معلومة

دراسات الإسفار - علم الأحياء

دراسات الإسفار - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

1. Noboru Mataga ، Haik Chosrowjan ، Seiji Taniguchi ، التحقيقات في ديناميكيات وآليات التفاعلات الضوئية فائقة السرعة التي تحدث في فضاءات نانوية البروتينات الضوئية (PNS) ، مجلة الكيمياء الضوئية والبيولوجيا الضوئية C: مراجعات الكيمياء الضوئية ، المجلد 5 ، العدد 2 ، 15 أكتوبر 2004

2. الاهتزازات منخفضة التردد ودورها في ديناميكيات تفاعل التماثل الضوئي فائق السرعة للبروتين الأصفر الفعال ضوئيًا هايك تشوسروجان ، † ، ‖ ، سيجي تانيجوتشي ، † ، نوبورو ماتاغا ، * ، † ، ماساشي أونو ، ، ، سيجو ياموتشي ، ‡ ، نوريو هامادا ، § ، ماساتو كوماوتشي ، § ، وفوميو توكوناجا § مجلة الكيمياء الفيزيائية ب 2004 108 (8) ، 2686-2698 DOI: 10.1021 / jp031126w

3. التأثيرات البيئية على ديناميكيات الفيمتو ثانية − بيكو ثانية مضان للبروتين الأصفر النشط ضوئيًا: الكروموفورات في المحاليل المائية وفي فضاءات البروتين النانوية المعدلة بواسطة الطفرات الموجهة بالموقع Haik Chosrowjan و Noboru Mataga * و Yutaka Shibata و Yasushi Imamoto و Fumio Tokunaga * مجلة الكيمياء الفيزيائية ب 1998 102 (40) ، 7695-7698 DOI: 10.1021 / jp982905t

4. آثار تعديل بنية البروتين النانوي وتغير درجة الحرارة على الفيمتو ثانية إلى بيكو ثانية ديناميكيات الإسفار للبروتين الأصفر النشط ضوئيًا ، نوبورو ماتاغا ، * ، هايك تشوسروجان ، ويوتاكا شيباتا ، ياسوشي إماموتو ، وفوميو توكوناجا مجلة الكيمياء الفيزيائية ب 2000 104 (21) ، 5191-5199 DOI: 10.1021 / jp994205 +


دراسات الإسفار - علم الأحياء

أدى اكتشاف وتطوير البروتينات الفلورية من مجموعة واسعة من الكائنات البحرية على مدى العقد الماضي إلى ثورة في دراسة سلوك الخلية من خلال توفير علامات ملائمة للتعبير الجيني واستهداف البروتين في الخلايا والكائنات الحية. أكثر هذه البروتينات الفلورية استخدامًا على نطاق واسع ، وهو بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) المعزول لأول مرة من قنديل البحر Aequorea victoria ، يمكن ربطه فعليًا بأي بروتين مهم ولا يزال يتم طيه في جزيء الفلورسنت. يمكن استخدام منتج الاندماج GFP الناتج لتوطين البروتينات غير المعهودة سابقًا أو لتصور البروتينات المعروفة وتتبعها لفهم الأحداث الخلوية بشكل أكبر. تم تحفيز استخدام البروتينات الفلورية كأداة طفيفة التوغل لدراسة ديناميات البروتين ووظيفته من خلال هندسة المتغيرات الجينية مع تحسين السطوع والثبات الضوئي وخصائص التعبير (انظر الشكل 1). يمكن تصوير الخلايا التي تعبر عن المنتجات الجينية الموسومة ببروتينات الفلورسنت بكثافة إضاءة منخفضة على مدى عدة ساعات لتوفير معلومات مفيدة حول التغيرات في توزيع الحالة المستقرة للبروتين بمرور الوقت.

مقدمة للبروتينات الفلورية - أدى اكتشاف البروتين الفلوري الأخضر في أوائل الستينيات من القرن الماضي في النهاية إلى عصر جديد في بيولوجيا الخلية من خلال تمكين الباحثين من تطبيق طرق الاستنساخ الجزيئي ، ودمج جزء الفلوروفور في مجموعة متنوعة من أهداف البروتين والإنزيم ، من أجل المراقبة العمليات الخلوية في الأنظمة الحية باستخدام المجهر الضوئي والمنهجية ذات الصلة. عند اقترانه بالتطورات التقنية الحديثة في التألق واسع النطاق والفحص المجهري متحد البؤر ، بما في ذلك الكاميرات الرقمية فائقة السرعة ذات الإضاءة المنخفضة وأنظمة التحكم بالليزر متعددة المسارات ، أظهر البروتين الفلوري الأخضر ومشتقاته الوراثية المتغيرة الألوان خدمة لا تقدر بثمن في عدة آلاف من تجارب التصوير بالخلايا الحية .

لوحة ألوان البروتين الفلوريسنت - تم تطوير مجموعة واسعة من المتغيرات الجينية للبروتين الفلوري على مدى السنوات العديدة الماضية والتي تتميز بملفات طيفية لانبعاث الفلورسنت تغطي طيف الضوء المرئي بأكمله تقريبًا. أدت جهود الطفرات المكثفة في بروتين قنديل البحر الأصلي إلى تحقيقات فلورية جديدة تتراوح في اللون من الأزرق إلى الأصفر وهي من أكثر جزيئات المراسل المستخدمة على نطاق واسع في الأبحاث البيولوجية. تم تطوير البروتينات الفلورية ذات الطول الموجي الأطول ، التي تنبعث في المناطق الطيفية البرتقالية والحمراء ، من شقائق النعمان البحرية Discosoma striata والشعاب المرجانية التي تنتمي إلى فئة Anthozoa. لا يزال تم تعدين أنواع أخرى لإنتاج بروتينات مماثلة لها انبعاث مضان سماوي وأخضر وأصفر وبرتقالي وأحمر وأحمر بعيد. جهود البحث التنموي جارية لتحسين سطوع واستقرار البروتينات الفلورية ، وبالتالي تحسين فائدتها الإجمالية.

البروتينات الفلورية المشتقة من Aequorea victoria - في العقد الماضي فقط شهدنا توسعًا ملحوظًا حقًا في لوحة البروتينات الفلورية المستندة إلى Aequorea ، مدفوعة إلى حد كبير بالدراسات المبتكرة من مختبر Roger Tsien. لدينا الآن بروتينات قنديل البحر التي تمتد على جزء 80 نانومتر من الطيف المرئي من الأزرق الغامق إلى الأصفر والأخضر ، مما يوفر مجموعة واسعة من العلامات المشفرة وراثيا للدراسات في بيولوجيا الخلية. تم تعديل معظم البروتينات الفلورية المستخدمة بشكل شائع اليوم من خلال الطفرات لتحسين تعبيرها في الأنظمة البيولوجية. ستعمل الجهود المستمرة باستخدام مناهج التطور الموجه بلا شك على تحسين الخصائص الطيفية ، والاستقرار الضوئي ، ووقت النضج ، والسطوع ، ومقاومة الأحماض ، وفائدة علامات البروتين الفلوريسنت للتصوير الخلوي.

