداخلة من التكرارات بدائية النواة المتباعدة بانتظام من عناصر وراثية أجنبية. جيه مول. Evol. 60, 174–182 (2005).

Pourcel ، C. ، Salvignol ، G. & amp Vergnaud ، G. عناصر CRISPR في يرسينيا بيستيس اكتساب تكرارات جديدة عن طريق الامتصاص التفضيلي للحمض النووي للعاثيات ، وتوفير أدوات إضافية للدراسات التطورية. علم الاحياء المجهري 151, 653–663 (2005).

Marraffini، L.A & amp Sontheimer، E. J. CRISPR التداخل يحد من نقل الجينات الأفقي في المكورات العنقودية من خلال استهداف الحمض النووي. علم 322, 1843–1845 (2008).

Amitai، G. & amp Sorek، R. CRISPR-Cas التكيف: نظرة ثاقبة على آلية العمل. نات. القس ميكروبيول. 14, 67–76 (2016).

جاكسون ، إس إيه وآخرون. كريسبر كاس: التكيف مع التغيير. علم 356، eaal5056 (2017).

McGinn، J. & amp Marraffini، L. A. الآليات الجزيئية لاكتساب CRISPR-Cas spacer. نات. القس ميكروبيول. 17, 7–12 (2019).

Wiedenheft ، B. وآخرون. الأساس الهيكلي لنشاط DNase لبروتين محفوظ متورط في دفاع الجينوم بوساطة كريسبر. بنية 17, 904–912 (2009).

وانج ، جيه وآخرون. الأساس الهيكلي والميكانيكي لاكتساب المباعد المعتمدة على PAM في أنظمة CRISPR-Cas. زنزانة 163, 840–853 (2015).

نونيز ، ج. ك. ، هارينغتون ، إل ب ، كرانزوش ، ب.ج ، إنجلمان ، أ.ن. & أمبير دودنا ، ج. أ. التقاط الحمض النووي الأجنبي أثناء المناعة التكيفية لـ CRISPR-Cas. طبيعة سجية 527, 535–538 (2015).

Díez-Villaseñor، C.، Guzmán، N.M، Almendros، C.، García-Martínez، J. & amp Mojica، F. J. الإشريكية القولونية. RNA بيول. 10, 792–802 (2013).

غورين ، م.ج وآخرون. كرر تحديد الحجم بواسطة مساطرين جزيئيين في مجموعة النوع IE CRISPR. تقارير الخلية. 16, 2811–2818 (2016).

Nuñez، J.K، Bai، L.، Harrington، L.B، Hinder، T.L & amp Doudna، J. A. CRISPR تتطلب الذاكرة المناعية عامل مضيف للخصوصية. مول. زنزانة 62, 824–833 (2016).

Wright، A. V. & amp Doudna، J. A. حماية سلامة الجينوم أثناء التكيف المناعي لـ CRISPR. نات. هيكل. مول. بيول. 23, 876−883 (2016).

Heler، R. et al. يحدد Cas9 الأهداف الفيروسية الوظيفية أثناء تكيف CRISPR-Cas. طبيعة سجية 519, 199–202 (2015).

Wei، Y.، Terns، R.M & amp Terns، M.P. Cas9 وظيفة وأخذ عينات الجينوم المضيف في تكيف النوع II-A CRISPR-Cas. تطوير الجينات. 29, 356–361 (2015).

كا ، د. وآخرون. الهيكل البلوري لـ الأبراج العقدية Cas1 وتفاعله مع Csn2 في نظام النوع الثاني CRISPR-Cas. بنية 24, 70–79 (2016).

ويلكينسون ، إم وآخرون. هيكل معقد الالتقاط الفاصل المرتبط بالحمض النووي لنظام النوع الثاني CRISPR-Cas. مول. زنزانة 75، 90-101.e5 (2019).

رايت ، إيه في وآخرون. تراكيب مجمع تكامل الجينوم كريسبر. علم 357, 1113–1118 (2017).

Xiao، Y.، Ng، S.، Nam، K.H & amp Ke، A. كيف يؤسس النوع الثاني CRISPR-Cas مناعة من خلال تكامل المباعد Cas1 – Cas2. طبيعة سجية 550, 137–141 (2017).

كون ، ت. وآخرون. تعمل شظايا تدهور الحمض النووي المستهدفة المشتقة من Cas3 على تأهب تكيف كريسبر. مول. زنزانة 63, 852–864 (2016).

كيبر ، إس إن وآخرون. يسهل Cas4 اختيار المباعد المتوافق مع PAM أثناء تكييف CRISPR. مندوب الخلية. 22, 3377–3384 (2018).

Lee ، H. ، Zhou ، Y. ، Taylor ، D.W & amp Sashital ، D.G Cas4 المعتمد على المعالجة المسبقة لضمان برمجة عالية الدقة لمصفوفات CRISPR. مول. زنزانة 70، 48-59.5 (2018).

شيموري ، إم ، غاريت ، إس سي ، جرافيلي ، بي آر أند ترنز ، إم بي كاس 4 تحدد نوكليازات PAM وطولها واتجاه أجزاء الحمض النووي المدمجة في مواقع كريسبر. مول. زنزانة 70، 814-824 هـ 6 (2018).

درابافيسيوس ، ج. وآخرون. يعزز مجال Cas2 الذي يشبه نوكلياز خارجي DnaQ تكامل المباعد في نظام I-E CRISPR-Cas. ممثل EMBO. 19، e45543 (2018).

Rollie، C.، Schneider، S.، Brinkmann، A. S.، Bolt، E.L & amp White، M.F. خصوصية التسلسل الجوهري لـ Cas1 Integrase توجه اكتساب فاصل جديد. إليفي 4، e08716 (2015).

Shipman ، S.L ، Nivala ، J. ، Macklis ، J.D & amp Church ، G.M Molecular التسجيلات عن طريق الحصول على مباعد CRISPR الموجه. علم 353، aaf1175 (2016).

Shipman ، S. L. ، Nivala ، J. ، Macklis ، J.D & amp Church ، G.M CRISPR-Cas ترميز فيلم رقمي في جينومات مجموعة من البكتيريا الحية. طبيعة سجية 547, 345–349 (2017).

Mojica ، F. J. ، Diez-Villaseñor ، C. ، García-Martínez ، J. & amp Almendros ، C. تحدد سلاسل الحافز القصيرة أهداف نظام الدفاع كريسبر بدائية النواة. علم الاحياء المجهري 155, 733–740 (2009).

Marraffini، L.A & amp Sontheimer، E. J. الذات مقابل عدم التمييز الذاتي أثناء المناعة الموجهة من CRISPR RNA. طبيعة سجية 463, 568–571 (2010).

Zhang، J.، Kasciukovic، T. & amp White، M.F. إن البروتين المرتبط بـ CRISPR Cas4 عبارة عن نوكلياز خارجي 5 إلى 3 DNA مع كتلة الحديد والكبريت. بلوس واحد 7، e47232 (2012).

شماكوف ، إس وآخرون. جيل واسع الانتشار من المباعدات ذات الاتجاه المعاكس أثناء تكييف CRISPR. الدقة الأحماض النووية. 42, 5907–5916 (2014).

Fossum، S.، Crooke، E. & amp Skarstad، K. تنظيم أصول الشقيقة وإعادة تكوينها أثناء تكرار الحمض النووي متعدد الشوكات في الإشريكية القولونية. EMBO J. 26, 4514–4522 (2007).

Adebali، O.، Chiou، Y. Y.، Hu، J.، Sancar، A. & amp Selby، C. P. الإشريكية القولونية بوساطة Mfd translocase. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 114، E2116 – E2125 (2017).

بارك ، جي إس ، مار ، إم تي وأمبير روبرتس ، جي دبليو. بكتريا قولونية ينقذ عامل اقتران إصلاح النسخ (بروتين Mfd) المجمعات الموقوفة عن طريق تعزيز الانتقال إلى الأمام. زنزانة 109, 757–767 (2002).

Lee ، H. ، Dhingra ، Y. & amp Sashital ، D.G. يتوسط مجمع Cas4-Cas1-Cas2 معالجة دقيقة للمسبقات أثناء تكييف CRISPR. إليفي 8، e44248 (2019).

ديلارد ، ك.إي وآخرون. تجميع ونقل مجمع اقتناء كريسبر-كاس. زنزانة 175، 934–946 هـ 15 (2018).

ردينغ ، إس وآخرون. مراقبة ومعالجة الحمض النووي الأجنبي بواسطة الإشريكية القولونية نظام CRISPR-Cas. زنزانة 163, 854–865 (2015).

سيلاس ، إس وآخرون. الحصول المباشر على مباعد CRISPR من الحمض النووي الريبي عن طريق بروتين الانصهار العكسي الطبيعي - Cas1. علم 351، aad4234 (2016).

سيلاس ، إس وآخرون. حول أصل النسخ العكسية باستخدام أنظمة CRISPR-Cas وذخيرة فواصل شديدة التنوع والغموض. مبيو 8، e00897–17 (2017).

González-Delgado، A.، Mestre، M.R، Martínez-Abarca، F. & amp Toro، N. Vibrio vulnificus. الدقة الأحماض النووية. 47, 10202–10211 (2019).

موهر ، ج وآخرون. يحتوي بروتين الانصهار العكسي-Cas1 على مجال Cas6 المطلوب للتكوين الحيوي لـ CRISPR RNA واكتساب فاصل RNA. مول. زنزانة 72، 700-714 هـ (2018).

تستغل أنظمة Modell، J.W، Jiang، W. & amp Marraffini، L. A. CRISPR-Cas حقن الحمض النووي الفيروسي لتأسيس مناعة تكيفية والحفاظ عليها. طبيعة سجية 544, 101–104 (2017).

Kim، S.، Loeff، L.، Colombo، S.، Jergic، S.، Brouns، S. J. J. & amp Joo، C. طبيعة سجية 579, 141–145 (2020).

Joo، C. & amp Ha، T. وضع العلامات على البروتينات لجزيء واحد FRET. كولد سبرينج حرب. بروتوك. https://doi.org/10.1101/pdb.prot071035 (2012).

Roy، R.، Hohng، S. & amp Ha، T. دليل عملي للحنق أحادي الجزيء. نات. أساليب 5, 507–516 (2008).

Bronson، J. E.، Fei، J.، Hofman، J.M، Gonzalez، R.L & amp Wiggins، C.H. معدلات التعلم والحالات من السلاسل الزمنية للفيزياء الحيوية: نهج بايزي لاختيار النموذج وبيانات الحنق لجزيء واحد. بيوفيز. ج. 97, 3196–3205 (2009).

Mairhofer ، J. ، Wittwer ، A. ، Cserjan-Puschmann ، M. & amp Striedner ، G. منع نسخ قراءة بوليميراز T7 RNA - إشارة إنهاء تركيبية قادرة على تحسين استقرار العمليات الحيوية. موالفة ACS. بيول. 4, 265–273 (2015).

تشن ، واي.جيه وآخرون. توصيف 582 من النهايات الطبيعية والاصطناعية وتقدير قيود تصميمها. نات. أساليب 10, 659–664 (2013).

جيانغ ، واي وآخرون. تحرير متعدد الجينات في الإشريكية القولونية الجينوم عبر نظام CRISPR-Cas9. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 81, 2506–2514 (2015).


التواء وتناوب الوحدة الفرعية في F واحداF1-ATP سينسيز

FاF1- مركبات ATP عبارة عن إنزيمات غشائية منتشرة في كل مكان تعمل بالبروتون أو تعمل بالطاقة الأيونية وتوفر ATP لجميع أنواع العمليات الخلوية. يتم تشغيل الكيمياء الميكانيكية للحفز بواسطة محركين نانويين دائريين مقترنين داخل الإنزيم. وقد لوحظت أحجام خطواتهم المختلفة عن طريق الفحص المجهري أحادي الجزيء بما في ذلك الفحص المجهري بالفيديو للنانوبيدات المتذبذبة المرتبطة بالإنزيمات المفردة ونقل طاقة الرنين لجزيء واحد. نراجع هنا التطورات الأخيرة للنُهج لمراقبة حجم خطوة دوران الوحدة الفرعية وآلية تخزين الطاقة المرنة العابرة في وحدة F واحدة.اF1التركيبات -ATP.

1 المقدمة

ثلاثي فوسفات الأدينوزين (ATP) هو عملة الطاقة العالمية للخلية. عندما يتحلل بالماء إلى ثنائي فوسفات الأدينوزين (ADP) والفوسفات غير العضوي (Pأنا) ، طاقتها الحرة القياسية البيوكيميائية Δيمكن استخدام G 0 '(ATP) بمقدار 30 كيلو جول مول −1 [1-3] لمجموعة متنوعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية. ومع ذلك ، في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون الطاقة الحرة للتحلل المائي ATP أعلى ، حوالي -50 إلى -60 كيلو جول مول -1 [4]. نظرًا لأن كمية ATP محدودة - على سبيل المثال ، يحتوي جسم الإنسان لدينا على حوالي 50 جرامًا - يجب إعادة تدويرها باستمرار لأننا نستهلك 1000 مرة من ATP أكثر مما لدينا [5،6]. منذ حوالي 4.5 مليار سنة ، تطورت فئة من الإنزيمات تسمى مركبات ATP لتجديد ATP من ADP و Pأنا. اعتمادًا على الخصائص الهيكلية للوحدات الفرعية والوظيفة الفسيولوجية الأولية في الخلايا المختلفة أو الأجزاء الخلوية ، يتم تمييز ثلاثة أنواع رئيسية من الإنزيمات [7،8]. FاF1تم العثور على تركيبات -ATP في غشاء الثايلاكويد للبلاستيدات الخضراء ، في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا وفي غشاء البلازما البكتيري. وظيفتها هي تخليق ATP. على النقيض من ذلك ، فإن Vاالخامس1-ATPases هي مضخات بروتون يحركها ATP [9،10]. أركيال أاأ1- مركبات ATP هي إنزيمات منتجة لـ ATP مع هياكل مشابهة لتلك الموجودة في V.االخامس1-ATPases.

