معلومة

برنامج لتقييم حركية الخلية بوظيفة عملية دفعية؟

برنامج لتقييم حركية الخلية بوظيفة عملية دفعية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تقييم حركة الخلية هو فرع من علم الأحياء التجريبي أو العلوم الطبية. يمكن أن يكون أحد الأمثلة تقييم تأثيرات العلاج على حركة الحيوانات المنوية للحيوان. يتضمن الإجراء القياسي أخذ مقاطع فيلم من الحيوانات المنوية (أو أي أشياء متحركة أخرى) من خلال مجهر وقياس متوسط ​​السرعة الخطية للجسيمات على مقاطع الفيلم هذه. البرنامج المستخدم لقياس هذه السرعات الخطية مهم ، ولا توجد خيارات كثيرة على حد علمي. ومع ذلك ، قد تكون معرفتي محدودة.

سبق لي أن استخدمت CellTrak لقياس سرعة الحيوانات المنوية في السباحة. يعمل البرنامج بشكل جيد ، لكنه يفتقر إلى وظيفة معالجة الدُفعات. نظرًا لأن التقييم يعتمد على عدد كبير من التكرارات ، فقد انتهى بي الأمر مع 1000-2000 مقطع فيلم ليتم تحليلها والنقر في طريقي عبر CellTrak هي عملية مملة ومزعجة. كما أن ترخيص CellTrak يكلف الكثير من المال لمثل هذا البرنامج السيء الكتابة.

لذلك ، سؤالي هو: هل هناك شخص على دراية ببرنامج مشابه لـ CellTrak ، والذي يتضمن خيار معالجة الدُفعات ، أو أفضل من ذلك ، والذي يعمل من خلال سطر الأوامر ويمكن تكراره؟ هل توجد خيارات أو امتدادات مفتوحة المصدر لبرامج مفتوحة المصدر مستخدمة على نطاق واسع (ImageJ ، وموصل حيوي ، وما إلى ذلك)؟ يرجى تقديم برنامج تعليمي قصير / تجربة شخصية لاستخدام البرنامج المقترح (إن وجد).


يحتوي ImageJ على العديد من المكونات الإضافية للتتبع ، أحدها الجيد هو TrackMate. يمكن كتابة معظم وظائفه بلغات مختلفة ويمكن أيضًا تشغيل توزيع فيجي في وضع مقطوعة الرأس. إنه مفتوح المصدر ولن يكلفك أي أموال مقابل ملف كثير مجموعة جعة الجعة.

أنا شخصياً استخدمت ImageJ في وضع مقطوعة الرأس مكتوبًا بلغة الماكرو الخاصة به لأنه من السهل نسبيًا التعلم. يجب على TrackMate أيضًا إخراج متوسط ​​سرعات المسارات ، إذا كنت أتذكرها بشكل صحيح. وإلا فسيتعين عليك كتابة نص برمجي لقياس تلك الموجودة في بيانات التتبع. يمكنك استخدام لغة ماكرو IJ أو Python أو Java أو إحدى اللغات الأخرى المدعومة.

بالاقتران مع غلاف البرنامج النصي bash لوضعه بدون رأس ، استخدمه حتى في Makefiles لتحويل مكدسات tiff إلى avi ووضع أشرطة مقياس وطوابع زمنية على كل شيء.

أتمنى أن يساعدك هذا.


معيار لطرق تصحيح تأثير الدُفعات لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية

تحتوي مجموعات البيانات النصية أحادية الخلية واسعة النطاق التي تم إنشاؤها باستخدام تقنيات مختلفة على اختلافات منهجية خاصة بالدُفعة والتي تمثل تحديًا لإزالة تأثير الدُفعات وتكامل البيانات. مع استمرار النمو المتوقع في بيانات scRNA-seq ، يعد تحقيق تكامل دفعي فعال مع الموارد الحسابية المتاحة أمرًا بالغ الأهمية. هنا ، نقوم بإجراء دراسة معيارية متعمقة حول طرق تصحيح الدُفعات المتاحة لتحديد الطريقة الأنسب لإزالة تأثير الدُفعات.

نتائج

قارنا 14 طريقة من حيث وقت التشغيل الحسابي ، والقدرة على التعامل مع مجموعات البيانات الكبيرة ، وفعالية تصحيح تأثير الدُفعات مع الحفاظ على نقاء نوع الخلية. تم تصميم خمسة سيناريوهات للدراسة: أنواع الخلايا المتطابقة بتقنيات مختلفة ، وأنواع الخلايا غير المتطابقة ، والدُفعات المتعددة ، والبيانات الضخمة ، والبيانات المحاكاة. يتم تقييم الأداء باستخدام أربعة مقاييس معيارية بما في ذلك kBET و LISI و ASW و ARI. نحن أيضًا نحقق في استخدام البيانات المصححة على دفعات لدراسة التعبير الجيني التفاضلي.