بروتينات الأنثوزوا الفلورية - على الرغم من توفر المرشحين الواعدين الآن في كل فئة طيفية لبروتين الأنثوزوا الفلوري ، في معظم الحالات لا يوجد مكافئ لـ EGFP ، من حيث الثبات الضوئي ومجالات الأداء المهمة الأخرى (باستثناء استقرار الأس الهيدروجيني). تتميز الإضافات الجديدة إلى المنطقة الزرقاء والسماوية بسطوع واستقرار ضوئي محسنين بشكل كبير ، وأي من البروتينات الفلورية البرتقالية هي خيارات ممتازة للتصوير متعدد الألوان طويل المدى. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الثبات الضوئي أكثر إشراقًا من EGFP ، إلا أنه لا يزال دون المستوى الأمثل بالنسبة للبروتينات الفلورية الصفراء ، في حين أن المتغيرات الحمراء والبعيدة الأحمر هي من بين الأكثر خافتة في جميع الفئات الطيفية. ومما يزيد المشكلة تعقيدًا هو احتمال وجود مصنوعات التجميع بسبب البروتينات الضعيفة القابلة للطي ، بغض النظر عن الطبقة الطيفية أو الخصائص الأحادية المفترضة. بالنظر إلى أن معظم هذه البروتينات قد تم إدخالها فقط في العامين الماضيين ، فإننا لا نزال متفائلين بأنه في المستقبل ، ستصبح الإضافات الساطعة والقابلة للضوء متاحة لجميع الفئات الطيفية.

معلمات التصوير للبروتينات الفلورية - الطيف الواسع من البروتينات الفلورية ومشتقاتها التي تم الكشف عنها حتى الآن متعددة الاستخدامات وقد تم استخدامها بنجاح في كل تخصص بيولوجي تقريبًا من علم الأحياء الدقيقة إلى فسيولوجيا الأنظمة. أثبتت هذه المجسات الفريدة أنها مفيدة للغاية كمراسلين لدراسات التعبير الجيني في كل من الخلايا المستنبتة والحيوانات بأكملها. في الخلايا الحية ، يتم استخدام البروتينات الفلورية بشكل شائع لتتبع توطين وديناميكيات البروتينات والعضيات والمقصورات الخلوية الأخرى ، بالإضافة إلى تتبع تهريب البروتين داخل الخلايا. يتم إنجاز التصوير الكمي للبروتينات الفلورية بسهولة باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات ، بما في ذلك الفحص المجهري واسع النطاق ، ومتحد البؤر ، ومتعدد الفوتون ، لتوفير نافذة فريدة لفضح تعقيدات البنية الخلوية والوظيفة.

البروتينات الفلورية الضوئية المضيئة - حوامل البروتين التي يمكن تنشيطها لبدء انبعاث مضان من حالة هادئة (عملية تعرف باسم التنشيط الضوئي) ، أو تكون قادرة على التحويل بصريًا من عرض نطاق انبعاث مضيء إلى آخر (تحويل ضوئي) ، ربما تمثل أكثر الأشياء الواعدة نهج للتحقيق في الجسم الحي لأعمار البروتين ، والنقل ، ومعدلات الدوران. تُعرف البروتينات الفلورية المُفعَّلة ضوئيًا بشكل مناسب بالمُظلات الجزيئية أو الضوئية بشكل عام القليل من التألق الأولي أو عدم وجوده على الإطلاق تحت الإثارة عند طول موجة التصوير ، ولكنها تزيد بشكل كبير من شدة التألق بعد التنشيط عن طريق التشعيع عند طول موجي مختلف (عادةً ما يكون أقل). من ناحية أخرى ، تخضع أدوات التظليل الضوئية للتحويل الضوئي لتغيير في ملف عرض النطاق الترددي للانبعاثات الفلورية عند حدوث تغييرات بصرية في حامل اللون. تؤدي هذه التأثيرات إلى تسليط الضوء المباشر والتحكم على التجمعات الجزيئية المتميزة داخل الخلية.

اعتبارات عملية لاستخدام البروتينات الفلورية - البروتينات الفلورية هي مجسات تصوير متعددة الاستخدامات وقد تم استخدامها بنجاح في كل تخصص بيولوجي تقريبًا بدءًا من علم الأحياء الدقيقة إلى فسيولوجيا الأنظمة. هذه المجسات المنتشرة في كل مكان مفيدة للغاية كمراسلين لدراسات التعبير الجيني في الخلايا المستنبتة والأنسجة المستأصلة والحيوانات الكاملة. في الخلايا الحية ، تُستخدم البروتينات الفلورية بشكل شائع لتتبع توطين وديناميكيات البروتينات والعضيات والمقصورات الخلوية الأخرى ، بينما يمكن استخدامها أيضًا لتقييم تفاعلات البروتين والبروتين من خلال استخدام تقنيات نقل طاقة الرنين (FRET). تقدم هذه المراجعة بعض النصائح العامة للجوانب العملية لاستخدام وتصوير البروتين الفلوري الأخضر المحسن (EGFP) والأعضاء الأحدث في لوحة الألوان.

دروس جافا التفاعلية

اختيار مجموعات المرشح للبروتينات الفلورية - يجب اختيار مجموعات مرشح التألق المصممة لتصوير البروتينات الفلورية بعناية لتعظيم مستوى شدة الانبعاث المقدمة للكاشف مع تقليل عدد الفوتونات غير المرغوب فيها في نفس الوقت من التألق الذاتي أو النزف من خلال الفلوروفورات الأخرى. توفر الملامح الطيفية للامتصاص والانبعاث التي تعرضها معظم البروتينات الفلورية مجموعة واسعة من الخيارات في المرشحات ، والتي عادة ما يتم تحسينها للاستخدام مع نظام كشف محدد (عين بشرية ، كاميرا رقمية ، أو مضخم ضوئي). تم تصميم هذا البرنامج التعليمي التفاعلي لتمكين تحديد معلمات المرشح الحرجة ، بما في ذلك الطول الموجي المركزي ومنطقة عرض النطاق الترددي وطول موجة قطع المرآة ثنائية اللون ، والتي تعد ضرورية لتصوير البروتينات الفلورية.

اختيار البروتينات الفلورية لتجارب العلامات المزدوجة - غالبًا ما تتطلب الإثارة الواسعة والملامح الطيفية للانبعاثات التي تظهرها البروتينات الفلورية ومتغيراتها الوراثية ذات الألوان المتغيرة اعتبارات متخصصة عند تصميم تجارب تصوير الخلايا الحية باستخدام اثنين أو أكثر من هذه المجسات الفريدة في وقت واحد. مصدر القلق الأساسي هو التحف المحتملة للنزف الناتجة عن درجة كبيرة من التداخل الطيفي للانبعاثات التي تظهر عادة بواسطة تركيبات البروتين الفلوري. يستكشف هذا البرنامج التعليمي التفاعلي مطابقة البروتينات الفلورية لتحقيقات وضع العلامات المزدوجة فيما يتعلق بعرض النطاق الترددي الطيفي والتداخل ، وكفاءة الإثارة ، وأبعاد نافذة الانبعاث ، والمعلمات الأخرى اللازمة لتصميم التجارب المنطقية.

نقل طاقة الرنين الفلوري مع البروتينات الفلورية - يتم تطبيق البروتينات الفلورية بشكل متزايد كمجسات غير غازية في الخلايا الحية نظرًا لقدرتها على الانصهار جينيًا إلى البروتينات ذات الأهمية لإجراء تحقيقات في التوطين والنقل والديناميكيات. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر الخصائص الطيفية للبروتينات الفلورية مثالية لقياس إمكانية التفاعلات الجزيئية داخل الخلايا باستخدام تقنية F rster (أو التألق) المجهري لنقل طاقة الرنين (FRET). نظرًا لأن نقل الطاقة يقتصر على مسافات تقل عن 10 نانومتر ، فإن اكتشاف FRET يوفر معلومات قيمة حول العلاقات المكانية لبروتينات الاندماج على مقياس الدقة الفرعية. يستكشف هذا البرنامج التعليمي التفاعلي مجموعات مختلفة من البروتينات الفلورية كشركاء محتملين لـ FRET ويوفر معلومات حول معلمات نقل طاقة الرنين الحرجة ، بالإضافة إلى اقتراحات لمرشح بصري مجهري وتكوين مصدر الضوء.