تخليق ATP في FاF1- يتم تشغيل مركبات ATP بواسطة فرق الجهد الكهروكيميائي للبروتونات (أو Na + في بعض الخلايا) ، على الأغشية المعنية [11]. منذ حوالي 50 عامًا ، افترض بيتر ميتشل الآلية الرئيسية لمركب ATP في نظريته عن التناضح الكيميائي في عام 1961 [12]. ادعى أن ATP لا يتم تصنيعه بواسطة وسيط فسفري في الميتوكوندريا ، ولكن بواسطة إنزيم مدمج في غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، باستخدام الاختلاف في تركيزات البروتون (Δالرقم الهيدروجيني) في الجزأين بالإضافة إلى الجهد الكهربائي (Δψ) عبر الغشاء الفاصل [12]. يشتمل كلا المكونين على القوة الدافعة للبروتون ، PMF. ال Δيتم إنشاء الأس الهيدروجيني أثناء عملية التمثيل الضوئي في البلاستيدات الخضراء ، أو أثناء الفسفرة الهوائية في الميتوكوندريا أو البكتيريا. على الرغم من أن الأمر استغرق أكثر من عقد قبل أن يتم قبول نظرية التناضح الكيميائي بشكل عام ، إلا أن هذه الآلية أصبحت الآن جزءًا من كل كتاب مدرسي كيميائي حيوي. ومع ذلك ، فإن الطريقة التي تقود بها البروتونات المفردة دورة التفاعل التحفيزي داخل الإنزيم لا يزال يتعين حلها على المستوى الذري.

2. مكونات اثنين من المحركات الدوارة من FاF1-اتب سينسيز

اليوم ، تتوفر ثروة من المعلومات الهيكلية حول الإنزيم. FاF1يتكون -ATP synthase من مجالين. في الإنزيم البكتيري ، الوحدات الفرعية α3β3γδɛ تتألف من F1 المجال (سنستخدم الامتداد الإشريكية القولونية التسمية في ما يلي) بينما الوحدات الفرعية أب2جن تشكل F المضمنة في الغشاءا نطاق. عدد ال ج تختلف الوحدات الفرعية بين الأنواع ويبدو أنها تعتمد على القوة الدافعة المتاحة للبروتون (أو Na). أصغر عدد من ج تتكون الوحدات الفرعية من ثماني وحدات لإنزيم الميتوكوندريا من قلب الأبقار [13] ، وأكبرها معروف حتى الآن هو 15 في إنزيم من البكتيريا الزرقاء [14]. الانزيم البكتيري من بكتريا قولونية لديه 10 ج الوحدات الفرعية [15].

أول هيكل بلوري رائد لسيارات F1 جزء من ميتوكوندريا قلب البقر وصفه جون ووكر وزملاؤه في عام 1994 [16]. كانت السمات الرئيسية هي الترتيب المتناوب لـ α3β3 الوحدات الفرعية ، التي شكلت هيكلًا سداسيًا ، وساق مركزي مكون من الوحدة الفرعية γ. كانت مواقع ربط النوكليوتيدات الحفازة موجودة بشكل أساسي على الوحدات الفرعية ، عند الواجهة مع α. الوحدات الفرعية المسماة βTP و βموانئ دبي تحتوي على AMP-PNP ، نظير ATP غير قابل للتحلل بالماء ، أو ADP ، على التوالي ، في حين أن الوحدة الفرعية الثالثة (βه) كان فارغا. يبدو أن الوحدات الفرعية غيرت شكلها اعتمادًا على النيوكليوتيدات المرتبطة. توجد ثلاثة مواقع ربط إضافية للنيوكليوتيدات في الواجهات الأخرى لـ αβ. ومع ذلك ، فقد كانت غير محفزة ، وكلها تحتوي على AMP-PNP. وبالتالي ، تم تفسير التركيب البلوري على أنه صورة ثابتة للإنزيم النشط. تبين لاحقًا أنه يشبه المسكن التحفيزي (انظر أدناه) [17 ، 18].

ميزة أخرى للوحدة الفرعية هي تسلسل الأحماض الأمينية DELSEED ، والتي شكلت على ما يبدو رافعة يمكنها العمل لفتح وإغلاق موقع ربط النوكليوتيدات المرتبط. يبدو أن أجزاء من الوحدة الفرعية يمكن أن تتفاعل مع هذه الرافعة ، وبالتالي ، تحدد الحالة المطابقة لكل موقع ربط محفز ، لأن γ يغير اتجاهه بالتتابع فيما يتعلق بالوحدات الفرعية الثلاثة في الإنزيم النشط. علاوة على ذلك ، تتكون الوحدة الفرعية من مجال كروي يواجه ، جنبًا إلى جنب مع ، F المضمن في الغشاء.ا الجزء ، واثنين من حلزونات α N- و C- الطرفية التي شكلت ملفًا ملفوفًا وتمتد إلى التجويف المركزي لـ α3β3 سداسي الزوايا.

في الآونة الأخيرة ، أول حرف F1 هيكل بكتريا قولونية تم نشر الانزيم [19]. مع تشابه عام كبير مع الميتوكوندريا F1 الهياكل ، تم التأكيد على أن المجال الكروي لـ يقع في جانب الغشاء لـ F1 وربما يتفاعل مع ج الوحدات الفرعية لـ Fا (التي لم تكن موجودة في هذا الهيكل). تم إرفاق الوحدة الفرعية بـ وبالتالي فهي أيضًا جزء من ساق مركزي بكتريا قولونية F1. لم تكن الوحدة الفرعية δ موجودة في هذا الهيكل ، ولكنها تقع في الجزء العلوي من الإنزيم.

في وا جزء ، حلقة من ج يتم تضمين الوحدات الفرعية في الغشاء. الحلقة تتفاعل مع الوحدتين الفرعيتين و لـ F1 [20،21] ومع الوحدات الفرعية أ [22،23] و ب2 إيقافا [24 ، 25]. الوحدة الفرعية أ تشكل البروتون (أو Na + في بعض الكائنات الحية) التي تقوم بنصف قنوات تنتهي على جانبي الغشاء. الوحدات الفرعية ثنائية الأبعاد ب2 تشكيل ملف ملفوف باليد اليمنى مع بقايا صغيرة متوازنة [26،27] والتي تشمل البروتين الكامل من الغشاء إلى الجزء العلوي من α3β3 سداسي الزوايا. ال ب تعتبر الوحدات الفرعية بمثابة ساق غريب الأطوار مرتبطة بإحكام بـ F.1 [28 ، 29]. هذا الاتصال المحيطي أب2 إلى F.1 جنبًا إلى جنب مع الاتجاهات الثلاثة المحتملة لـ γ داخل F.1 ينتج عنه بنية غير متماثلة للإنزيم ، مع اتجاه المحور المركزي العشوائي فيما يتعلق بالمحيط المحيطي ب2 الوحدات الفرعية. النموذج الهيكلي لـ بكتريا قولونية FاF1- يظهر سينسيز ATP في الشكل 1أ. تم استخدام نمذجة التناظر المبنية على هياكل إنزيم الميتوكوندريا والافتراضات حول توطين الوحدات الفرعية استنادًا إلى بيانات الارتباط المتبادل وتثليث نقل طاقة الرنين (FRET) أحادي الجزيء.

شكل 1. (أ) النموذج الهيكلي بكتريا قولونية FاF1-مزامنة ATP مع وحدة فرعية α (أزرق فاتح) وواحدة (أزرق داكن) تمت إزالتها لفضح الوحدة الفرعية γ (أحمر) في وسط α3β3- سداسي زائف. معا مع ɛ (وردي) و في الأعلى (أخضر داكن) ، يشكلان الحرف F.1 جزء. يتم تضمين F الغشاءا الجزء يتكون من 10 ج الوحدات الفرعية (أصفر / برتقالي) ، والتي تشكل بنية حلقية داخل الغشاء. الوحدة الفرعية أ (أخضر فاتح) واثنان ب الوحدات الفرعية (الخضراء) تشكل ساق غريب الأطوار لتثبيت كلا الجزأين معًا. الوحدات الفرعية γ و ε و ج10- يشتمل الخاتم على الدوار لـ FاF1 (ألوان ضاربة إلى الحمرة) ، والتي تدور في اتجاه عقارب الساعة (إذا تم عرضها من الغشاء) أثناء تخليق ATP فيما يتعلق بالوحدات الفرعية للجزء الثابت α3β3δأب2 (ألوان زرقاء / خضراء). توليف ATP في β مدفوع بتدفق البروتون (أو Na +) عبر Fا بسبب اختلاف الجهد الكهروكيميائي على الغشاء. نموذج التماثل هذا لـ FاF1 مركب من عدة هياكل جزئية (رموز PDB 1BMF [16] ، 2CK3 [30] ، 1H8E [31] و 1YCE [32] في بنك بيانات البروتين ، http://www.pdb.org) وتم رسمه باستخدام VMD الإصدار 1.9.1 [33]. الوحدات الفرعية أ, ب2 و تم تصميمها بحجمها الصحيح تقريبًا وتم إرفاقها يدويًا باستخدام بيانات الارتباط المتبادل. (ب) إعداد مقايسة الدوران بحبة مغناطيسية متصلة بـ F.1 جزء. F13β3γ) إلى غطاء زجاجي عبر هيستيدين (صاحب) - علامات في كل وحدة فرعية. تقترن الحبة المغناطيسية المغطاة بالستربتافيدين بسيستين في الوحدة الفرعية γ عبر البيوتين. يتم تخدير الخرزة بنقاط كمومية فلورية بيوتينيلاتيد لتصور الدوران الذي يحركه ATP لمركب حبة γ. (ج) توزيع نقطة النهاية لخيوط أكتين دوارة (1 ميكرومتر) مقترن بـ ج10-حلقة من بكتريا قولونية FاF1 في اختبار الدوران يظهر دورانًا واضحًا بمقدار 120 درجة أثناء التحلل المائي لـ ATP عند ارتفاع [ATP] في وجود المنظف (مقتبس من [34]). (د) اسكن اوقات دوران صعدت بكتريا قولونية FاF1 في وجود (1) 5 ملي مولار أو (2) 0.1 ملي مولار ATP. تُظهر الرسوم البيانية متوسط ​​المساكن لمواضع التدرج لأنزيم واحد بعد 200 أو 120 دورة ، على التوالي.

لا يزال السؤال المطروح هو كيف ينتقل البروتون (أو Na +) في جزء بعيد في F.ا يقترن بتوليف ATP في مواقع ربط النوكليوتيدات الثلاثة في الوحدات الفرعية لـ F1. تم اقتراح مفهوم تخليق ATP لأول مرة من قبل Paul Boyer في عام 1981 قبل أن تتوفر المعلومات الهيكلية التفصيلية [35 ، 36]. وفقًا لـ "آلية التغيير الملزمة" الخاصة به ، فإن اثنين من مواقع الربط الثلاثة للنيوكليوتيدات إما يربطان ADP و P.أنا أو تولد ATP ، وتتم مزامنة هذه التفاعلات بواسطة وحدة فرعية دوارة ، مركزية ، غير متماثلة. نقل البروتون من خلال Fا هي القوة الدافعة للدوران. في هذا المفهوم ، فإن FاF1- يتكون ATP synthase من محرك مزدوج يتكون من الدوران ج- الحلقة في Fا و γε في F1. يتم تثبيت الجزء المتحرك بواسطة الوحدات الفرعية للجزء الثابت أب2 في Fا و α3β3δ في F1. في الشكل 1أ، والوحدات الفرعية الدوارة γ و ε و ج صورت باللون الأحمر والوردي والبرتقالي على التوالي.

منذ نشر أول بنية بلورية تدعم آلية التحفيز الدوراني ، حاولت العديد من المجموعات البحثية الكشف عن الآليات الجزيئية لهذا الإنزيم الحركي ، باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات البيوكيميائية والطيفية لدراسة وظيفتها [37-39]. ومع ذلك ، فإن الهيكل غير المتماثل للأنزيم الهولندي يحد من النتائج بسبب متوسط ​​المجموعة. FاF1- إنزيم ATP synthase هو إنزيم قوي نسبيًا يمكن معالجته بسهولة ، مما يجعله مناسبًا للفحص المجهري أحادي الجزيء (والذي تطور منذ عام 1989 من التجارب الأولى مع الأصباغ في البلورات العضوية عند درجة حرارة الهيليوم السائل [40]). لا تتطلب ملاحظة التغييرات التوافقية المتسلسلة للأنزيمات المفردة كمسارات زمنية ، أي إنزيم واحد في وقت ما أو منفصل في الفضاء ، مزامنة البروتينات غير المتماثلة من أجل وضع بداية محدد جيدًا أو تشكّل في الدورة التحفيزية. سنقدم هنا بعض تجارب الجزيء المفرد التي كشفت عن آلية الدوران للمحركين النانويين المقترنين داخل FاF1-اتب سينسيز.

3. الدليل المباشر: تحلل مقايسات الدوران التي تحركها ATP خطوات 120 درجة وخطوات فرعية في F.1

في عام 1997 ، التجربة الرائدة التي أظهرت بشكل لا لبس فيه آلية الدوران في F1 جزء من FاF1تم الإبلاغ عن -ATP synthase بواسطة Noji وآخرون. [41]. قاموا بتوصيل α3β3γ مجمع فرعي من TF1 (أي F1 من المحبة للحرارة عصية سلالة PS3) إلى غطاء زجاجي مغطى بحمض Ni-nitrilotriacetic عبر علامات هيستيدين في كل وحدة فرعية ويقترن خيوط أكتين الفلورية إلى سيستين في المجال الكروي للوحدة الفرعية عبر رابط بيوتين - ستربتافيدين - بيوتين. استخدموا الفحص المجهري المرئي لتسجيل جزيئات مفردة من F1- مجمع الأكتين. بعد إضافة ATP ، تفاعل التحلل المائي في F1 تسبب في حركة دورانية أحادية الاتجاه للوحدة الفرعية التي تم تصورها في الوقت الفعلي بواسطة خيوط الأكتين. خدم اختبار الدوران هذا كنقطة انطلاق لسلسلة من تجارب الجزيء الفردي التي أدت في النهاية إلى فك تشفير خطوات التفاعل المتتالية في F1 خلال التحلل المائي ATP. إلى جانب خيوط الأكتين الفلورية ، كانت حبات الذهب النانوية [42] ، أو قضبان الذهب النانوية [43-45] ، أو البوليسترين [46] أو الخرزات المغناطيسية [47-50] ، أو تباين الخواص الفلورية المفردة [51-53] بمثابة مراسلين لدوران الوحدة الفرعية في F1 وكذلك في FاF1. في الأخير ، تم إرفاق المراسل بـ ج-حلقة [53-55].

يظهر الإعداد الرئيسي لمقايسة الدوران في الشكل 1ب مع حبة الفلورسنت كعلامة الدوران. يمكن تحديد موقع الخرزة الساطعة بدقة نانومترية في الفحص المجهري المرئي عالي السرعة. أثناء دوران الوحدة الفرعية ، تحرك مركز موضع الخرزة بضعة نانومترات فقط في x- و ذ- اتجاه الصور المجهرية. بدلاً من ذلك ، باستخدام خيوط الأكتين الفلورية كعلامة للدوران ، تم تحليل الدوران الذي يحركه ATP عن طريق تحديد نهايات خيوط الأكتين في كل إطار من إطارات الفيديو المسجل. يُعزى الموضع النهائي المتغير إلى الطرف الحر والمتحرك للخيوط ، في حين أن الطرف الآخر الذي بقي في نفس الموضع في كل صورة كان مرتبطًا باتصال الستربتافيدين بالوحدة الدوارة في F1 (أو دوار ج وحدات فرعية في FاF1 من عند بكتريا قولونية في وجود مادة منظفة كما هو موضح هنا في الشكل 1ج للراحة [34]). نتج عن رسم جميع المواضع النهائية المتغيرة ثلاثة مواضع توقف رئيسية ، والتي تم فصلها بواسطة ميكرومتر في x- و ذ-اتجاه. لذلك ، كان من السهل تمييز الزوايا الدوارة ذات الصلة. تم حساب أوقات المكوث لكل منطقة مخصصة لمواقف التوقف وإضافتها إلى الرسوم البيانية (الشكل 1د, ج-حلق بيانات التناوب من بكتريا قولونية FاF1 في المنظفات كمثال [34]). اعتمد توزيعات الوقت على تركيز ATP ([ATP]). عند ارتفاع [ATP] ، أي في النطاق الملي مولاري ، تأثرت أوقات السكون بشكل كبير بالسحب اللزج لخيوط الأكتين مما أدى إلى إبطاء الدوران ، ولكن بالنسبة إلى [ATP] المنخفض ، أقل من 1 ميكرومتر ، تتوافق أوقات السكون مع معدلات الدوران البيوكيميائية في الحل [56].

تهدف تجارب الفحص المجهري المرئي اللاحقة إلى ربط خطوات تفاعل مختلفة من التحلل المائي لـ ATP ، أي ربط ATP ، والتحلل المائي لـ ATP ، و ADP و Pأنا إطلاق ، إلى خطوات فرعية حل زاويًا γ دوران الوحدة الفرعية [42]. تم استخدام خرزات ذهبية صغيرة بحجم 40 نانومتر لتقليل الاحتكاك على الإنزيم أثناء الدوران ، وكانت هناك حاجة إلى كاميرا عالية السرعة مع 8000 إطار في الثانية لمراقبة دوران ثلاثي الخطوات عند 2 مم [ATP]. تتوافق كل نقطة توقف بعد خطوة دورانية مقدارها 120 درجة مع تفاعل التحلل المائي لـ ATP في أحد المواقع التحفيزية الثلاثة في الوحدات الفرعية. عن طريق خفض [ATP] إلى 2 ميكرومتر ، تم حل كل انتقال دوراني إلى خطوتين فرعيتين 80 درجة و 40 درجة. كانت الركيزة محدودة عند انخفاض [ATP] ، وبالتالي ، تم إبطاء ارتباط جزيء ATP. تعتمد مدة الإقامة قبل الخطوة الفرعية الدورانية البالغة 80 درجة على [ATP] ، مما يشير إلى أن (1) الخطوة الفرعية 80 درجة مرتبطة بعملية ربط جزيء ATP بموقع ربط نيوكليوتيد فارغ ، و (ii) ) المسكن قبل الخطوة الفرعية 80 درجة هي "حالة انتظار ATP" للإنزيم. كان المسكن قبل الخطوة الفرعية الدوارة 40 درجة مستقلاً عن [ATP] وكان مرتبطًا بتفاعل التحلل المائي لـ ATP وإطلاق المنتج. لذلك ، أطلق عليه اسم "المسكن التحفيزي".

بعد ذلك ، تم رصد دوران الوحدة الفرعية γ وحدث الربط لمشتق ATP الفلوري للوحدة الفرعية في وقت واحد. في هذا الفحص الدوراني ، يتم إرفاق خرز بوليسترين أو خرز مغناطيسي بـ TF1 عمل المراسلين لمتابعة دوران بواسطة مجهر المجال الساطع [57،58]. تم تصنيف ما مجموعه 10 في المائة من جزيئات ATP بشكل فلوري باستخدام صبغة السيانين Cy3 (Cy3-ATP). من خلال الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) ، تم إنشاء موجة زائلة فوق الغطاء لملاحظة جزيئات Cy3-ATP المرتبطة بـ TF فقط.1، ولكن ليس الجزيئات المنتشرة في المحلول السائب. تأرجح استقطاب الموجة الزائلة بتردد 1 هرتز. وبالتالي ، تم اكتشاف مضان Cy3-ATP المرتبط في أي من الوحدات الفرعية الثلاثة من خلال تصوير تباين مضان ذي الزاوية. تم فصل الإسفار وضوء المجال الساطع بواسطة مرآة ثنائية اللون وتم تسجيلهما في وقت واحد باستخدام كاميرا فيديو تقليدية. عند 0.6 ميكرومتر [ATP + Cy3-ATP] ، تقدمت الوحدة الفرعية γ بخطوات 120 درجة وأدى حدث ربط Cy3-ATP على الفور إلى دوران الخرزة بمقدار 120 درجة. ظل جزيء Cy3-ATP (أو مشتقه المتحلل بالماء Cy3-ADP) مرتبطًا على الأقل بدورة 240 درجة لـ γ. بقي موقع ارتباط النوكليوتيدات في β فارغًا حتى يحدث ارتباط بجزيء ATP آخر. استبعدت هذه النتائج أن كل وحدة فرعية تعمل من تلقاء نفسها ، لكنها أكدت أن جميع المواقع التحفيزية الثلاثة - جنبًا إلى جنب مع الوحدة الفرعية - تتحلل بالماء ATP في عمل متضافر. عندما تم استخدام Cy3-ATP فقط بدون ATP غير الموسوم ، تم إبطاء تفاعل التحلل المائي (انظر حسابات الالتحام ومعدلات الدوران في [59]) ، وأصبحت الخطوات الفرعية 80 درجة و 40 درجة مرئية.

من هذه التجارب وما بعدها من تجارب دوران جزيء واحد مع F المرفق بالسطح1 من المحبة للحرارة عصية سلالة PS3 ، مخطط التفاعل التالي لتحلل ATP المائي في F.1 ظهر المحرك [17،60،61]. إذا تم تحديد انتظار ATP بزاوية دوران للوحدة الفرعية γ على أنها 0 درجة ، فإن ارتباط ATP بالجانب الحفاز الفارغ يؤدي إلى حركة دورانية بمقدار 80 درجة لـ γ. في الوقت نفسه ، فإن موقع ربط النوكليوتيدات عند + 120 درجة (أي في الاتجاه الأمامي γ دوران) يطلق ADP ، بينما يحتوي الموقع عند -120 درجة على ATP من حدث الربط السابق. بعد الخطوة الفرعية الأولى 80 درجة ، يصل الإنزيم إلى المسكن التحفيزي. يتم تحلل ATP الذي تم ربطه خلال الخطوة السابقة في ADP و P.أنا. في تفاعل ثانٍ ، يطلق إطلاق الفوسفات الخطوة الفرعية التالية البالغة 40 درجة. يتم تحرير ADP خلال الخطوة الفرعية الثانية 80 درجة من الجانب الذي كان سابقًا عند -120 درجة. الحركة الدورانية لـ γ في F المنفصلة1 يعتمد المحرك على [ATP] ويحدث في ثلاث أو ست خطوات دوارة مميزة. بينما يكون دوران γ عكس اتجاه عقارب الساعة عند النظر إليه من الغشاء ، فإن تسلسل الأحداث في الوحدات الفرعية يكون في الاتجاه المعاكس ، أي بعد ربط ATP واحد بموقع فارغ في وحدة فرعية واحدة ، فإن ATP في الوحدة الفرعية المجاورة في اتجاه عقارب الساعة سوف يتحلل بالماء أثناء المكوث التحفيزي التالي.

معظم الدراسات أحادية الجزيء حول آلية F1تم تنفيذ -ATPase الموصوفة أعلاه باستخدام α3β3γ مجمع فرعي من TF1، بشكل أساسي عن طريق ربط خيوط أو خرز أكتين بالوحدة الفرعية γ. ميسوفيليك بكتريا قولونية F1 الإنزيم ، كما درس من قبل مجموعة Masamitsu Futai مع حبات ذهبية بحجم 40-60 نانومتر ، استدار بشكل أسرع قليلاً في [ATP] ودرجات حرارة مماثلة. احتوى تحضير البروتين أيضًا على الوحدة الفرعية الدورانية الثانية ε ، ولكن ليس الوحدة الفرعية الثابتة δ لـ F1 في الفحص أحادي الجزيء. عند التشبع [ATP] ، يكون معدل دوران γ في هذه F واحد1 تم الإبلاغ عن جزيئات 400 rps (أو 1200 ATP s 1 ، على التوالي) ، [62،63]. كانت أوقات المكوث الحفزي للجزيء المفرد 0.2 مللي ثانية ، أي أقصر بحوالي 10 مرات مما كان متوقعًا من قياسات المجموعة الكيميائية الحيوية للتحلل المائي ATP ، وكان وقت الانتقال لخطوات 120 درجة 0.6 مللي ثانية [64]. وبالتالي ، يمكن أن تكون آليات التوقف المؤقت العشوائية المختلفة (تثبيط ADP و تثبيط مع مساكن مميزة) أسبابًا للدليل الواضح على أن حوالي 90 في المائة من F1 يتم منع الجزيئات في قياسات المجموعة. مقارنة مع TF1، ال بكتريا قولونية يحتوي الإنزيم على مسكن تحفيزي أقصر ولكنه انتقال أبطأ قليلاً لخطوة 120 درجة [64-66]. من ناحية أخرى ، لاحظ واين فراش وزملاؤه دوران العصي النانوية الذهبية بطول 75 نانومتر المرتبطة بـ γ من بكتريا قولونية F1 تحت التشبع [ATP] بدقة زمنية عالية جدًا تبلغ 2.5 s. ووجدوا أن أوقات الثبات التحفيزي تبلغ حوالي 8 مللي ثانية في EF واحدة1، مقارنة بقياسات التحلل المائي الأكبر لـ ATP البالغة 7.7 مللي ثانية [43]. لأنه تم الإبلاغ أيضًا عن الاختلافات في معدلات الدوران بالنسبة إلى ATP التي يحركها ج- دوران الخيط في FاF1 من عند بكتريا قولونية (انظر أدناه) ، يجب إجراء أي مقارنة لمعدلات الدوران لجزيء واحد بعناية ، ومواقع طفرات السيستين لربط العلامة ، وأحجام العلامات والأشكال ، والطفرات الأخرى ، واكتمال الوحدات الفرعية في الإنزيم ، أو وجود المنظفات أو الدهون لـ FاF1 يجب تمييزها. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يتطابق القرار الزمني للنهج التجريبي مع تفاصيل الدوران المطلوب حلها.

4. توليف ميكانيكي ATP مدفوع في F واحد1 باستخدام القوة المغناطيسية الخارجية

يقع طراز F1 المركب قادر على التحلل المائي لـ ATP فقط لأنه يفتقر إلى F.ا محرك. ومع ذلك ، عندما γ في F.1 تم تحويله في الاتجاه المعاكس بواسطة قوة مغناطيسية خارجية تعمل على حبة مغناطيسية مرتبطة بـ ، ويمكن أيضًا تصنيع ATP ، مما يدل على أنه يمكن تحويل الطاقة الميكانيكية إلى طاقة كيميائية [47 ، 48]. تم استخدام المجال المغناطيسي الخارجي المطبق لدفع الإنزيم في أي اتجاه تحفيزي ، أي لفرض التحلل المائي لـ ATP أو التوليف ، أو لإيقاف الوحدة الفرعية γ عند أي زاوية دوران معينة. في غرف تفاعل البيكوليتر المختومة ، كان من الممكن اكتشاف وتحديد عدد جزيئات ATP المُصنَّعة عن طريق تفاعلات luciferin / luciferase luminescence ، أو من خلال مراقبة الدوران الذي يحركه ATP بعد إطلاق القوة المغناطيسية الخارجية ، على التوالي.