البروتينات الفلورية الضوئية المضيئة - تعرض البروتينات الفلورية المُفعَّلة ضوئيًا بشكل عام القليل من التألق الأولي أو عدم وجوده على الإطلاق تحت الإثارة عند طول موجة التصوير ، ولكنها تزيد بشكل كبير من شدة التألق بعد التنشيط عن طريق التشعيع عند طول موجي مختلف (أقل عادةً). من ناحية أخرى ، تخضع أدوات التظليل الضوئية للتحويل الضوئي لتغيير في ملف عرض النطاق الترددي لانبعاث التألق عند التغييرات التي تحدث بصريًا في حامل اللون. يستكشف هذا البرنامج التعليمي التفاعلي التحويل البصري للعديد من تحقيقات أداة التمييز المفيدة ويحاكي كيفية عرض هذه البروتينات في مجهر متحد البؤر الفعلي.

آليات نضج البروتين الفلوري للبروتين الفلوريسنت - التكوين التحفيزي الذاتي للفلوروفور (يشار إليه أيضًا باسم حامل الصبغي) داخل البيئة المحمية للعمود الفقري متعدد الببتيد أثناء نضوج البروتين الفلوري يتبع آلية موحدة بشكل مدهش ، خاصة بالنظر إلى الأصول الطبيعية المتنوعة لهذه المسابير البيولوجية المفيدة. بعد التوليف بفترة وجيزة ، تنضج معظم البروتينات الفلورية ببطء من خلال عملية متعددة الخطوات تتكون من الطي ، حلقة الفلوروفور الأولية ، والتعديلات اللاحقة للفلوروفور. تعتمد الخصائص الطيفية للبروتينات الفلورية على بنية الفلوروفور بالإضافة إلى التفاعلات الموضعية لبقايا الأحماض الأمينية في المنطقة المجاورة مباشرة ، وفي بعض الحالات ، البقايا البعيدة عن الفلوروفور. تستكشف البرامج التعليمية التفاعلية في هذا القسم تكوين الفلوروفور في مجموعة متنوعة من البروتينات الفلورية المتنوعة طيفيًا المستخلصة من الدراسات البلورية.

PA-GFP Chromophore Photoactivation - تم فحص الخصائص الفيزيائية الضوئية الفريدة للغاية للبروتين الفلوري الأخضر من النوع البري (النوع البري GFP) بدقة خلال منتصف التسعينيات ، وعمل كأساس لإنشاء أول أداة تمييز بصرية مفيدة مصممة خصيصًا لـ دراسات التنشيط الضوئي. يُطلق عليه PA-GFP (لـ P hoto A ctivatable G reen F luorescent P rotein) ، تم تطوير هذا التمييز البصري من خلال تحسين كفاءة التحويل الضوئي لحامل اللون الأصلي من شكل محايد في الغالب إلى نوع أنيوني في طابعه. من خلال استبدال ثريونين في الموضع 203 ببقايا هيستيدين (T203H) في GFP من النوع البري ، أنتج الباحثون متغيرًا له امتصاص ضئيل في المنطقة بين 450 و 550 نانومتر ، وبالتالي تعزيز التباين بشكل كبير بين الأنواع غير النشطة والمفعّلة.

Dronpa Fluorescent Protein Chromophore Photoswitching - يُدعى البروتين الفلوري الأكثر بروزًا والذي تمت دراسته جيدًا والذي تمت دراسته جيدًا باسم Dronpa (سمي على اسم اندماج مصطلح Ninja للتلاشي والتنشيط الضوئي) ، وهو متغير أحادي مشتق من رباعي الحجر المرجاني. يُظهر بروتين Dronpa الفلوري حدًا أقصى للامتصاص عند 503 نانومتر (ناشئ من chromophore الأنيوني المنفصل) مع ذروة طفيفة عند 390 نانومتر (من chromophore المحايد والبروتوني). ينبعث chromophore الأنيوني مضانًا أخضر بحد أقصى 518 نانومتر وله مستوى سطوع يقارب 2.5 مرة من EGFP. يحدث التبديل الضوئي لـ Dronpa جزئيًا عن طريق التحويل البيني بين الأشكال المنبثقة (على الحالة الساطعة) والأشكال البروتونية (خارج الحالة المظلمة). تدفع الإضاءة عند 488 نانومتر Dronpa إلى الأنواع المظلمة وبعد ذلك يمكن إعادة تشغيل البروتين الفلوري مرة أخرى بإضاءة قصيرة عند 405 نانومتر. يمكن تكرار هذه الدورة عدة مئات من المرات دون تبييض ضوئي كبير.

التحويل الضوئي لـ Kaede / Eos Highlighters - أحد أكثر الفئات فائدة من أدوات التمييز الضوئية يشمل العدد المتزايد من البروتينات الفلورية التي تم الإبلاغ عنها للخضوع لعملية تحويل ضوئي من طول موجي انبعاث إلى آخر. على عكس البروتينات الفلورية القابلة للتنشيط الضوئي ، يتم تعقب هذه المجسات وتصويرها بسهولة في حالة انبعاثها الأصلية قبل التحويل الضوئي ، مما يسهل تحديد المناطق واختيارها للتمييز البصري. كان أول تقرير عن أداة تمييز قابلة للتحويل الضوئي عبارة عن بروتين فلورسنت رباعي معزول من الشعاب المرجانية الصخرية المفتوحة ، Trachyphyllia geoffroyi ، والتي يمكن تحويلها ضوئيًا من انبعاث التألق الأخضر إلى الأحمر عن طريق الإضاءة بالأشعة فوق البنفسجية. كان اكتشاف قلم التظليل صدفة ، وكذلك العديد من الاكتشافات المهمة. حدث ذلك عندما ترك الباحثون عن طريق الخطأ أنبوب اختبار يحتوي على البروتين على مقعد معمل بالقرب من نافذة ، ثم لاحظوا بذكاء التحول من اللون الأخضر إلى الأحمر. دفع الانتقال اللوني غير المعتاد الباحثين إلى تسمية البروتين Kaede ، على اسم أوراق شجرة القيقب اليابانية التي تتحول من الأخضر إلى الأحمر في الخريف.

نقل البروتون المتحمس - من بين أكثر الميزات الفريدة للبروتين الفلوري الأخضر من النوع البري (wt-GFP) حقيقة أن الإضاءة إما بالأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق السماوي تؤدي إلى مضان أخضر له طول موجي أقصى يبلغ حوالي 507 نانومتر. يتميز طيف الامتصاص ثنائي النسق للوزن GFP بقمة كبيرة عند 395 نانومتر (النطاق A) وقمة أصغر بكثير عند 475 نانومتر (النطاق B). يتوافق النطاق B الأصغر مع حامل اللون الأنيوني ، والذي يوضح الفيزياء الضوئية الطبيعية ، بينما يتوافق النطاق السائد A مع حامل اللون المحايد الذي يُتوقع منه عادةً إصدار ضوء أزرق (يبلغ ذروته حوالي 450 نانومتر) عند الإثارة في الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك ، عند الإثارة بضوء يتراوح من 370 إلى 400 نانومتر ، تصبح بقايا التيروزين في الكروموفور المحايد لـ wt-GFP حمضًا قويًا وتنقل بروتونًا عبر شبكة روابط هيدروجينية جديدة لتوليد أنيون حالة متحمس (عملية تعرف باسم متحمس -حالة نقل البروتون ESPT). إنه الشكل الأنيوني للكروموفور الذي ينبعث منه الضوء الأخضر.