5. يمكن مراقبة دوران الوحدة الفرعية التي يحركها البروتون بواسطة جزيء واحد من الحنق

تم تطوير نهج تجريبي مختلف لمراقبة الحركات الدورانية في holoenzyme F.اF1- سينسيز ATP أثناء تخليق ATP الذي يحركه البروتون.في مجموعة Gräber ، تم تطبيق نقل طاقة الرنين Förster أحادي الجزيء (FRET) لمراقبة دوران العمود المركزي في الفرد بكتريا قولونية FاF1التركيبات -ATP. يمكن لاثنين من الأصباغ الفلورية المتقاربة ، أي في نطاق يصل إلى 10 نانومتر ، نقل الطاقة من واحدة إلى أخرى بواسطة آلية Förster غير الإشعاعية ، بشرط أن يتداخل طيف الانبعاث للفلوروفور المتبرع مع طيف الامتصاص للمستقبل ، وحظات الانتقال ثنائية القطب للأصباغ ليست متعامدة مع بعضها البعض [67]. ثم تعتمد كفاءة نقل طاقة الرنين على المسافة بين الصبغتين. لذلك ، يمكن استخدام FRET كمسطرة جزيئية داخل بروتينات مفردة لمسافات الصبغة بين 3 و 8 نانومتر. استخدم Börsch وزملاؤه اثنين من الفلوروفور المرتبطين بالوحدة الفرعية أو على الدوار وكلاهما ب الوحدات الفرعية على الجزء الثابت عن طريق السيستين المدخلة وراثيًا [68-72]. تم تحقيق وضع العلامات المحددة للسيستين ذات الصلة من خلال وضع العلامات المنفصلة لـ F.1 و Fا أجزاء ، وإعادة التجميع اللاحقة في holoenzyme مزدوجة وظيفية بالكامل ، والتي أعيد تشكيلها في الجسيمات الشحمية. احتوت هذه البروتينات الشحمية على أقل من إنزيم واحد في المتوسط ​​وأظهرت تحللًا مائيًا لـ ATP ومعدلات تخليق مماثلة للأنزيمات البرية غير المعدلة من بكتريا قولونية.

يظهر مبدأ قياس الحنق أحادي البؤر أحادي البؤر مع البروتينات البروتينية المنتشرة بحرية في المحلول في الشكل 2أ. تم تحفيز صبغة رودامين 110 (Rh110) على الوحدة الفرعية للدوار بواسطة الليزر عند 488 نانومتر وعمل كمانح FRET ، بينما صبغة السيانين الثانية 5 (Cy5) على الوحدات الفرعية للجزء الثابت ب2 بمثابة متقبل الحنق [73] (الشكل 2ب). تم الكشف عن تألق كل من الأصباغ عن طريق الثنائيات الضوئية الحساسة للانهيار الجليدي وتم تسجيله باستخدام إلكترونيات عد الفوتون الفردي المرتبط بالوقت بدقة زمنية بيكو ثانية. بمجرد دخول البروتين الشحمي إلى حجم الإثارة / الكشف المتحد البؤر بحجم فيمتوليتر بسبب الحركة البراونية ، فإن متبرع FRET Rh110 على FاF1 مرارًا وتكرارًا وأصدر فوتونات في انفجار. تعتمد شدة التألق على الموضع الفعلي للصبغة داخل تركيز الليزر ، والذي كان له توزيع كثافة غاوسي ثلاثي الأبعاد تقريبي. كان متوسط ​​وقت عبور البروتينات الشحمية حوالي 30-50 مللي ثانية ، ولكن يمكن ملاحظة عدد قليل من البروتينات الشحمية لمدة تصل إلى عدة مئات من الألف من الثانية (الشكل 2)ج ، د). لتشغيل تخليق ATP ، تم تنشيط البروتينات الشحمية مع إنزيم واحد بواسطة a Δالأس الهيدروجيني باستخدام الخلط في وجود فرق الجهد الكهربائي الناتج عن جهد انتشار K + [11]. بالنسبة لقياسات الدوران أثناء التحلل المائي لـ ATP ، تمت إضافة 1 ملي مولار من ATP إلى المخزن المؤقت في وجود 2.5 ملي مولار مغ 2+. تركيز الجسيمات الشحمية المحتوية على واحد فقط يحمل علامة FاF1- تم ضبط سينسيز ATP إلى حوالي 100 ميكرومتر بحيث في المتوسط ​​الزمني ، تم اكتشاف إنزيم واحد فقط في بؤرة المجهر متحد البؤر. في وجود AMP-PNP ، أظهر كل إنزيم واحدًا من ثلاث كفاءات مختلفة لـ FRET تقابل ثلاثة اتجاهات محتملة للوحدة الفرعية γ داخل F1 جزء. من كفاءات FRET ، تم حساب مسافات الصبغ إلى الصبغة حوالي 4.5 و 6.5 و 8 نانومتر لكل اتجاه وحدة فرعية. كانت هذه المسافات متوافقة مع نموذج F.اF1 من عند بكتريا قولونية.

الشكل 2. (أ) مراقبة دوران الوحدة الفرعية في F واحد معاد تكوينهاF1-ATP synthase بواسطة مجهر فريت متحد البؤر. يعبر البروتين الشحمي بشكل تعسفي حجم الإثارة / الكشف متحد البؤر بسبب الحركة البراونية. (ب) مواقف FRET fluorophores في FاF1-اتب سينسيز. متبرع فريت Rh110 (نقطة زرقاء) على الوحدة الفرعية ɛ تم توصيل الجزء الدوار الموضح باللون الأسود من المحور المركزي للدوران وكان من المتوقع أن يتحرك وفقًا للسهم الأزرق أثناء التحلل المائي لـ ATP. كان الدوران عكسًا لتوليف ATP (السهم الأخضر). تم إرفاق متقبل FRET Cy5 (النقطة الحمراء) بـ ب يظهر ثنائى الوحدة الفرعية للجزء الثابت باللون الرمادي. (ج) انفجار الفوتون لـ F المسمى FRETاF1- سينسيز ATP أثناء التحلل المائي لـ ATP. تُظهر اللوحة السفلية مسارات شدة التألق لمانح FRET Rh110 (تتبع أخضر. أناد) والمقبول Cy5 (تتبع أحمر ، أناأ). تُظهر اللوحة العلوية عامل القرب المقابل P كتتبع أزرق ، مع P = أناأ / (أناد + أناأ). تم تعيين مستويات كفاءة FRET يدويًا وسميت "الحنق العالي" H و "الحنق المتوسط" M و "الحنق المنخفض" L. كان تسلسل FRET → H → M → L → H → (مقتبس من [73]). (د) انفجار الفوتون لـ F المسمى FRETاF1-ATP synthase أثناء تخليق ATP. تُظهر اللوحة السفلية مسارات شدة التألق وتوضح الألواح العلوية أثر عامل القرب. تم عكس تسلسل FRET → L → M → H → L → (مقتبس من [73]).

أثناء التحفيز ، أيضًا ، تم العثور على ثلاثة كفاءات FRET. ومع ذلك ، فقد تغيروا سريعًا وتدريجيًا داخل دفقات الفوتون من الإنزيمات المفردة. تم عكس تسلسلها ، اعتمادًا على الظروف التحفيزية كما هو موضح في الأشكال 2ج للتحلل المائي ATP و 2د لتوليف ATP. تم العثور على متوسط ​​أوقات السكون لمستويات FRET في نطاق 12-20 مللي ثانية للتحلل المائي ATP ، أو بين 17 و 50 مللي ثانية لتخليق ATP ، على التوالي. تتوافق هذه المساكن مع معدل دوران إنزيم واحد يبلغ حوالي 70 ATP s −1 للتحلل المائي لـ ATP وما يصل إلى 50 ATP s −1 لتخليق ATP. كانت معدلات الجزيء المفرد في توافق جيد مع معدلات المجموعات الكيميائية الحيوية لنفس مستحضرات الإنزيم المعاد تكوينها في الجسيمات الشحمية. كان تقدم مستويات FRET الثلاثة هو نفسه في حوالي 80 في المائة من جميع مستويات FRET ، لكنه انعكس في الظروف البيوكيميائية المتعارضة. بالنسبة للتحلل المائي ATP والتوليف ، كانت مستويات الحنق الثلاثة متشابهة ، وهي مستقلة عن اتجاه الدوران. هذا لم يوضح فقط أن γ و هما بالفعل جزء من الدوار في holoenzyme F.اF1-ATP synthase ، ولكن أيضًا الأحداث التحفيزية أثناء تخليق ATP والتحلل المائي لـ ATP قابلة للعكس من حيث المبدأ. في ظل وجود المثبط غير التنافسي aurovertin B ، يمكن أن تتفكك الاختلافات في الحركة الدورانية لـ γ أثناء تخليق ATP والتحلل المائي لـ ATP ، مما يشير إلى أن المثبطات لا تعمل فقط كعناصر تحكم لقياسات النشاط الكيميائي الحيوي ، ولكن يمكن أيضًا استخدامها للحصول على آلية إضافية معلومة. يمكن أن تميز قياسات FRET أحادية الجزيء بين التباطؤ العام للدوران أثناء التحلل المائي لـ ATP والحصار الجزئي للدوران أثناء تخليق ATP [73].

في تجربة لاحقة أحادية الجزيء الحنق ، حجم خطوة التدوير ج- الحلقة في FاF1- تم حل سينسيز ATP [74]. تم دمج البروتين الفلوري الأخضر المحسن (EGFP) في الوحدة الفرعية للجزء الثابت أ في Fا وعمل كمتبرع FRET [75] ، في حين أن متلقي الفلوروفور Alexa568 كان مرتبطًا تساهميًا بسيستين واحد ج الوحدة الفرعية. كانت الإنزيمات المفردة المعاد تكوينها مدفوعة بقوة دافعة بروتون لتخليق ATP. تم الكشف عن إنزيمات دوارة مزدوجة العلامات عن طريق إثارة الليزر المتناوب النبضي مع دورة عمل محسّنة [76،77]. تم تمييز ما يصل إلى خمسة مستويات مختلفة من الحنق. ومع ذلك ، كانت تغييرات كفاءة FRET أصغر وأوقات السكون أقصر من ذي قبل ، كما هو متوقع لحركة دورانية من 10 خطوات مع نفس معدل الدوران للدوران الكامل مثل المحرك ثلاثي الخطوات في F1. تم تعيين تغييرات FRET الصغيرة والكبيرة يدويًا في مجموعة البيانات ، لكن تقدم مستويات FRET لم يكن دائمًا واضحًا وأحادي الاتجاه. تم تحديد الدقة الزمنية لتجربة FRET أحادية الجزيء بـ 1 مللي ثانية بسبب انخفاض السطوع والخصائص الفيزيائية الضوئية للفلور ، بحيث يمكن تفويت بعض المساكن القصيرة. تم إنشاء مسارات وقت FRET لمحاكاة جزيء واحد من خلال نهج مونت كارلو لتسهيل تفكك ج-حجم خطوة الحلقة. محاكاة من 10 خطوات ج- تمت مقارنة الحلقات بخمس مسافات مختلفة من الحنق لأسباب تتعلق بتماثل الحلقة بـ a ج- حلقة تدور بثلاث خطوات بزاوية 120 درجة. بعد ذلك ، يمكن أن تكون نتائج FRET التجريبية مناسبة بشكل أفضل عند افتراض دوران من 10 خطوات. وهكذا استنتج أن الروتاري ج- يتم إجراء سلسلة الإنزيم بالفعل في خطوات 36 درجة أثناء تخليق ATP. ومع ذلك ، لا يمكن استبعاد أن توزيع مستوى FRET أحادي الجزيء سيدعم أيضًا مجموعة من 80 درجة + 40 درجة من الخطوات الفرعية ، والتي تم الإبلاغ عنها لـ TF المحبة للحرارة.1 خلال التحلل المائي ATP.

إن الدوران خطوة تلو الأخرى لملف ج- تم دعم الحلقة لوضع التحلل المائي ATP باستخدام nanorods [44] أو nanobeads [78]. ومع ذلك ، فإن الطفرات في مسار انتقال البروتون عبر الوحدة الفرعية أ أو زيادة السحب اللزج لحل الخطوات الفرعية في هذه التجارب. كما تمت مناقشته في حالة دوران الوحدة الفرعية في F.1 أعلاه ، من المهم مقارنة سرعة دوران الجزيء المفرد وأحجام الخطوات بحذر. سيؤثر استخدام الجسيمات الشحمية المغلقة في تجارب FRET على عكس البقع الدهنية ثنائية الطبقة المدعومة بالسطح أو الأقراص النانوية الدهنية على وإبطاء دوران الوحدة الفرعية التي يحركها ATP بسبب تراكم فرق تركيز البروتون المضاد بواسطة الإنزيم المقترن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مواضع الأحماض الأمينية لطفرات السيستين لن تسمح فقط بربط الفلوروفور أو غيرها من الواسمات ، ولكنها قد تغير المعدلات التحفيزية للأنزيمات الطافرة أيضًا. ومع ذلك ، نظرًا لوجود عدم تطابق بين الدوران المكون من 10 خطوات في Fا والدوران ثلاثي الخطوات في F1، عززت هذه النتائج نموذج اثنين من المحركات النانوية المقترنة بشكل مرن تم تطويره بواسطة Junge وزملاؤه [4،79-82].

5. تتطلب أحجام الخطوات المختلفة للمحركين المقترنين مرونة داخلية

في FاF1- ATP synthase ، اثنان من المحركات النانوية يعملان ضد بعضهما البعض. اعتمادًا على القوة المحركة للبروتون ، فإن بكتريا قولونية يمكن أن تتحول الإنزيمات الموجودة في البروتينات الشحمية من تخليق ATP إلى التحلل المائي لـ ATP [3]. الإمكانات الكيميائية لتخليق ATP أو التحلل المائي في F1 يعمل ضد فرق الجهد الكهروكيميائي على الغشاء الذي يحرك المحرك في Fا. يعمل المحركان بتروس مختلفة. F1 هو محرك ذو 3 خطوات ، بينما Fا هو محرك ذو 10 خطوات في الإشريكية القولونية (أو 8-15 خطوة ، حسب الكائن الحي). السؤال الذي يطرح نفسه هو كيف تنتقل الطاقة بين هذين المحركين ، وكيف يمكن للإنزيم التغلب على حواجز الطاقة لنظام حيث يتم ربط محركين مع تروس مختلفة بإحكام. تم اقتراح أن المحركات مقترنة بشكل مرن [4،79-82]. بدلاً من النظام الجامد ، تكون أجزاء معينة من هذا الإنزيم لينة بشكل مرن ويمكنها تخزين الطاقة بشكل عابر إلى حين الحاجة إلى التفاعل الكيميائي. وبالتالي ، يمكن أن يعمل الإنزيم بمعدل دوران عالٍ وكفاءة حركية.