مصادر الأدب

المراجع العامة للبروتين الفلوريسنت - يتم تحويل تخصصات البيولوجيا الخلوية والجزيئية بسرعة وبشكل كبير من خلال تطبيق البروتينات الفلورية التي تم تطويرها من الكائنات البحرية كعلامات اندماج لتتبع سلوك البروتين في الخلايا الحية. يمكن ربط أكثر هذه المجسات استخدامًا ، وهو بروتين الفلوريسنت الأخضر ، بأي هدف محل اهتمام تقريبًا ولا يزال يتم طيه ليصبح نوعًا من الأنواع الفلورية القابلة للحياة. يمكن استخدام الكيميرا الناتجة لتوطين البروتينات غير المعهودة سابقًا أو لتصور البروتينات المعروفة وتتبعها لفهم الأحداث الحرجة على المستويين الخلوي والجزيئي بشكل أكبر. يحتوي هذا القسم على ببليوغرافيا لمصادر الأدب لمقالات المراجعة وتقارير البحث الأصلية حول الاكتشاف والتطبيقات والتطوير المستمر لبروتينات الفلورسنت.

المكتبة المرجعية للبروتين الفلوريسنت في الحرم الجامعي ZEISS - إن تطبيق الفئة المتنامية من البروتينات الفلورية القادرة على تكوين كروموفور جوهري لرصد الخلايا والحيوانات الحية قد أطلق بمفرده تقريبًا وغذى حقبة جديدة في علم الأحياء والطب. زودت أدوات البحث القوية هذه الباحثين بآلية دمج مسبار بصري مشفر وراثيًا لمجموعة متنوعة غير محدودة عمليًا من أهداف البروتين من أجل فحص الأنظمة الحية باستخدام الفحص المجهري الفلوري والتكنولوجيا ذات الصلة. تشير المراجع المدرجة أدناه إلى مقالات المراجعة التي يجب أن توفر نقطة البداية لفهم شامل لتكنولوجيا البروتين الفلوري.

مراجع البروتين الحيوي الفلوريسنت - من خلال الاقتران المباشر بين التقنية المجهرية المتقدمة لنقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) إلى البروتين الفلوري الأخضر المنتشر ومتغيراته متعددة الأطياف المدمجة مع البوليمرات الحيوية المختارة ، ابتكر الباحثون المبتكرون فئة جديدة من المستشعرات الحيوية القادرة على توضيح آليات الإشارة ، الانقسام الأنزيمي ، والوظائف الحاسمة الأخرى في الخلايا الحية. يحتوي هذا القسم على ببليوغرافيا لمصادر الأدبيات لمقالات المراجعة وتقارير البحث الأصلية حول البناء والتطبيقات والتطوير المستمر لبروتينات المستشعر الحيوي الفلورية.

المراجع الضوئية للبروتين الفلوريسنت Highlighter - القدرة على بدء أو تغيير ملفات تعريف انبعاث التألق بشكل انتقائي في بروتينات تمييز ضوئي للتحويل الضوئي تجعل هذه المجسات كأدوات ممتازة لاستكشاف سلوك البروتين في الخلايا الحية. نظرًا لأن شدة التألق (أو طيف الألوان) لأدوات التمييز تحدث فقط بعد التحويل بوساطة الفوتون ، تظل تجمعات البروتين غير النشطة ضوئيًا المركبة حديثًا غير ملحوظة ولا تؤدي إلى تعقيد النتائج التجريبية. يسرد هذا القسم مصادر لمقالات المراجعة وتقارير الأبحاث الأصلية حول بروتينات الفلورسنت المضيئة للضوء البصري.

مراجع التبييض الضوئي للبروتين الفلوريسنت - يتم تحويل مجال بيولوجيا الخلية بسرعة من خلال تطبيق البروتينات الفلورية كعلامات اندماج لتتبع السلوك الديناميكي في الخلايا الحية. في هذا الصدد ، غالبًا ما يتم استخدام الانتعاش الفلوري بعد التبييض الضوئي (FRAP) للتدمير الانتقائي لجزيئات الفلورسنت داخل منطقة ذات أهمية باستخدام ليزر عالي الكثافة ، متبوعًا بمراقبة استعادة جزيئات الفلورسنت الجديدة في المنطقة المبيضة على مدى فترة زمنية مع ضوء الليزر منخفض الكثافة. يمكن استخدام المعلومات الناتجة لتحديد الخصائص الحركية ، بما في ذلك معامل الانتشار والجزء المتحرك ومعدل النقل للجزيئات ذات العلامات الفلورية. تشير المراجع المختارة في هذا القسم إلى مصادر الأدبيات الهامة للحصول على معلومات حول FRAP ببروتينات الفلورسنت.

مراجع البروتين الفلوريسنت FRET - يعد فهم التفاعلات الديناميكية بين البروتينات داخل الخلايا الحية أمرًا أساسيًا للمعرفة الأساسية بالمفاهيم الأساسية التي توجه البيولوجيا الجزيئية والخلوية. على مدى السنوات القليلة الماضية ، أدى التطور السريع للبروتينات الفلورية وتطبيقها كمنتجات اندماج وأجهزة استشعار حيوية إلى توسيع مجموعة الأدوات الجزيئية المتاحة للتحقيق في ألغاز علم وظائف الأعضاء الخلوية وعلم الأمراض. في هذا الصدد ، يظهر نقل طاقة الرنين الفلوري (أو F rster) كأسلوب قوي للفحص المجهري البصري لفحص العمليات الفسيولوجية ذات الدقة الزمانية والمكانية العالية. تسلط المراجع المدرجة في هذا القسم الضوء على مصادر الأدبيات الهامة لمقالات المراجعة وتقارير البحث الأصلية حول بناء وتطبيقات البروتينات الفلورية لتجارب نقل طاقة الرنين.

التعليم المستند إلى الإنترنت على البروتينات الفلورية - على الرغم من النمو الهائل للإنترنت (من حيث شبكة الويب العالمية) كمورد إعلامي للأدبيات العلمية الأصلية المتعلقة باستقصاءات البروتين الفلوريسنت ، لا يزال هناك فراغ واضح في مواقع الويب التعليمية المستهدفة في البداية الطلاب والمبتدئين في هذا المجال. لمعالجة هذه المشكلة ، تحوّل المواقع التعليمية المخصصة للفحص المجهري البصري والتصوير الرقمي التي يتم إنشاؤها واستضافتها في جامعة ولاية فلوريدا انتباهها إلى زيادة تطبيق البروتينات الفلورية لدراسات التصوير بالخلايا الحية. ينصب التركيز الأساسي لهذا الجهد على إنشاء أقسام جديدة من المواقع التي تتناول بنية وخصائص البروتينات الفلورية بالإضافة إلى تحسين فائدتها في تجارب التصوير.

موارد الإنترنت

مصادر تجارية متجه البروتين الفلوريسنت - مجموعة متنوعة من البروتينات الفلورية ، متوفرة كنواقل بلازميد الحمض النووي المؤتلف المصممة لترنسفكأيشن الخلايا الثديية أو تحول البكتيريا ، متوفرة تجارياً من عدد من الموزعين. تم تحسين الترميز الأمثل لمعظم النواقل التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي للبروتين الفلوري للتعبير في خلايا الثدييات وتحتوي على جينات المضادات الحيوية لانتقاء المسوخات المستقرة التي لها مستويات تعبير ثابتة نسبيًا. غالبًا ما تحتوي النواقل على متواليات استنساخ متعددة تمكن الباحثين من إدخال الجينات التي تهمهم بسهولة للاندماج في البروتين الفلوري. تشمل السمات الشائعة الأخرى في نواقل البروتين الفلوريسنت محفز الفيروس المضخم للخلايا البشري (CMV) ، وموقع بدء ترجمة كوزاك ، وإشارة ارتباط الحمض النووي الريبي المرسال المبكر ، وجين المضاد الحيوي البكتيري.

تصوير الخلية الحية - أحد الأهداف الرئيسية في علوم الحياة هو فهم بنية ووظيفة وسلوك الكائنات الحية ، ومع التطورات المتطورة في التكنولوجيا ، مثل تطوير مجسات مجهرية متحد البؤر وتحقيقات الفلورسنت ، أصبح من الممكن متابعة هذا الهدف على المستويين الخلوي وشبه الخلوي. ومع ذلك ، فإن العمل مع الخلايا الحية وتصويرها يمكن أن يكون مهمة معقدة ، إن لم تكن شاقة ، لعلماء الميكروسكوب الذين ليسوا على دراية بالتقنيات والأدوات المتاحة. ما يلي عبارة عن مجموعة من الموارد التي تقدم لمحات عامة ومعلومات أساسية ومنتديات تفاعلية وأسئلة متكررة وبروتوكولات وتلميحات من شأنها أن تساعد أي اختصاصي ميكروسكوب يحاول الدخول في هذا المجال المهم والمزدهر.

غرف العينات المجهرية - تتطلب متطلبات الفحص المجهري متحد البؤر الحديث ، وخاصة تلك التي تنطوي على تصوير الخلايا والأنسجة الحية ، أن يتخذ الباحثون احتياطات خاصة مع عيناتهم. في الواقع ، الشرائح المجهرية البسيطة غير مناسبة للعديد من التطبيقات ، مما أدى إلى تطوير مجموعة واسعة من غرف العينات ، والتي يمكن أن توفر في كثير من الأحيان المرونة التي يحتاجها الميكروسكوب. تمثل قائمة الموارد في هذا القسم مجموعة كبيرة ومتنوعة من غرف العينات المتوفرة اليوم ويجب أن تساعد الزائرين في تحديد المنتجات الأنسب لمهامهم العلمية المحددة.

مرشحات الإسفار - يعتمد الفحص المجهري الفلوري بشكل كبير على القدرة على تحديد منطقة طول موجة معينة لإثارة العينة وجمع الانبعاث الثانوي أثناء تكوين الصورة. أدت التطورات الحديثة في تصميم مرشح التداخل إلى مرشحات عالية الدقة تغطي نطاقًا واسعًا من ملفات تعريف ممر النطاق ، تتراوح من بضع إلى عشرات ومئات النانومترات. المدرجة أدناه عبارة عن مجموعة من الشركات المصنعة التي تصمم وتصنع وتورد مرشحات التألق لمجتمع الفحص المجهري. ستلبي المنتجات التي يقدمونها معظم متطلبات النظام ، ولكن إذا استلزم تطبيق متخصص مرشحًا بنطاق طيفي غير عادي أو مواصفات فريدة أخرى ، فسيقوم العديد من الشركات بتصنيع مرشحات مخصصة.

محققو مبدأ البروتين الفلوريسنت - يستخدم العديد من العلماء المشاركين في الأبحاث التي تستهدف جوانب مختلفة من بيولوجيا الخلية البروتينات الفلورية كمجسات تصوير لهيكل الخلية ووظيفتها وديناميكياتها. قام العديد من الباحثين الرئيسيين ببناء مواقع ويب واسعة النطاق توضح تفاصيل مختبراتهم ، وهذه المواقع مفيدة جدًا للزوار المهتمين بمعرفة المزيد عن ساحة البحث المثيرة والمتطورة بسرعة. تتضمن المعلومات الموجودة على غالبية مواقع الويب المرتبطة أدناه الاهتمامات البحثية الحالية ، والسير الذاتية ، والمنشورات ، وقوائم موظفي المختبر ، ومعلومات الاتصال ، والدروس التعليمية ، ومعارض الصور ، ومقاطع الفيديو الرقمية.

جينيفر ليبينكوت شوارتز وجورج إتش باترسون - فرع بيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي ، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، ماريلاند ، 20892.

ديفيد دبليو بيستون - قسم الفسيولوجيا الجزيئية والفيزياء الحيوية ، جامعة فاندربيلت ، ناشفيل ، تينيسي ، 37232.

ريتشارد ن داي - قسم علم وظائف الأعضاء الخلوية والتكاملية ، كلية الطب بجامعة إنديانا ، 635 دكتور بارنهيل ، إنديانابوليس ، إنديانا ، 46202.

روبرت إي كامبل - قسم الكيمياء ، جامعة ألبرتا ، إدمونتون ، ألبرتا ، كندا ، T6G2G2

ماثيو جي باري هيل ، ناثان إس كلاكستون ومايكل دبليو ديفيدسون - مختبر المجال المغناطيسي الوطني العالي ، 1800 إيست بول ديراك دكتور ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي ، فلوريدا ، 32310.


نظرة عامة على الحديث

الإسفار هو عملية تمتص فيها المادة الضوء وتعيد إصدارها بطول موجة مختلف. يستخدم الإسفار على نطاق واسع في الفحص المجهري البيولوجي. تصف هذه المحاضرة مبادئ المجهر الفلوري والفلوري.

أسئلة

  1. طابق مقياس الوقت بهذه التحولات:
    1. فيمتو ثانية
    2. بيكو ثانية
    3. نانو ثانية
    1. الانتقال من الحالة المثارة إلى الحالة الأساسية
    2. امتصاص الفوتون
    3. الانتقال إلى حالة الإثارة الأقل طاقة
    1. معدل Photobleaching
    2. عمر الإسفار
    3. معامل الامتصاص
    4. الذوبان في الماء
    1. عادةً ما يكون تبديل المرشحات في عجلة مرشح الانبعاثات أبطأ من تغيير مكعبات المرشح في البرج
    2. مرشح انبعاث 480/40 يمر ضوء 440-520 نانومتر
    3. يحتوي مكعب المرشح عادةً على مرشحين ومرآة ثنائية اللون
    4. يتم وضع العدسة الأنبوبية بشكل عام قبل مكعب المرشح

    الإجابات


    ميزات البلازميد التعبير البروتين الفلوري

    عند شراء أو طلب بلازميد FP ، سيُطلب منك غالبًا تحديد الإصدار & # x0201cN & # x0201d أو & # x0201cC & # x0201d. تشير هذه المصطلحات إلى بلازميدات EGFP Clontech (Invitrogen) الأصلية وتشير إلى موضع موقع متعدد النسيلة بالنسبة إلى FP. تضع التركيبات N البروتين الخاص بك في NH2-حدد FP و C يضع البروتين الخاص بك في COOH-terminus لـ FP. لسهولة الاستنساخ الفرعي في بلازميدات FP أخرى ، تم دمج جميع FP (كدنا) تقريبًا في هذه البلازميدات. تحتوي بلازميدات N و C على علامة مقاومة مناسبة لاختيار البكتيريا وتوليد خطوط خلايا ثديية مستقرة (كانامايسين للبكتيريا و G418 لخلايا الثدييات). يستخدم كلا البلازميدات أحد أقوى المحفزات المتاحة (CMV) ، والتي ستساعد في إنتاج مستويات قوية من بروتينات الاندماج FP أو FP ، ولكن من المحتمل أن تزيد بشكل كبير من التعبير عن معظم البروتينات الخلوية. تعتبر بلازميدات N و C ممتازة للتعبير عن FP غير الموسوم ، ولكن لديها بعض المشكلات لبناء بعض بروتينات الاندماج (انظر أدناه).