في سلسلة من التجارب أحادية الجزيء ، حدد سيلاف وزملاؤه هذه العناصر المرنة [49،50]. استخدموا المسوخ بكتريا قولونية F1 أو F.اF1 التي تحتوي على اثنين من السيستين المهندسة ، أحدهما في الدوار (الوحدات الفرعية γ أو ج) والآخر في الجزء الثابت (الوحدات الفرعية β أو α أو أ) معارضة السيستين السابق (الشكل 3أ). أزواج السيستين ، وهما aI223C / cL72C (الأزرق في الشكل 3أ) ، βD380C / γA87C (أخضر) و αE284C / A276C (أحمر) ، على طول ساق الدوار لمسح مرونته المختلفة. في اختبار الدوران ، تم إرفاق الإنزيم بسطح الزجاج عبر علامات الهيستيدين في كل وحدة فرعية ، في حين أن خيوط الأكتين القصيرة ذات العلامات الفلورية (حوالي 0.5 ميكرومتر) أو حبة مغناطيسية مخدرة (1 ميكرومتر) مرتبطة بالإنزيم على الجانب الآخر كانت بمثابة مراسل لـ الفحص المجهري بالفيديو. كان الصحفيون ملزمين إما بـ ج- الحلقة في FاF1، أو في F1، على التوالي (الشكل 3أ,ب).

الشكل 3. (أ) مقايسة الدوران مع بكتريا قولونية FاF1 تعلق على غطاء زجاجي عبر الهيستيدين (صاحب) - علامات في الوحدة الفرعية β ، مدفوعة بالتحلل المائي ATP. يقترن خيوط الأكتين الفلورية المسمى TMR بعلامات strep في كل منها ج الوحدة الفرعية عبر رابط بين الستربتاكتين والبيوتين. لمراقبة المرونة الداخلية للجزء المتحرك ، تم تصميم ثلاث طفرات لكل منها مع سيستين متعارضين على الجزء المتحرك والجزء الثابت كما هو محدد. بعد الأكسدة ، عملت على تشكيل جسر ثنائي الكبريتيد وتثبيط الإنزيم في وضع معين. (ب) تم استخدام جسيم مغناطيسي مخدر Q-dot بدلاً من خيوط أكتين لمراقبة المرونة الداخلية للجزء الثابت ، أي الوحدات الفرعية ب2. كان الجسيم المغناطيسي مغطى بالستربتافيدين أو الستربتاكتين لربطه به ب2، إما مباشرة عن طريق اثنين من السيستين / البيوتين في جزء لا يتجزأ من الغشاء من الوحدات الفرعية ب، أو بشكل غير مباشر إلى ج-ring ، التي تم ربطها بالوحدة الفرعية أ عبر سيستين كما هو محدد ، على التوالي. (ج) الامتثال لمركب الإنزيم - خيوط للطفرات الثلاثة المزدوجة الموضحة في (أ) ، التي تحددها التقلبات الحرارية للبروتين المترابط. تم تزويد المدرج التكراري باستخدام Gaussians وتم اشتقاق الصلابة الالتوائية من عرضهم المعكوس مما أدى إلى 450 و 59 و 47 pN · nm للمنحنى الأزرق والأخضر والأحمر ، على التوالي (مقتبس من [50]). (د) نموذج FاF1 تظهر باللون الأحمر موقع أعلى مرونة ، أي موقع التلامس لـ ج-حلقة مع γε. يتم إعطاء التوافق في وحدات pN · nm لمجالات مختلفة من الإنزيم (الشكل المقدم من S. Engelbrecht و W. Junge).

بعد إضافة ATP وتحت ظروف الاختزال ، بدأت الوحدات الفرعية بالدوران كما هو متوقع. عند الأكسدة ، شكل السيستين جسرًا لثاني كبريتيد وتوقف الإنزيم عن الدوران. في هذه الحالة ، كانت التقلبات الحرارية لنظام مراسل الإنزيم مرئية فقط. أظهر الرسم البياني لهذه التقلبات توزيعات تشبه Gaussian (الشكل 3ج). كان عرض σ للغاوسيين متناسبًا عكسياً مع الصلابة الالتوائية κ (في pN · nm) بمقدار σ = kبتي /κ، أين كب هو ثابت بولتزمان ، و T درجة الحرارة المطلقة. عمود الملف الملفوف γ لديه صلابة متوسطة مع κ = 320 نيوتن متر. يقع الجزء ذو الصلابة الالتوائية الأصغر بين مواقع توليد عزم الدوران في F1 و Fا—هذا هو ، عند واجهة الجزء الكروي من γ و ج-حلقة. مع صلابة الالتوائية أقل من 70 نيوتن متر ، يمكنها تخزين ما يصل إلى 14 كيلو جول مول -1 من الطاقة المرنة لتسهيل تعاون المحركين عندما يعملان ضد بعضهما البعض. في الإنزيم غير المقيد ، كان التوافق أقل (حوالي 35 نانومتر كما يستدل من مواضع السكون للإنزيم) ، بسبب الحركة المفصلية المرنة للرافعة في الوحدات الفرعية. علاوة على ذلك ، كشفت محاكاة الديناميكيات الجزيئية للنظام الحر والمتشابك عن اتفاق مذهل مع البيانات التجريبية [83].

من ناحية أخرى ، تم العثور على الجزء الثابت على الأقل 10 مرات أكثر صلابة من الجزء الأكثر توافقًا من الجزء المتحرك. مرونة النوع البري ب2 تمت مقارنة ديمر مع متحور ب الوحدات الفرعية التي إما تم استطالة 11 من بقايا الأحماض الأمينية ("طويلة") أو عدم استقرارها عن طريق استبدال ثلاث بقايا متتالية بالجليسين ("Gly3-mutant") [49]. في الفحص الدوراني ، عملت حبة مغناطيسية مخدرة Q-dot مقترنة بالجزء الثابت كمراسل لمراقبة حركة FاF1 (الشكل 3ب). نظرًا لأن الجزء الثابت لا يدور من تلقاء نفسه ، فقد تم تحفيز الحركة بشكل مصطنع عن طريق تطبيق مجال مغناطيسي دوار خارجي ، والذي دفع الخرزة للأمام أو للخلف. تم اختبار طريقتين للتشغيل. (ط) عندما اقترن الخرزة المغناطيسية بنهاية الغشاء المتكاملة لـ ب2 ديمر عن طريق اقتران السيستين - البيوتين - الستربتافيدين ، كان الثنائى ملتويًا حول محوره. (2) حركة الانحناء الفسيولوجية ب2 تمت دراسته عن طريق اقتران الخرزة المغناطيسية بالخرز المغناطيسي ج-الحلقة التي تم ربطها بوحدة فرعية أ. في جميع الحالات ، كان الامتثال حوالي 500 نيوتن متر ، باستثناء ثني متحولة Gly3. هنا ، كان الامتثال أقل بثلاث مرات مقارنة بالأنزيم من النوع البري. تم تخفيض نشاط الضخ H + المعتمد على ATP للطفرات إلى النصف مقارنة بالنوع البري من النوع F.اF1-اتب سينسيز. ومع ذلك ، فإن هذه المسوخات ذات الجزء الثابت غير المستقر كانت نشطة ، لأن خفض امتثالها بمقدار ثلاثة أضعاف (أي لا يزال حجمًا أكبر من توافق الجزء المتحرك) لم يؤثر بشكل كبير على استقرار الجزء الثابت. يتم تلخيص خصائص المرونة في الشكل 3د. دعمت هذه البيانات النموذج النظري لنقل الطاقة في FاF1- سينسيز ATP عن طريق تشوهات عابرة عابرة في الدوار.

6. يكشف الحنق أحادي الجزيء ثلاثي الألوان عن التواء يصل إلى 120 درجة

لتحديد التشوهات المرنة للوحدات الفرعية للدوار دون ربط خرزات كبيرة أو خيوط ولمراقبة هذه التقلبات التوافقية أثناء تخليق ATP ، فإن أسلوب FRET أحادي الجزيء مع انتشار F وحيداF1تم تمديد تركيبات -ATP في الجسيمات الشحمية مؤخرًا إلى تجربة ثلاثة فلوروفور [77،84]. يظهر إعداد المجهر متحد البؤر متعدد الألوان في الشكل 4أ. ثلاثة متحولة من بكتريا قولونية FاF1- تم استخدام ATP synthase الذي يشتمل على البروتين الفلوري EGFP المدمج في الطرف C من أ الوحدة الفرعية بصفتها متبرعًا أوليًا لـ FRET ، الوحدة الفرعية ε المسمى بـ Alexa532 كمانح ثانوي لـ FRET في البقايا 56 ، بالإضافة إلى ملصق Cy5 كمستقبل FRET على السيستين الذي تم تقديمه في البقايا 2 في واحد من العشرة ج الوحدات الفرعية (الشكل 4ب). كان الهدف من هذا الإعداد الطيفي هو ربط التشوهات الداخلية للوحدات الفرعية للدوار بالدوران العام للوحدات الفرعية الثلاث γεج10 كدليل على النشاط التحفيزي للإنزيم. وبالتالي ، يمكن تمييز المصنوعات الفيزيائية الضوئية على مستوى التألق أحادي الجزيء مثل التقلبات الطيفية والوميض من التواء عابر لـ مقابل ج الوحدات الفرعية. مؤشرات للحركات النسبية بين و ج تم العثور عليها أيضًا بواسطة Gräber وزملائه [85].

الشكل 4. (أ) الإعداد التجريبي لقياسات FRET ثلاثية الألوان متحد البؤر باستخدام ثلاثة أشعة ليزر متناوبة في دورة العمل المُحسَّنة (مقتبس من [77]). (ب) مواقف الفلوروفورات الثلاثة على F واحداF1- سينسيز ATP في جسيم شحمي. EGFP (المستطيل الأزرق) هو المتبرع الأول لـ FRET على السكون أ الوحدة الفرعية ، التي تثيرها الليزر 488 نانومتر. يتم توصيل Alexa532 (النقطة الخضراء) بالوحدة الفرعية الدوارة ويعمل كمستقبل FRET لـ EGFP بإثارة 488 نانومتر ، ولكنه يصبح فيما بعد المتبرع الثانوي لـ FRET عندما يكون متحمسًا بنبض الليزر 532 نانومتر. Cy5 (نقطة حمراء) على واحدة من 10 دوارة ج الوحدات الفرعية هي متقبل FRET لكل من EGFP و Alexa532. (ج) رسم تخطيطي لقياسات مسافة الحنق بالتناوب في إنزيم واحد بين الموضع الثابت لـ EGFP على أ وثلاث مواضع إيقاف للوحدة الفرعية الدوارة (النقاط الخضراء ذات المواضع 1 و 2 و 3). التواء الجزء المتحرك بين ε و ج يرجع ذلك إلى أحجام الخطوات المختلفة لكل من الوحدات الفرعية الدوارة ويؤدي إلى تغييرات مسافة FRET وفقًا للأسهم البرتقالية. (د) انفجار الفوتون من F واحداF1- سينسيز ATP يشتمل على قياسين FRET متزامنين في إنزيم واحد. تظهر مسارات الفلورة السفلية المتبرع بـ FRET EGFP (أزرق) ومتقبلات FRET المدمجة Alexa532 بالإضافة إلى Cy5 (الأخضر). تغيرت الشدة النسبية خلال وقت المراقبة وأسفرت عن تغييرات تدريجية لعامل القرب (كما هو موضح في التتبع الرمادي أعلاه). تم تسجيل مسار FRET المرتبط بـ Alexa532 كمانح FRET (سماوي) و Cy5 كمتقبل FRET (أحمر) أثناء الإثارة 532 نانومتر. يشير مسار المسافة (أزرق / برتقالي) في اللوحة العلوية إلى التواء تدريجي بين ε و ج بالإضافة إلى تقلبات المسافة المرنة خلال النصف الثاني من انفجار الفوتون هذا (الشكل 4ب,ج و د مقتبس من [84]).

باختصار ، فإن متحولة السيستين εH56C في F.1 تم إنتاجه في بكتريا قولونية سلالة RA1. F1 تم تحضيره ووصفه بـ Alexa532-malimide. تم تحديد متوسط ​​كفاءة وضع العلامات بنسبة 35 في المائة. تم العثور على محرك F مزدوج الطافرةاF1-ATP synthase مع EGFP على أ وسيستين تم إدخاله في موضع البقايا 2 من ج تم تنقيته بشكل منفصل. بعد وضع العلامات على مقياس التكافؤ ج- بحوالي 7.4 في المائة مع Cy5-monomaleimide ، تمت إعادة تشكيل الإنزيم في الجسيمات الشحمية مسبقة التشكيل ، و F1 تم استبدالها بـ Alexa532 المسمى F1. معدلات نجاح F1 لم يتم تحديد إجراءات الصرف. وهكذا ، تم تراكب ثلاثة أطوال موجية ليزر (488 و 532 و 635 نانومتر) في نفس حجم الإثارة متحد البؤر وتم تطبيق تسلسل نبضي لنظام إثارة ليزر متناوب محسّن لدورة العمل (DCO-ALEX ، الشكل 4أ) للتعرف على عدد قليل من FاF1التركيبات - ATP مع وجود جميع الفلوروفورات الثلاثة [77،84].