    مقدمة في الفحص المجهري الإسفار

    الإسفار هو عضو في كل مكان التلألؤ مجموعة من العمليات التي تنبعث فيها الجزيئات الحساسة الضوء من الحالات المثارة إلكترونيًا الناتجة إما عن طريق آلية فيزيائية (على سبيل المثال ، امتصاص الضوء) أو ميكانيكية (احتكاك) أو آلية كيميائية. إن توليد اللمعان من خلال إثارة الجزيء بواسطة فوتونات الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء المرئي هي ظاهرة تسمى تلألؤ ضوئي، والتي تنقسم رسميًا إلى فئتين ، ضوئي و التفسفر الوميض الفوسفوري، اعتمادًا على التكوين الإلكتروني للحالة المثارة ومسار الانبعاث. الإسفار هو خاصية لبعض الذرات والجزيئات لامتصاص الضوء عند طول موجي معين ولإصدار ضوء ذي طول موجي أطول بعد فترة وجيزة ، تسمى عمر التألق. تحدث عملية الفسفرة بطريقة مشابهة للفلورة ، ولكن مع حياة أطول بكثير من الإثارة.

    مقالات المراجعة

    نظرة عامة موجزة عن الإسفار

    يقدم هذا القسم المستمد من الأقسام التمهيدية في فيزياء الضوء واللون ، تفسيرات قصيرة للظواهر المهمة المرتبطة بها بالإضافة إلى العديد من البرامج التعليمية وقائمة المراجع.

    مفاهيم أساسية في الإسفار

    عند اقترانه بالمجهر الضوئي ، يمكّن التألق الباحثين من دراسة ظاهرة في البيولوجيا الخلوية. في المقام الأول هو تحليل التوزيع داخل الخلايا للجزيئات الكبيرة المحددة في التجمعات الخلوية الفرعية.

    دروس جافا التفاعلية

    مخطط طاقة جابلونسكي

    اكتشف كيف تتحمس الإلكترونات في الفلوروفور من حالة الأرض إلى حالات طاقة أعلى ، والأحداث التي تحدث عندما تسترخي هذه الجزيئات عن طريق انبعاث الفوتون ثم تعود إلى حالة الطاقة على مستوى الأرض.

    تأثيرات المذيبات على انبعاث الإسفار

    تؤثر العديد من العوامل البيئية على انبعاث الفلورة مثل التفاعلات بين جزيئات الفلور والمذيبات. افحص تأثيرات الاسترخاء والتحولات الطيفية التي تحدث كدالة لقطبية المذيب.

    Photobleaching

    Photobleaching يحدث عندما يفقد الفلوروفور القدرة على التألق بسبب التلف الكيميائي الناجم عن الفوتون. استكشف الاختلافات في معدلات التبييض الضوئي في عينات التألق المفردة والمزدوجة والمضاعفة.

    مراجع مختارة

    قائمة مرجعية

    يشهد مجال الفحص المجهري الفلوري نهضة مع إدخال تقنيات جديدة مثل متحد البؤر ، ومضاعف الفوتون ، والتفكك ، والانعكاس الداخلي الكلي ، خاصةً عندما يقترن بالتقدم في تقنية chromophore و fluorophore. تم استخدام المواد المرجعية المذكورة أدناه في بناء قسم التألق من تعبيرات الجزيئات المجهري التمهيدي.

    المؤلفون المساهمون

    بريان هيرمان و فيكتوريا إي سينترونز فروليش - قسم البيولوجيا الخلوية والهيكلية ، مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس ، 7703 فلويد كيرل درايف ، سان أنطونيو ، تكساس 78229.

    جوزيف ر - مركز التحليل الطيفي الفلوري ، قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، جامعة ميريلاند ومعهد التكنولوجيا الحيوية بجامعة ميريلاند (UMBI) ، 725 شارع ويست لومبارد ، بالتيمور ، ماريلاند 21201.

    دوجلاس ب.ميرفي - قسم بيولوجيا الخلية والتشريح والميكروسكوب ، كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز ، 725 شارع إن وولف ، 107 WBSB ، بالتيمور ، ماريلاند 21205.

    كينيث ر. سبرينغ - مستشار علمي ، لوسبي ، ماريلاند ، 20657.

    مايكل دبليو ديفيدسون - مختبر المجال المغناطيسي الوطني العالي ، 1800 East Paul Dirac Dr. ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي ، فلوريدا ، 32310.


    الانتماءات

    Department of NanoBiophotonics, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Am Fassberg 11, Göttingen, 37077, Germany

    Steffen J. Sahl, Stefan W. Hell & Stefan Jakobs

    Department of Optical Nanoscopy, Max Planck Institute for Medical Research, Jahnstrasse 29, 69120, Heidelberg, Germany

    German Cancer Research Center (DKFZ), BioQuant, Im Neuenheimer Feld 267, 69120, Heidelberg, Germany

    Department of Neurology, University of Göttingen Medical Faculty, Robert-Koch-Strasse 40, 37075, Göttingen, Germany

    يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

    يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

    يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

    مساهمات

    All three authors contributed equally to all four aspects of preparing the article (researching data for the article, substantial contributions to the discussion of the content, writing, and reviewing and editing of the manuscript before submission).

    المؤلفون المراسلون


    Application 3—Multiple fluorescence outputs

    Characterisation of biological systems often requires monitoring of multiple fluorescent protein–tagged outputs [35–37]. Here, we demonstrate the effectiveness of Chi.Bio for probing such a system (Fig 5A). Adding chemical inducers in different orders highlights the impact that cellular burden [35] has on its two outputs (Fig 5B): If red fluorescent protein (RFP) is induced after GFP, we observe a significant drop in GFP (due to limited resource availability for production of GFP and its activating transcription factor RhaS). However, if RFP is induced first, the subsequent induction of GFP leads to an increase in RFP expression, which we hypothesise is due to the effect of resource limitation on expression of its repressing transcription factor TetR (repeatability of this behaviour is illustrated in S1P Data). In all cases, we observe negligible cross talk between fluorescent protein–measurement channels, and our instrument's high sensitivity allows fluorescence activation to be observed within approximately 20 minutes of induction (Fig 5C, approximately the time required for fluorophore maturation).

    (أ) Two-plasmid system for inducible expression of GFP and RFP. (ب) Fluorescence of GFP (left axis) and RFP (right axis) following induction at times تي1 و تي2 with indicated inducer combinations. (ج) GFP fluorescence measured during short time period near تي1. A small increase is observed in the two samples to which aTc is added due to the fluorescence of the inducer compound itself. a.u., arbitrary units GFP, green fluorescent protein RFP, red fluorescent protein.


    New species of water bear uses fluorescent ‘shield’ to survive lethal UV radiation

    Tardigrades, small aquatic creatures known as water bears, can survive extreme heat, radiation, and even the vacuum of outer space—conditions that would kill most animals. Now, scientists have discovered a new species of tardigrade that can endure ultraviolet (UV) light so lethal, it is regularly used to get rid of hard-to-kill viruses and bacteria.

    The discovery was made by chance: Researchers at the Indian Institute of Science scoured their campus for water bears, and then exposed them to extreme conditions. They happened to have a germicidal UV lamp in the lab, so they hit their specimens with it. The dose of 1 kilojoule per square meter, which killed bacteria and roundworms after just 5 minutes, was lethal to Hypsibius exemplaris tardigrades at 15 minutes most died after 24 hours. But when they hit a strange, reddish brown species with the same dose, all survived. What’s more, when the researchers upped the dose four times, about 60% of the reddish brown bears lived for more than 30 days.

    The researchers realized they had found a new species of tardigrade, part of the Paramacrobiotus جنس. To figure out how the new species—which was found living in moss on a concrete wall in Bengaluru, India—survived, the scientists examined it with an inverted fluorescence microscope. To their surprise, under the UV light, the reddish tardigrades became blue (above). Fluorescent pigments, likely located under the tardigrades’ skin, transformed the UV light into harmless blue light, the team reports today in Biology Letters . فى المقابل، Paramacrobiotus with less pigment died about 20 days after exposure.

    Next, the researchers extracted the fluorescent pigments and used them to coat H. exemplaris وعدة التهاب الكينورهاب ايليجانس earthworms. Animals with the jury-rigged shields survived at almost twice the rate of animals without the shields. It’s likely, scientists say, that the tardigrades evolved fluorescence as a means to tolerate the high doses of UV typical for hot summer days in southern India.


    Photoluminescence Basics

    Photoluminescence occurs when molecules absorb energy. If the light causes electronic excitation, the molecules are called فرح. If light causes vibrational excitation, the molecules are called الحار. Molecules may become excited by absorbing different types of energy, such as physical energy (light), chemical energy, or mechanical energy (e.g., friction or pressure). Absorbing light or photons may cause molecules to become both hot and excited. When excited, the electrons are raised to a higher energy level. As they return to a lower and more stable energy level, photons are released. The photons are perceived as photoluminescence. The two types of photoluminescence ad fluorescence and phosphorescence.


    Fluorescence: Basics, techniques, advantages

    Most of the newly developed microscopic techniques make use of fluorescence. Microscope and accessories performance is also increasing in accordance with the requirements of these applications and the fast growing number of fluorochromes available. In the next two parts of our “Basics of Light Microscopy and Imaging” series by experts from Olympus and Soft Imaging Systems, we will be concentrating on fluorescence microscopy and the essential role digital imaging plays.

    الأساسيات
    A Development Both Remarkable and Ongoing
    Within the last few decades numerous new techniques such as confocal, deconvolution, ratio-imaging, total internal reflection and applications such as the use of fluorescent proteins (e.g. GFP) have initiated a real renaissance in the microscopy field. All of these techniques make use of fluorescence, a phenomenon first observed by Sir George Gabriel Stokes in 1852 and physically described by Alexander Jablonski in 1935. Compared with nowadays, the number of widely used fluorochromes was restricted to just a few in the 1990's. What is referred to as the fluorochrome FITC filter set for fluorescence microscopy can now be used for a wide range of different fluorochromes with green emission spectra.

    Why use Fluorescence?
    Using fluorescence is like the situation where a teacher asks whether the students have done their homework. The rapidly changing facial colours of the “guilty” students provides conclusive “results”.
    But fluorescence techniques are not really for answering questions like the above. They help address specific questions regarding life science or materials science specimens and to visualise the result in a specific colour. To identify the distribution of a specific protein within a tissue, for example, a fluorochrome can be used to mark the protein via an antibody (immunohistochemistry).
    Histological staining procedures for transmission light microscopy do have a long history in microscopy. One essential advantage of fluorescence microscopy, however, is the presence of fluorescent molecules themselves. Although a structure is too small to be resolved in a light microscope, the emission light remains visible.
    Fluorescent molecules act like light sources that are located at specific specimen areas, indicating their location via light of a specific colour. These indicators require energy to emit light and this is given to the fluorochrome by the excitation light, provided by the microscope light source. A specific range of wavelengths is needed to excite a specific fluorochrome. A range of blue wavelengths around 480 nm can excite the FITC fluorochrome, for example.
    This means dealing with two different light beams and having to separate them. On the one hand, we need to direct the light of the microscope light source onto the specimen and on the other hand we have to observe the light that is originating from the fluorochromes. This separation is possible due to the “Stokes shift”, which describes the fact that the wavelength of fluorescent light (emission) is always longer than that of the excitation. Using a blue excitation light will thus result in a green emission for the FITC fluorochrome.
    Every fluorochrome has its own excitation and emission spectra. The microscope must be perfectly equipped to visualise this fluorescence accordingly.

    Fluorochromes
    There are two options for using fluorescent microscopy: either the specimen itself already contains molecules that show fluorescence or specific fluorochromes have to be added to the specimen, depending on what is being investigated. Autofluorescence is widely found on materials such as plant sections or electrical circuits, for example. The resin on circuits is fluorescent and can easily be inspected under blue excitation (Fig. 2b). The green emission of the resin allows detection of the tiniest cracks which may influence material quality.
    Fluorochromes themselves can be divided into at least three groups. The first are fluorochromes that require other molecules such as antibodies or lectines to bind to specific targets. This rapidly growing group of fluorochromes includes longstanding ones such as FITC and TRITC.
    Most of these fluorochromes are sold together with the specific target-finding molecule (e.g. a goat anti-mouse IgG antibody Cy5 labeled). Quantum dots are also partial members of this group but different in structure and theory. They are nanometer-sized crystals of purified semiconductors and exhibit long-term photo stability as well as bright emission. The main difference featurewise is their capacity for being excited by wavelengths up to the blue range and having different emission colours depending on their size. Due to their flexible capabilities they can also be used for direct staining of cells (e.g. cell viability). This takes us to the second group.
    The second group contains fluorochromes that have inherent binding capacities such as the DAPI nucleic acid stain or the DiI anterograde neuron stain. This group also contains fluorochromes that change their fluorescent properties when bound to different amounts of molecules such as calcium (e.g. Fura-2). This means these fluorochromes are used directly and do not necessarily require a transportation system such as an antibody.
    The third group contains fluorescent proteins produced by organisms themselves such as GFP. This makes it possible to set up experiments in an entirely different way. It is most often used for life cell imaging or developmental studies and molecular biology. All fluorochromes show distinct spectral properties (Fig. 2a) and can often be combined for a multicolour specimen analysis.

    ر equirements for a Fluorescence Microscopy System

    The Light Source
    To excite the fluorescence of a fluorochrome, an intense light source is needed that provides the wavelengths to excite the fluorochrome in use. In the first chapter of this series we described the most frequently used light sources for light microscopy and their alignment.
    A correctly aligned burner plays an essential role for creating good fluorescent images. If the burner is not correctly aligned, the signal from the fluorochrome may be excited in a very weak way and the field of view will not be homogeneously illuminated.
    Due to the very different specimens and applications that can be analysed using fluorescent techniques there is no one-size-fits-all strategy. All fluorochromes are subject to the process of photobleaching, chemical destruction which takes place during excitation. Living cells, too, may be damaged by the intense light. This makes it of supreme importance to restrict the excitation brightness and time length to just the right amount needed. The amount of light can be efficiently modified with neutral density filters or a motorised attenuator. Anytime the light is not needed for excitation the shutter is closed. These features can be predefined in motorised microscopes and help optimise experiments.