قياسين FRET متزامنين على كل F واحداF1تم دمج -ATP synthase كما هو موضح في الشكل 4قبل الميلاد. أول قياس للمسافة بين EGFP على الوحدة الفرعية الثابتة أ (أزرق) والعلامات الموجودة على الوحدتين الفرعيتين للعضو الدوار ε (أخضر) و ج (أحمر) كشف عن إنزيم نشط عندما تم اكتشاف تقلبات الحنق التدريجي على النحو التالي ɛ/ ج استدارة من موضع التوقف 1 لإيقاف الموضعين 2 و 3. بعد ذلك ، قياس المسافة الثانية عبر الوحدات الفرعية للدوار ε و ج، يشار إليها بالسهام البرتقالية في الشكل 4ج، كشف الالتواء الزاوي بين هذين الصباغين على نفس الإنزيم. يظهر أحد الأمثلة على انفجار الفوتون هذا في الشكل 4د. سبر الإثارة النبضية باستخدام الليزر 488 نانومتر في حركة الوحدات الفرعية للجزء المتحرك فيما يتعلق بالجزء الثابت. في اللوحة الدنيا ، غيرت شدة التألق النسبية لمانح FRET EGFP ومتقبلات FRET Alexa532 بالإضافة إلى Cy5 الخطوة الحكيمة من كفاءات FRET منخفضة إلى متوسطة إلى عالية ، كما هو موضح في تتبع عامل القرب المقابل أعلاه (المسار الرمادي). أظهر إثارة الفلوروفور Alexa532 على ε مع 532 نانومتر الآن بمثابة المتبرع الفعلي لـ FRET تغييرات كفاءة FRET إلى متقبل Cy5 على ج من خلال تغيرات الشدة النسبية داخل انفجار الفوتون هذا. مسار مسافة الحنق المقابل في اللوحة العلوية من الشكل 4د (أزرق - برتقالي) يشير إلى تغير كبير في المسافة من 6 إلى 5 نانومتر في بداية انفجار الفوتون ، والذي أعقبه تقلبات في المسافة من حوالي 0.5 - 1 نانومتر. على أساس تجارب الحنق هذه ، قمنا بتحليل كمي للحركات النسبية لـ ε و ج خلال كل من تخليق ATP والتحلل المائي ATP [86]. وجدنا التواءًا واسع النطاق في هذا القسم من الدوار ، يشمل مجال البرميل و ج- الحلقة ، أكبر بكثير من 36 درجة وربما في نطاق يصل إلى 120 درجة.

أكدت بيانات FRET أحادية الجزيء وقياسات التذبذب الزاوي المستندة إلى حبة الفرضية أن جزءًا كبيرًا من إجمالي الطاقة المرنة الالتوائية للدوار يتم تخزينه في الجزء الدوار المرن ، بينما يكون الجزء الثابت صلبًا جدًا ولا يساهم في الامتثال العالي من FاF1-اتب سينسيز. من المحتمل أن يكون الجزء الأكثر نعومة موجودًا في واجهة المحركين النانويين المتدرجين ، أي حيث يكون مطلوبًا ميكانيكيًا لتشغيل الإنزيم بكفاءة حركية عالية.

7. التوقعات

ما الذي تعلمناه خلال 15 عامًا من تجارب دوران الجزيء المفرد باستخدام F1 و FاF1التركيبات -ATP؟ بادئ ذي بدء ، البراهين التجريبية لدوران الوحدة الفرعية والتمييز بمقدار 120 درجة عند ارتفاع [ATP] والخطوات الفرعية عند [ATP] المنخفض في F1 سمح لنا بتحسين نموذج الحفز الدوراني. تُعزى الخطوات الكيميائية الأربع لتحلل ATP المائي ، أي من الارتباط بانقسام الرابطة إلى إطلاق المنتجات ، ليس فقط من خلال توقيتها ولكن أيضًا فيما يتعلق بمواقع الارتباط التحفيزي المتزامن الثلاثة على الإنزيم. كانت مزايا التصور المباشر للخرز الدوار أو الخيوط المرتبطة بالأنزيمات المرتبطة بالسطح (1) أوقات مراقبة طويلة جدًا لجزيء واحد مع العديد من التحولات والإحصاءات الجيدة ، و (2) إمكانية تغيير الظروف الكيميائية الحيوية ومراقبة آثارها على السلوك الدوار لنفس الإنزيم. تتطلب قياسات المرونة أحادية الجزيء كلا المنفعة. إن دقة الزوايا والوقت للأحجام المتدرجة للمحركات النانوية الدوارة عالية جدًا باستخدام الجسيمات النانوية الساطعة غير المبيضة كمراسلين. أتاح إرفاق خرز مغناطيسي على الدوار في النهاية صنع وقياس "ATP من صنع الإنسان" عن طريق الدوران القسري في غرف التفاعل الصغيرة.

ستزيد طرق المعالجة والتصوير أحادية الجزيء الأخرى مثل الفحص المجهري للقوة الذرية [87] أو الملاقط الضوئية الناعمة جدًا من دقة الدورة التحفيزية الكيميائية الميكانيكية في قاعدة ATPase هذه. التجارب جارية التي تحقق التحفيز الميكانيكي لمجالات مختلفة من F1 لربط قوى الاتجاه مع دوران الوحدة الفرعية المستحث. تتيح الإحصائيات غير العادية للتغيرات التوافقية المستندة إلى جزيء واحد متصل بالسطح إجراء تحليلات نظرية متقدمة مثل نظريات التذبذب [88،89].

يبدو أن قياسات الحنق أحادي الجزيء مكملة لهذا النهج. تم قياس اتجاه الدوران بواسطة FRET لكل من التحلل المائي ATP وتوليف ATP. لم تساهم جزيئات الصبغة الصغيرة في السحب اللزج. ومع ذلك ، فإن مواقف طفرات السيستين في FاF1- لا يزال يتعين التحكم في سينسيز ATP لتجنب انخفاض معدلات الدوران. وظيفة المثبط dicyclohexylcarbodiimide (الارتباط بـ ج الوحدة الفرعية ومنع الدوران في Fا) من المثبط aurovertin B ، الذي يبطئ الدوران أثناء التحلل المائي لـ ATP ولكن يبدو أنه منع الدوران أثناء تخليق ATP. على النقيض من قياسات الحنق أحادي الجزيء لـ ATPase KdpFABC من النوع P ، وهو ناقل بكتيري K + مع مجال ربط نيوكليوتيد مرن واحد [90،91] ، أو إلى P-glycoprotein الناقل ATP الذي يحركه ATP [92] مع اثنين من مواقع ربط ATP ، و FاF1- أظهر سينسيز ATP ارتباطًا مباشرًا بربط ATP والتغيرات التوافقية التدريجية. نظرًا لأنه يمكن حظر الدوران المتدرج تمامًا بواسطة المثبطات ، كان من الممكن التمييز بين التقلبات الحرارية لمجال البروتين المسمى من التحولات بين التطابقات أثناء التحفيز. يمكن توقع سلوك دوار مماثل للنوع A المرتبط هيكليًا (بما في ذلك ثيرموفيلوس إنزيم [78،93]) و ATPases من النوع V الفراغي [94،95]. الدقة الزمنية للتحولات التوافقية المكتشفة بواسطة جزيء واحد FRET مع FاF1- وصل سينسيز ATP إلى نطاق أقل من مللي ثانية [72،96] ولكنه يعتمد على نسبة الإشارة إلى الضوضاء. لذلك ، يتم اتباع التحولات السريعة بشكل أكثر دقة باستخدام مجسات تشتت الضوء [43]. نظرًا لأن طريقة FRET أحادية الجزيء محدودة دائمًا بالفيزياء الضوئية للأصباغ ، فمن المتوقع حدوث مزيد من التحسينات بواسطة الفلوروفورات الجديدة ذات الثبات الضوئي العالي [97،98] أو بواسطة البلورات النانوية الفلورية [99].

تقتصر مراقبة البروتينات المنتشرة بحرية على أقل من ثانية بسبب وقت العبور من خلال تركيز الليزر. يمكن استخدام أجهزة محاصرة الجسيمات غير الضوئية الجديدة مثل المصيدة الكهربائية الحركية المضادة للبراون [100-104] (مصيدة ABEL) التي اخترعها كوهين ومورنر للقبض على حرف F واحد ودفعه بفاعلية.اF1- سينسيز ATP إلى الموضع المستهدف لقياسات الحنق متحد البؤر [105]. بعد ذلك ، فإن الأعداد المختلفة من البروتونات المنقولة المطلوبة لصنع جزيء ATP واحد في FاF1- يمكن مقارنة تركيبات ATP للبلاستيدات الخضراء [3،106] ، والبكتيريا [3] أو الميتوكوندريا [107] (كما تم حسابه من قياسات المجموعة) بأحجام خطوات الدوارة ج-حلقات مفردة Fا المحركات.


مناقشة

في هذه الدراسة ، قمنا بقياس وقت الاستقرار الظاهر لنطاقات SH2 داخل مجال إضاءة TIR بالقرب من غشاء الخلية. وجدنا أن متوسط ​​وقت الإقامة أطول من المتوقع على أساس معدل التفكك الكيميائي ، وبالنسبة لمجالات SH2 الأحادية ، أظهرت حركية التفكك عدم تجانس قليل. على الرغم من أنه لا يمكن استبعاد الاحتمالات الأخرى تمامًا ، فإن أبسط تفسير وأكثر ترجيحًا هو أن التفاعل بين مجالات SH2 ومواقع p-Tyr ينطوي على إعادة ربط متكرر. نقترح أن إعادة الارتباط هي نتيجة المنافسة بين معدل الحركية الكيميائية الجوهرية السريع جدًا لتفاعل الارتباط ومعدل الانتشار البطيء نسبيًا للجزيئات الحيوية في الجسم الحي. جزء من سبب ارتفاع معدل الارتباط الكيميائي هو وجود وفرة من مواقع ربط p-Tyr المتاحة ، لأن كل جزيء مستقبل له مواقع فسفرة متعددة وبسبب تجمع المستقبلات التي تزيد من التركيز المحلي لمواقع الربط . نظرًا لأن جزيئات SH2 لا تنفصل بشكل مباشر عن المستقبلات في نموذجنا ، فإن المفهوم التقليدي لوقت الدوران له معنى غامض في هذه الحالة. في الواقع ، هناك فترتان مختلفتان لدوران العمل. وقت دوران SH2 على موقع p-Tyr فردي قصير جدًا ، لأن الجزيء ينفصل بسرعة. يتوافق التفكك السريع مع حقيقة أن مواقع p-Tyr يمكن إزالتها بسرعة كبيرة (26) وبالتالي فهي غير محمية بربط SH2 لفترة طويلة جدًا. من ناحية أخرى ، فإن وقت دوران SH2 فيما يتعلق بمجموعة المستقبلات طويل نسبيًا ، لأن جزيء SH2 & # x0201chops & # x0201d بين مواقع الربط. تتنبأ النظرية أن التجميع يعمل على استقرار الارتباط بين مواقع p-Tyr وجزيئات SH2 ، والتي تحققنا منها في التجارب.

يشير اكتشاف أن بروتين SH2 يقفز بين مواقع الربط العنقودية على طول غشاء الخلية إلى أن جزيء SH2 واحد ، عند تجنيده في الغشاء ، يمكن أن يتفاعل مع مواقع p-Tyr المتعددة القريبة من بعضها البعض. قد يلعب هذا النوع من الآلية أيضًا دورًا في تفاعلات البروتين داخل الخلايا الأخرى. على سبيل المثال ، كشفت دراسات تفاعل Cdc4 مع Sic1 أن Cdc4 يمكن أن يتفاعل مع عدة مواقع فسفرة على Sic1 على الرغم من أن Cdc4 يحتوي على موقع تفاعل واحد فقط (27). جنبًا إلى جنب مع النتائج التي توصلنا إليها ، يبدو من المعقول أن التوازن الديناميكي من خلال أحداث إعادة الارتباط المتعددة هو موضوع مشترك لتفاعلات البروتين الفسفوري. تقلل آلية إعادة الربط من أهمية مواقع الربط المفردة عالية التقارب. فيما يتعلق بإشارات RTK ، فإن أوقات السكون SH2 تعتمد على متوسط ​​التقارب للعديد من المواقع الفسفرة التي تفتقر إلى موقع واحد عالي التقارب سيكون لها تأثير معتدل فقط على متوسط ​​مدة الربط. لذلك ، قد تفسر آلية إعادة الربط سبب حدوث طفرة في فوسفات RTK التي يُتوقع أن ترتبط على وجه التحديد بمجالات SH2 معينة ، وكان لها تأثير ضئيل نسبيًا على إشارات المصب. كان فقط عندما تم القضاء على جميع المواقع وإضافة الفسفوسات الفردية مرة أخرى ، يمكن ملاحظة تأثيرات محددة على إشارات المصب (28 ، 29).

أخيرًا ، تؤكد هذه النتائج على أهمية تجميع المستقبلات ، حيث يعتمد التثبيت الحركي لتفاعل SH2 / p-Tyr على الكثافة المحلية العالية للمواقع الفسفرة. قد يؤثر تجميع المستقبلات بشكل أكبر على النتيجة النهائية لعملية التشوير (30). على سبيل المثال ، تم اقتراح (31) أنه في الخلايا التائية ، يقوم ارتباط الترابط / مستقبلات طويلة الأمد بقمع & # x0201cnoise & # x0201d من تنشيط المستقبل العرضي (آلية تصحيح التجارب الحركية). بطريقة مماثلة ، قد يعمل البروتين SH2 المتزايد وقتًا بالقرب من غشاء الخلية ، إلى جانب معدلات إزالة الفسفرة العالية في الجسم الحي (26) ، على تخفيف الضوضاء الزائفة المرتبطة بالارتباط غير المحدد لبروتينات SH2 بجزيئات الغشاء. أخيرًا ، نظرًا لأن بروتينات SH2 المعينة لا ترتبط بموقع p-Tyr واحد فقط ، ولكن بدلاً من ذلك & # x0201cglide & # x0201d على العديد من مواقع p-Tyr ، فإن التفاعل الكيميائي لبروتين SH2 مع الركيزة النهائية أو جزيئات المستجيب في غشاء الخلية قد لا تتبع قوانين حركية كيميائية بسيطة. يجب أن تكون تفاصيل هذه التفاعلات موضوعًا مثيرًا للاهتمام للبحث في المستقبل.


مراجع

Yoshida ، M. ، Muneyuki ، E. & amp Hisabori ، T. ATP synthase - محرك رائع للخلية. نات ريف مول سيل بيول 2 ، 669-77 (2001).

Junge، W.، Sielaff، H. & amp Engelbrecht، S. توليد عزم الدوران ونقل الطاقة المرنة في قاعدة FoF1-ATPase الدوارة. Nature 459 ، 364–70 (2009).

ويبر ، ج.البيولوجيا الهيكلية: نحو آلية سينسيز ATP. نات تشيم بيول 6 ، 794-5 (2010).