    The Filter Sets
    Following the light path within a fluorescence microscope (Fig. 3), the next and critical step is having a filter which only permits the range of excitation wavelengths to pass through. This is done by an exciter filter using what are referred to as bandpass filter characteristics (Fig. 4). After restricting the light to the colour that is needed to excite the fluorochrome, the light is directed to the specimen via a dichromatic mirror. As indicated by the name, the dichromatic mirror treats different colours differently. It reflects light below a given wavelength and is able to let longer wavelengths pass through. The excitation light travels through the objective to the specimen, acting like a condenser. This is where the fluorescence phenomenon takes place.
    Excited by the light, the fluorochromes emit the fluorescence light of longer wavelengths. This is captured by the objective, moving on to the dichromatic mirror, now letting the longer wavelengths pass through. The last step of filtering is done by the emission filter (also called a barrier filter). This filter restricts the light colour to fit best with the fluorochrome emission and the question being investigated. It ensures that no unwanted wavelengths are observed and analysed. The emission filter can be designed as a bandpass filter (precisely restricted to one spectrum) or as a longpass filter (brighter in effect but with less optimised restrictability).
    To help find the best filter combination for the fluorochromes in use and the analysis in mind, a variety of web pages is available. A straightforward example (below) will demonstrate how the combination of filters may differ depending on the context.
    If you wish to make a vital analysis of a cell culture you may choose a Fluorescein- diacetate (FDA) to stain vital cells. This fluorochrome is excited by blue light and will have a green emission. The vital cells will be the ones appearing green. The filter set could thus be chosen as follows: an exciter with BP460-490 bandpath characteristics, a dichromatic mirror with DM505 characteristics and an emission filter with LP510 longpath characteristics. This will result in a bright green image of all green fluorescent molecules. حتى الان جيدة جدا. The vital cells are stained. To verify that nonlabelled cells are in fact dead, propidumiodide (PI) dye may be used. This dye cannot pass through intact cell membranes. The DNA of dead cells only will be labelled and appear red. This means it can be used along with the FDA. When doing so, however, the excitation of the FDA with the filter mentioned will cause some problems. PI will already be excited by the blue light and the red emission is also visible. This is caused by the emission filter because in this set up, all wavelengths above 510 nm are allowed to pass through. Both dyes are thus excited and visible. A definite separation of both signals is not possible and as we will see later on, this can cause problems during imaging.
    To separately identify both signals from the cell culture, the emission filter required for FDA is a bandpass filter (e.g. BP510-550). This filter will only allow the green emission of the FDA to pass through and the emission of the PI will be blocked. A second filter set can then be used to analyse the PI signal efficiently (e.g. BP530-550 excitation filter, LP575 emission filter, DM570 dichromatic mirror).
    This principle also applies to other multicolour staining procedures. Best results are achieved when at least the emission filter for the detection of the fluorochrome with the shorter wavelength is a band pass filter (Fig. 6)

    The Objectives
    The light gathering capacity of the objective plays an essential role in fluorescence microscopy. For optimal signal strength, high-numerical aperture (high NA) and the lowest useable magnification should be employed. For example, using a 1.4 NA aperture lens instead of a 1.3 NA lens of the same magnification and assuming that also all other factors are the same, results in about a 35% increase of intensity. On the other hand, the type of glass that is used requires good transmission for the wavelengths used. Fluorite or apochromate objectives are used for that reason. Further enhancement can be achieved by selecting objectives with extremely low autofluorescence of the glass material used (Olympus UIS2 Objectives). When all of these factors are provided for – high NA, good transmission and low autofluorescence – this ensures a perfect signalto- noise ratio (i.e., a strong signal with low background intensity (Fig. 6)). Background noise can also be introduced by the specimen itself due to fixation, autofluorescence of the specimen or non-optimised staining procedures.

    Type of Camera
    The imaging device is one of the most critical components in fluorescence microscopy analysis. This is because the imaging device used determines at what level specimen fluorescence may be detected, the relevant structures resolved and/or the dynamics of a process visualised and recorded. Numerous properties are required to use fluorescence microscopy effectively. These include: high resolution, extreme sensitivity, cooling, variable exposure times and an external trigger function. Generally no single detector will meet all these requirements in fluorescence microscopy. The fluorescence microscopist thus frequently has to compromise. However, the cameras used in fluorescence microscopy should at the very least offer high signal sensitivity, low noise and the ability to quantify intensity of intensity distribution.
    Colour cameras are less sensitive than their monochrome counterparts because of the additional beam-splitting and wavelength selection components. Therefore monochrome cameras are preferable.
    They image the fluorescence intensity of each fluorochrome separately and can handle the respective images later on as images within a specific colour space using the appropriate software. The resulting multicolour images can be displayed, printed out and analysed or further processed. And every channel of colour represents the result of one fluorochrome. This result can be obtained if the fluorescence filters are chosen correctly. Coming back to our example of the FDA and PI double labelling: when using the longpass emission filter to detect the FDA signal, the red emission of the PI will also contribute to the resulting digital image. A monochrome camera would not differentiate between red and green or between blue and green as shown in Fig. 6 – it will only show intensity in grey values. Therefore the image will represent the resulting distribution of both fluorochromes within the same colour. The use of the bandpass emission filter as described above will help in this respect.

    Software-Tools: Spectral Unmixing
    A further problem can occur when using different fluorochromes with overlapping spectra within one sample. The considerable overlap of excitation and emission spectra of different fluorochromes is exemplified by the spectra of enhanced green fluorescence protein (eGFP) and enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), two commonly used variants of the green fluorescent protein (Fig. 7). Even with the use of high quality optical filters it is not possible to separate the spectral information satisfactorily. This means that YFP-labelled structures are visible with a GFP filter set and vice versa, affecting the resulting images significantly and detrimentally. This phenomenon, known as “bleed-through”, strongly reduces colour resolution and makes it difficult to draw accurate conclusions.
    The solution to overcoming this effect is called spectral imaging and linear unmixing. This is a technique adapted from satellite imaging to wide-field fluorescence microscopy. Using this highly effective method, it becomes possible to ascertain the specific emission of the different fluorochromes to the total signal and to restore a clear signal for each colour channel, unaffected by emission from the other fluorochrome. This is done by redistribution of the intensity. It is important to note that original data is not lost during linear unmixing nor is any additional data added to the image. The original image information is all that is used in this procedure. The overall intensity of pixels is maintained. Thus, the technique does not result in artificially embellished images. After unmixing, quantification analysis does not only remain possible, but also becomes more precise.

    Image source for images 1, 2A, and 4 courtesy of Michael Davidson,
    PhD., Florida State University, Florida, USA


    شاهد الفيديو: دليلك لدراسة مواد الطب. مادة المايكروبيولوجي. مادة الأحياء الدقيقة. Microbiology (سبتمبر 2022).


تعليقات:

  1. Abbot

    كل يوم يشبه السابق. يختلف كل منشور من قبل المؤلف عن المنشور السابق. الخلاصة: اقرأ المؤلف :)

  2. Dravin

    عظيم!!! كل شيء رائع!

  3. Sundiata

    أعتقد أنك ستسمح بالخطأ. أدخل سنناقش. اكتب لي في PM ، سنتحدث.



اكتب رسالة