Dimroth ، P. ، von Ballmoos ، C. & amp Meier ، T. الدورات التحفيزية والميكانيكية في تركيبات F-ATP. الرابع في سلسلة مراجعة الدورات. ممثل EMBO 7 ، 276–82 (2006).

Abrahams، J.P، Leslie، A.G، Lutter، R. & amp Walker، J.E Structure at 2.8 Resolution of F1-ATPase from vine heart mitochondria. Nature 370 ، 621–8 (1994).

Cingolani ، G. & amp Duncan ، T.M. هيكل المركب الحفاز سينسيز ATP (F1) من الإشريكية القولونية في شكل منع ذاتي. نات ستراكت مول بيول 18 ، 701-7 (2011).

Kabaleeswaran، V.، Puri، N.، Walker، J. E.، Leslie، A.G & amp Mueller، D. M. EMBO J 25 ، 5433–42 (2006).

Noji، H.، Yasuda، R.، Yoshida، M. & amp Kinosita، K.، Jr المراقبة المباشرة لدوران قاعدة F1-ATPase. Nature 386 ، 299-302 (1997).

سيلاف ، هـ وآخرون. التوافق مع المجال ونقل الطاقة المرن في قاعدة FoF1-ATPase الدوارة. بروك ناتل أكاد سسي يو إس إيه 105 ، 17760-5 (2008).

سبيتزلر ، د. وآخرون. تكشف قياسات الجزيء الفردي لـ F1-ATPase عن وجود علاقة متبادلة بين قوة السكتة الدماغية ومدة السكون. الكيمياء الحيوية 48 ، 7979-85 (2009).

Yasuda، R.، Noji، H.، Kinosita، K.، Jr & amp Yoshida، M. F1-ATPase هو محرك جزيئي عالي الكفاءة يدور بخطوات منفصلة 120 درجة. الخلية 93 ، 1117-24 (1998).

Cherepanov، D.A & amp Junge، W. ديناميات اللزوجة المرنة لخيوط الأكتين المقترنة بقاعدة F-ATPase الدوارة: الانحناء كمؤشر على عزم الدوران. Biophys J 81 ، 1234-44 (2001).

بيليارد ، تي وآخرون. توصيف جزيء واحد عالي الدقة للحالات الأنزيمية في Escherichia coli F1-ATPase. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 368، 20120023 (2013).

توياب ، س وآخرون. علم الطاقة بدون توازن لجزيء F1-ATPase واحد. فيز ريف ليت 104 (2010).

Watanabe، R.، Iino، R. & amp Noji، H. إطلاق الفوسفات في الدورة التحفيزية F1-ATPase يتبع إطلاق ADP. نات شيم بيول 6 ، 814-820 (2010).

شيمو كون ، ر. وآخرون. تم الكشف عن اقتران كيميائي ميكانيكي في F1-ATPase بواسطة شغل الموقع التحفيزي أثناء التحفيز. Biophys J 98 ، 1227–36 (2010).

Rees، D. M.، Montgomery، M.G، Leslie، A.G & amp Walker، J.E. دليل هيكلي على وسيط محفز جديد في مسار التحلل المائي لـ ATP بواسطة F1-ATPase من ميتوكوندريا القلب البقري. Proc Natl Acad Sci U S A 109 ، 11139–43 (2012).

أريجا ، ت ، مونيوكي ، إي ، يوشيدا ، م. نات ستراكت مول بيول 14 ، 841-6 (2007).

Yasuda، R.، Noji، H.، Yoshida، M.، Kinosita، K.، Jr & amp Itoh، H. تحليل الخطوات الفرعية الدورانية المتميزة عن طريق التحليل الحركي دون ملي ثانية لقاعدة F1-ATPase. Nature 410 ، 898-904 (2001).

شيمابوكورو ، ك وآخرون. التحفيز والدوران للمحرك F1: يحدث انقسام لـ ATP في الموقع التحفيزي في 1 مللي ثانية قبل دوران 40 درجة. Proc Natl Acad Sci U S A 100 ، 14731-6 (2003).

نيشيزاكا ، ت. وآخرون. تم الكشف عن اقتران ميكانيكي كيميائي في F1-ATPase من خلال المراقبة المتزامنة لحركية النيوكليوتيدات والدوران. نات ستراكت مول بيول 11 ، 142-8 (2004).

أداتشي ، ك وآخرون. تم الكشف عن اقتران الدوران والحفز في F1-ATPase بواسطة التصوير أحادي الجزيء والمعالجة. الخلية 130 ، 309-21 (2007).

Martin ، J.L ، Ishmukhametov ، R. ، Hornung ، T. ، Ahmad ، Z. & amp Frasch ، W. D. تشريح دوران F1-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A 111 ، 3715-20 (2014).

Adachi ، K. ، Oiwa ، K. ، Yoshida ، M. ، Nishizaka ، T. & amp Kinosita ، K. يكشف الدوران المتحكم فيه لـ F1-ATPase عن تغييرات الربط التفاضلية والمستمرة لتخليق ATP. نات كومون 3 (2012).

Watanabe ، R. ، Iino ، R. ، Shimabukuro ، K. ، Yoshida ، M. & amp Noji ، H. وسيط التفاعل الحساس لدرجة الحرارة لـ F1-ATPase. ممثل EMBO 9 ، 84-90 (2008).

Enoki، S.، Watanabe، R.، Iino، R. & amp Noji، H. دراسة جزيء واحد عن التفاعل الحساس لدرجة الحرارة لقاعدة F1-ATPase مع F1 الهجين يحمل مفردة β (E190D). جي بيول كيم 284 ، 23169–76 (2009).

Shimabukuro، K.، Muneyuki، E. & amp Yoshida، M. مسار تفاعل بديل لـ F1-ATPase يُقترح بالدوران بدون خطوات جزئية 80 درجة / 40 درجة لطفرة بطيئة عند انخفاض ATP. Biophys J 90 ، 1028-1032 (2006).

Ohtsubo ، M. وآخرون. في وحدات بيتا متحولة في المختبر من F1-ATPase للبكتيريا المحبة للحرارة ، PS3 ، التي تحتوي على الجلوتامين بدلاً من حمض الجلوتاميك في المواضع 190 أو 201 تتجمع مع وحدتي ألفا وجاما الفرعية لإنتاج مجمعات غير نشطة. Biochem Biophys Res Commun 146 ، 705-10 (1987).

Park ، MY ، Omote ، H. ، Maeda ، M. & amp Futai ، M. بقايا beta Glu-161 و beta Lys-201. J Biochem 116 ، 1139-45 (1994).

سنيور ، أ. إ. وأمبير الشاوي ، M. ك. مزيد من الفحوصات لسبعة عشر طفرة في الوحدة الفرعية بيتا الإشريكية القولونية F1-ATPase. جي بيول كيم 267 ، 21471–8 (1992).

واتانابي ، آر وآخرون. التعديل الميكانيكي للقدرة التحفيزية على F1-ATPase. نات شيم بيول 8 ، 86-92 (2012).

Watanabe، R. & amp Noji، H. آلية الاقتران الكيميائي الميكانيكي لـ F1-ATPase: التحفيز وتوليد عزم الدوران. FEBS Lett 587 ، 1030-5 (2013).

Masaike ، T. ، Koyama-Horibe ، F. ، Oiwa ، K. ، Yoshida ، M. & amp Nishizaka ، T.ترتبط الحركات التعاونية المكونة من ثلاث خطوات في الوحدات الفرعية التحفيزية لـ F1-ATPase بـ 80 درجة و 40 درجة من الدورات الفرعية. نات ستراكت مول بيول 15 ، 1326-1333 (2008).

تانيجاوارا ، إم وآخرون. دور الحلقة DELSEED في نقل عزم الدوران لقاعدة F1-ATPase. Biophys J 103 ، 970–8 (2012).

Usukura ، إي وآخرون. توليد عزم الدوران واستخدامه في إنزيم المحرك FoF1-ATP Synthase بنصف عزم الدوران F1 مع حلزون دفع قصير الحجم وتقليل تخليق ATP بمقدار نصف عزم الدوران FoF1. جي بيول كيم 287 ، 1884 - 1891 (2012).

Okuno، D.، Iino، R. & amp Noji، H. صلابة وحدة جاما الفرعية لقاعدة F1-ATPase. Eur Biophys J 39 ، 1589–96 (2010).


تؤدي عمليات التصنيع المعتمدة على الوقت إلى فئة جديدة من المشكلات العكسية

تم تحقيق التحكم في عمليات تصنيع حزمة الطاقة المعتمدة على الوقت في الماضي من خلال نهج التجربة والخطأ. نحدد الثغرات البحثية الرئيسية والتحديات العامة المتعلقة بالمشاكل العكسية لهذه العمليات التي تتطلب نهجًا متعدد التخصصات لحل المشكلات لمعالجتها. المشاكل العامة التي نحددها لها مجموعة واسعة من التطبيقات في التحكم الحسابي في عمليات التصنيع الحديثة.

منذ آلاف السنين ، كانت الطريقة الرئيسية لتصنيع الأشياء هي استخدام الأدوات الصلبة المصممة لوظيفة معينة. يعتبر مبدأ التشكيل الأكثر شيوعًا بسيطًا: حرك أداة صلبة بحيث تتم إزالة المواد من قطعة العمل ، وفقًا لبعض المبادئ الميكانيكية. وبالتالي ، هناك تبعية هندسية مباشرة بين حركة الأداة وشكل الكائن الذي تم إنشاؤه. حتى الأدوات الآلية المتطورة والتي يتم التحكم فيها رقميًا تستخدم هذا المبدأ الأساسي.

عمليات التصنيع الأخرى التي تستخدم أدوات ، هندسيًا ، لم يتم تحديدها بشكل كامل (أي الأدوات المعتمدة على الوقت) قد شقت طريقها أيضًا إلى خطوط الإنتاج. في هذه العمليات ، تأخذ الأداة شكل تدفق الطاقة المنبثقة من مصدر (مثل الليزر ، ومدفع الأيونات ، ونفث السوائل) ، والتي سوف نسميها عمليات حزمة الطاقة (EBPs). يمكن استخدام هذه الأدوات التي تعتمد على الوقت لتشكيل المواد التي لا يمكن معالجتها بدقة باستخدام الطرق التقليدية. على عكس الأدوات التقليدية ، فإن شكل وحجم آثار أقدام EBP (معدل إزالة / ترسيب المواد و / أو معدل تحويل المواد عند التقاطع بين الحزمة وقطعة العمل) لا يعتمدان فقط على مسار الأداة ولكن أيضًا على وقت التعرض وتدفق الطاقة. علاوة على ذلك ، يعتمد تدفق الطاقة على هندسة الحزمة ، والتي تختلف باختلاف إعداد العملية (على سبيل المثال ، فقد الطاقة بين المصدر والهدف). وبالتالي ، فإن التحكم في الأدوات المعتمدة على الوقت لتوليد الأشكال الحرة أمر صعب للغاية مقارنة بالعمليات التي تستخدم أدوات تقليدية مستقلة عن الوقت. لعمل أجزاء باستخدام EBPs ، تتحرك الحزمة على طول مسار محدد مسبقًا لتلويث بصمة الطاقة بقطعة العمل ، وأي اختلافات في وقت الثبات في البصمة ينتج عنها أخطاء في هندسة الجزء. لاحظ أن البصمة عادة ما تكون غير موحدة من الناحية المكانية وتتغير مع الاتجاه إلى السطح المستهدف.

إن اتخاذ مسار أداة محدد مسبقًا والتنبؤ بالسطح الناتج هو المشكلة المباشرة في EBPs ، والتي تم توثيقها على نطاق واسع ، وعادة ما يتم دمجها مع التجربة والخطأ لتحقيق الهندسة المطلوبة. ومع ذلك ، فإن التحدي الحقيقي ، والنهج الصحيح ، هو معالجة المشكلة العكسية - أي بالنسبة لجزء معين من الهندسة ، لتحديد المسار الذي يقلل من الأخطاء في إنشائه باستخدام خوارزمية التحسين. تم إجراء أبحاث محدودة للغاية في هذا المجال.

هدفنا هنا هو نشر هذه الفرصة للمجتمع العلمي الأوسع لدراسة مجموعة جديدة من المشاكل الصعبة ، والتي تتطلب نهجًا متعدد التخصصات. نعتقد أن نقص البحث حول هذه المشاكل العكسية يرجع إلى صعوبة صياغة المشكلة المباشرة بدقة لمراعاة الاعتماد الزمني لبصمة الطاقة وتأثيرها على مادة قطعة العمل وبالتالي معالجة المشكلة العكسية.

على الرغم من أن المشاكل العكسية في الهندسة العامة (على سبيل المثال ، نقل الحرارة ، الصوتيات) قد تم استكشافها جيدًا ، إلا أن تلك المتعلقة بعمليات التصنيع المعتمدة على الوقت هي جديدة لأنها تنطوي على تحسين الحركات المتعددة لمصدر الطاقة بالنسبة لشغل الشغل المستهدف. ومع ذلك ، كان هناك بعض التقدم في الآونة الأخيرة. على سبيل المثال ، في صناعة الآلات الدقيقة النفاثة الكاشطة ، درس لاري وبابيني (1) المسألة العكسية كحل لمعادلة متكاملة (انظر أيضًا المرجع 2) لتحديد سرعة التغذية لتوليد أشكال دورية ضحلة وعلى شكل حرف W بناءً على تداخل المسارات المستقيمة لبصمة شعاع غاوسي. بالنسبة لآثار الأقدام غير الغوسية ، تم استخدام طريقة تقريب تعتمد على نمذجة الحزمة كمصدر نقطي. في حفر البلازما في الغلاف الجوي ، داي وآخرون. (3) تعامل مع الاعتماد غير الخطي لمعدل إزالة المواد على وقت السكون من خلال التفكير في طريقة تكرارية نبضية متداخلة لتقييم وتصحيح اللاخطية المتغيرة بمرور الوقت للعملية وتمكين تشكيل هندسة الجيب في السيليكا المنصهرة. في التسطيح البصري ، أظهر Beaucamp وزملاؤه (4) كيف يمكن استخدام استراتيجيات التخطيط الذاتي لمسار الملعب المتغير ، المدعومة بنموذج خطي بسيط لإزالة المواد ، لتحسين توحيد السطح المصقول. في معالجة الحزمة الأيونية ، يتضمن الحل التقريبي للمشكلة العكسية تغيير وقت استقرار الحزمة على كل بكسل من السطح المطلوب (5). ومع ذلك ، فإن هذا لا يأخذ في الاعتبار التأثيرات غير الخطية ، وعلى الرغم من أنها استراتيجية بداية معقولة ، بالنسبة إلى EBP هذا ، فقد أوضحنا (6) كيف يمكن أن يؤدي حل المشكلة العكسية لنموذج أكثر تعقيدًا باستخدام خوارزمية أصل حاد إلى تحسين دقة النقش الحر باستخدام هذه الأداة.

في السنوات القليلة الماضية ، حددنا سلسلة من المشكلات المباشرة والعكسية لعمليات تصنيع شعاع الطاقة ، بدءًا من المعالجة بنفث الماء الكاشطة والعادي (2) إلى التصنيع الميكروي بالليزر (7) وتصنيع الحزمة الأيونية المركزة (6) ، الوصف الوارد في المرجع. 8. إذا حددنا سطح قطعة العمل ليكون r = R (α ، β ، t) ، حيث تحدد α و السطح و t الوقت ، فإن معادلة التطور للسطح تحت تأثير الحزمة هي n · d R dt = (n. k) E ، حيث n (α ، β ، t) هي الوحدة الخارجية العادية للسطح ، k (t) متجه وحدة في اتجاه محور الحزمة ، E (r ، θ ، t ، R p) هو معدل إزالة المواد ، r و موضع تحديد المعلمات داخل الحزمة ، و p متجه للمعلمات التي تميز ديناميكيات كيفية توصيل الطاقة بواسطة الحزمة. يجب حل معادلة التطور وفقًا لـ r = R 0 عندما يكون t = 0 لـ 0 & lt t & lt T.

في المشكلة المباشرة ، معلمات التحكم ، p (مسار الحزمة ، الاتجاه ، وربما معدل خرج الطاقة ووقت العملية ، تي) ، والسطح النهائي ، R (α ، β ، T) ، الذي سيتم ملاحظته في الممارسة ، يتم حسابه.

في المسألة العكسية ، نبحث عن معلمات ، p ، تقلل من ‖ R (α ، β ، T) - R 1 (α ، β) ‖ ، حيث تحدد R 1 (α ، β) السطح المستهدف المراد إنشاؤه و ‖. ‖ معيار مناسب (مجموع مرجح به تي يمكن استخدامها لتقليل وقت العملية). في نموذج بسيط مثل هذا ، يتم تجميع جميع الفيزياء في دالة معدل إزالة المواد ، E (r ، θ ، t ، R p).

مشاكل مثل هذه تكمن في الفئة الواسعة من التحسين المقيد للمعادلة التفاضلية الجزئية. على الرغم من أن هذا مجال بحثي واسع ، إلا أن استخدام التقنيات من هذا المجال في هندسة التصنيع ليس شائعًا. نحن لا نناقش تأثير ضوضاء العملية ونصوغ النموذج من حيث المعادلة التفاضلية الجزئية ، لكن نلاحظ أن نمذجة إزالة المواد كعملية عشوائية تجعل المشكلات المباشرة والعكسية أكثر تحديًا رياضيًا وهي مجال يمكن أن يستفيد من مزيد من التطوير ( 9).

بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا صياغة مجموعة من المشاكل الجديدة التي تقدم مجموعة واسعة من التحديات ، وتتطلب نهجًا متعدد التخصصات ، وتتجاوز بكثير عمليات الإزالة والتراكم. فيما يلي تصنيف بسيط وقائمة غير حصرية لعمليات التصنيع التي تستخدم أدوات تعتمد على الوقت وتتطلب النظر في المشكلات العكسية المرتبطة بها (الشكل 1):

• إزالة المواد: المعالجة الآلية عن طريق شعاع الليزر ، ونفث الماء الكاشطة / نسف الهواء ، وحزمة الأيونات المركزة ، وشعاع الإلكترون ، والنفث الكهربائي ، والتفريغ الكهربائي ، والموجات فوق الصوتية

تختلف مبادئ إزالة المواد اختلافًا كبيرًا (التبخر ، والتآكل الميكانيكي ، ونقل زخم الجسيمات ، والذوبان الكيميائي ، والتآكل بالشرارة) ولكنها تشترك في آثار إزالة شعاع الطاقة مع خصائص في الشكل والسلوك (على سبيل المثال ، إعادة ترسيب الذوبان ، وتشوه البلاستيك ، وفقدان الطاقة بسبب الانعكاس / الامتصاص).

• تعديل المادة / السطح: ثقب بالرصاص ميكانيكيًا أو بالليزر ، تلميع بالليزر ، معالجة حرارية موضعية / انتقائية

لا تتم إضافة أو إزالة أي مادة ، ولكن حزمة الطاقة تعدل الخصائص (السطحية عادةً) لقطعة العمل بوسائل ميكانيكية أو حرارية لتغيير الخواص الميكانيكية (مثل الصلابة والضغوط المتبقية) أو المكونات الهيكلية الدقيقة للجزء.

• تراكم المواد: الترسيب المباشر للمعادن ، الطلاء بالرش ، الترسيب المنصهر

ترسب حزمة الطاقة مواد متشابهة أو غير متشابهة على قطعة العمل ، وترتبط المبادئ بشكل أساسي بنقل الطاقة إلى الجسيمات الفردية التي تتفاعل مع المادة الأساسية من خلال آليات فيزيائية مختلفة (على سبيل المثال ، نقل الكتلة والحرارة و / أو الزخم) والنتائج في آثار أقدام الترسيب التي تتأثر بالتأثيرات الثانوية الخاصة بالعملية (على سبيل المثال ، الجسيمات غير اللاصقة ، مسامية المادة المترسبة).

• تجميع المواد: التلبيد الانتقائي بالليزر ، ذوبان شعاع الإلكترون

هذه مجموعة عامة من عمليات التصنيع المضافة لطبقة المسحوق حيث يتسبب شعاع الطاقة في التوحيد المحلي لمجموعات الجسيمات. تتأثر كل عملية بوقت السكون وتوزيع الطاقة للحزمة وتؤدي إلى خصائص هيكلية دقيقة وميكانيكية فريدة للمكون المتولد.

• العمليات الهجينة: الليزر / بالموجات فوق الصوتية / البلازما

يتم استخدام حزمة الطاقة بالاقتران مع عملية أخرى يمكن أن تكون غير معتمدة على الوقت (مثل القطع) أو تعتمد على الوقت (على سبيل المثال ، معالجة التفريغ الكهربائي). يتم وضع شعاع الطاقة إما أمام أو بالضبط في الموضع الذي تحدث فيه العملية الرئيسية. الهدف هو تعزيز عملية الإزالة الأساسية. في حالة وجود عمليتين متقاربتين في وقت السكون تحكمهما ظواهر مختلفة ، فإن حل المشكلة العكسية المرتبطة بها يمثل تحديًا بشكل خاص.

تصنيف مكثف لـ EBPs للنمذجة العكسية.

كمثال على عملية هجينة ، أظهرنا مؤخرًا (10) أنه باستخدام مسح شعاع الليزر قبل أداة الطحن على المسار الذي تم الحصول عليه عن طريق حل المشكلة العكسية ، يمكن تقليل قوى القطع بحوالي 50٪. هذا يتيح زيادة كبيرة في معدل إزالة المواد.

في كل من الأمثلة المذكورة أعلاه ، يجب تحديد معلمات حزمة الطاقة بطريقة عكسية لتحقيق نتائج العملية المطلوبة. من المرجح أن تُحدث دراسة هذه المجموعات من المشكلات العكسية ثورة في طريقة تخطيط EBPs والتحكم فيها ، مما يلغي نهج "الحرفية". على وجه الخصوص ، من المحتمل أن تظهر الحزم المصممة خصيصًا للعمليات المعتمدة على الوقت لتحل محل الاستخدام الحالي لأنظمة التصميم / التصنيع بمساعدة الكمبيوتر ، والتي تم تصميمها لأدوات الآلات التقليدية وغير مناسبة للغرض.


لدينا مجموعة من مواقع المستخدمين في الوقت الفعلي من تطبيقنا. يحتوي كل سجل على خط الطول وخط العرض والوقت الذي تم فيه التقاط الموقع الجغرافي. كيف يمكنني حساب وقت الإقامة في مكان ثابت للمستخدم من هذه البيانات؟

أشياء للإعتبار عند التجميع البيانات:

إذا كنت تستخدم مكتبة مثل: reaction-native-mauron85-background-geolocation والإطار الأيوني ، فستقوم بتعيين ثابتة لتحديد المنطقة التي يعتبر فيها الجهاز الذي يبلغ عن موقعه ثابتًا.

عندما تكون هناك عوائق وأسطح عاكسة فمن المحتمل استقبال متعدد المسارات. تصل الإشارات إلى جهاز الاستقبال في أوقات مختلفة قليلاً ، واعتمادًا على الإشارة التي يختار المستقبِل تصديقها لأي عينة معينة ، تختلف المسافة من القمر الصناعي أيضًا. قم بضرب هذا السلوك في عدة أقمار صناعية ، ثم عامله في حساب الموقع الكلي ، والنتيجة الصافية هي أن المستقبل يدرك التحولات المفاجئة في الموضع. في بعض الأحيان يمكن أن تكون هذه كبيرة - لنقل 40 أو 50 قدمًا.

يحاول برنامج المستوى الأعلى في جهاز الاستقبال تسهيل هذا الأمر. بشكل عام ، يقوم بعمل أفضل عندما يتحرك المتعقب. هذا لأن التغيير الحقيقي في الموضع لكل وحدة زمنية أكبر بكثير من التحولات العشوائية الناتجة عن الاستقبال متعدد المسارات.

يمكنك متوسط ​​الموضع الذي تم الإبلاغ عنه خلال فترة زمنية للحصول على دائرة من المحتمل أن يكون الجهاز ضمنها. يمكن أن يوفر استخدام المعلومات الثانوية مثل عنوان IP وتحديد المواقع عبر WiFi معلومات إضافية لتضييق نطاق خمن أسرع. راجع أيضًا: التقنيات اللاسلكية.

إليك مثال يوضح لك المكان الذي تستخدم فيه واجهة برمجة تطبيقات تحديد الموقع الجغرافي من Mozilla ، انقر فوق "مثال مباشر للموقع الجغرافي" ومنح الإذن لمشاركة موقعك (ليس معنا في SE ، مع Mozilla).

بمجرد حصولك على بيانات دقيقة إلى حد ما ، فإن الأمر ببساطة يتعلق بتحديد نصف القطر والحد الأدنى من وقت السكون (والذي سيكون متوسطًا متحركًا).

إذا كانوا يتحركون بسرعة ، فإن الإقامة الأقصر هي مسكن ، بينما في حالة سرعة أبطأ ، لن يحدث المسكن حتى فترة زمنية أطول.

النمذجة الرياضية المتقدمة ضرورية لتحليل نتيجة أفضل وعدم الخلط بين التعرج والتراجع.


الملخص

يعد التحليل الطيفي بقوة المشبك تقنية جديدة لدراسة الكيمياء الميكانيكية على مستوى الرابطة الواحدة. يتم اكتشاف أحداث اختزال رابطة ثاني كبريتيد الأحادية بدقة كزيادات تدريجية في طول البروتينات المتعددة التي تحتوي على روابط ثاني كبريتيد والتي يتم شدها بقوة ثابتة باستخدام ناتئ مجهر القوة الذرية (AFM). تم قياس حركية هذا التفاعل من نوبات أسية مفردة لتجميع متوسطات أحداث الاختزال. ومع ذلك ، فإن النوبات الأسية غامضة بشكل ملحوظ لاستخدامها في حالات البيانات الحركية التي تُظهر مسارات تفاعل متعددة. نقدم هنا تقنية تحليل وقت السكون ، ذات الاستخدام الواسع في مجال القناة الأيونية المفردة ، والتي نطبقها لفحص حركية اختزال روابط ثاني كبريتيد المقاسة من آثار التحليل الطيفي للقوة المشبكية أحادية الجزيء. في هذه التقنية ، يتم رسم بيانات وقت السكون الموزعة أسيًا كرسم بياني بمقياس زمني لوغاريتمي وإحداثيات جذر تربيعي. تتمثل ميزة الرسوم البيانية اللوغاريتمية في أن أوقات السكون الموزعة بشكل كبير تظهر على أنها قمم محددة جيدًا في التوزيع ، مما يعزز بشكل كبير قدرتنا على اكتشاف مسارات حركية متعددة. نطبق هذه التقنية لفحص توزيع أوقات السكون لـ 4488 أحداث اختزال رابطة ثنائي كبريتيد مفردة المقاسة في وجود نوعين مختلفين جدًا من عوامل الاختزال: تريس- (2-كربوكسي إيثيل) هيدروكلوريد الفوسفين (TCEP) وإنزيم ثيوردوكسين (TRX) . يتم استخدام قوة لقط مختلفة لكل عامل اختزال للحصول على توزيعات لأوقات السكون على نطاق زمني مماثل. في حالة TCEP ، أظهر الرسم البياني اللوغاريتمي لأوقات السكون ذروة واحدة ، تقابل آلية تفاعل واحدة. على النقيض من ذلك ، أظهرت التجارب المماثلة التي أجريت مع TRX قمتين منفصلتين جيدًا ، مما يشير إلى وضعين متميزين للاختزال الكيميائي يعملان في وقت واحد. توضح هذه التجارب أن تقنيات تحليل الوقت المكوث هي نهج قوي لدراسة التفاعلات الكيميائية على مستوى الجزيء المفرد.


شاهد الفيديو: شرح Many, Much, few, little, a lot of, some في اللغه الانجليزيه (ديسمبر 2022).