استنتاج

بناءً على نتائجنا ، فإن Harmony و LIGER و Seurat 3 هي الطرق الموصى بها لتكامل الدُفعات. نظرًا لوقت تشغيله الأقصر بشكل كبير ، يوصى باستخدام Harmony كأول طريقة للمحاولة ، مع الطرق الأخرى كبدائل قابلة للتطبيق.


مقدمة

تلعب الهجرة الخلوية دورًا أساسيًا في العديد من العمليات البيولوجية: على سبيل المثال التئام الجروح ، والتكون الجنيني ، والالتهابات ، والنقائل حيث يمكن أن تؤدي الهجرة غير المنضبطة للخلايا إلى انتشار الورم وبالتالي يمكن أن تسبب تطور السرطان. غالبًا ما تتطلب دراسة هذه العمليات تتبع الخلايا ، ومعظم دراسات الحركة للمزارع أحادية الطبقة تتضمن وضع العلامات الفلورية للخلايا ، مما يسمح بدراسات الفحص المجهري الفلوري [1] [2]. تتطلب هذه التقنية إما طفرات واسعة النطاق للحصول على بروتين فلوري معبر عنه بنوع الخلية قيد الدراسة ، أو أنها محدودة بحقيقة أن الأدوية الفلورية المتصلة بالغشاء أو المنفصلة غالبًا ما تغير سلوك الخلية [3]. في الثقافات المتفرقة ، يمكن أن يكون للخلايا تباين جيد بما فيه الكفاية مع الخلفية بحيث يمكن التعرف على حدودها بمجهر المجال الساطع دون وضع العلامات [4 أ] [4 ب]. يمكن القيام بذلك يدويًا باستخدام طرق التوجيه والنقر بتكلفة كبيرة للوقت والعمل [5] [6] [7] [8] [9] [10]. عندما يتعين تتبع الخلايا الموجودة في عدد قليل من الصور فقط ، فهذا لا يمثل تحديًا. ومع ذلك ، عندما تحتاج إلى تحليل متواليات الفاصل الزمني الطويل للخلايا المتحركة ، فإن هذا النهج غير عملي ، مما يزيد من الحاجة إلى برنامج موثوق لتتبع الخلايا الآلي وتقييم متانة طريقة التحليل.

يتم سرد البرامج التمثيلية لتحليل ثقافة الخلايا المتفرقة في الجدول 1. تم تصميم غالبية هذه البرامج (غير المدرجة في الجدول 1) لتتبع الخلايا ذات العلامات الفلورية [1] [2] [15] [16] [17] [18]. البرامج المصممة للاستخدام مع صور المجهر الضوئي تتبع إما نواة الخلية [19] [20] أو الخلية بأكملها [21] [11] [22] [12]. يمكن تعريف موضع الخلية على أنه: (1) مركز النواة [6] (2) النقطه الوسطى لمحيط الخلية كما يظهر في المجهر الضوئي [23] (3) النقطه الوسطى لبصمة الخلية كما هو موضح في المجهر الضوئي [4] و (4) النقطه الوسطى للهيكل الخلوي أكتين للخلايا ذات العلامات الفلورية [24]. معظم هذه البرامج ليست مفتوحة المصدر ، وقد يكون من الصعب تكييفها مع الأغراض المحددة لتجربة معينة. في حالات أخرى ، قد يكون تعقيد الإجراءات الرياضية المستخدمة لتعريف الحدود عقبة أمام تكييف الكود مع غرض محدد [2] [20] [17]).

الجدول 1

نظرة عامة على البرامج التمثيلية لتتبع الخلايا عن طريق الفحص المجهري للضوء الزمني.

برنامجالناشر / البائعتجاريالمصدر المفتوحتنسيق تنسيق الإخراج
الشجاعةالارتجالنعملانص
إماريسBitplaneنعملااكسل
Autozell [11] جامعة & # x000e4t بريمننعملانص
TLA [12] جامعة أولملانعماكسل / نص
سل تراك [13] جامعه ولايه اوهيولانعمنص
ملحقات ImageJ [14] ETH & # x00026 UCSFلانعمنص

هناك طريقتان رئيسيتان لتتبع الخلايا في الحالة الحالية [25] [21] [16] [20] [26] [18]. أحد الأساليب هو تجزئة الصورة إطارًا بإطار وتتبعها [15] [27]. في الخطوة الأولى ، يتم اكتشاف العناصر المرشحة في إطار معين على أساس خصائصها المحددة (الحدود ، والملمس ، واللون). يكون هذا الأسلوب فعالًا عندما تكون حدود الكائن حادة ، ويتم استخدامه بشكل شائع مع الخلايا ذات العلامات الفلورية وغيرها من الصور عالية التباين. تتمثل الطريقة الأخرى في تحسين شكل نموذج ذي معلمات لملاءمة النموذج مع الخلايا الموجودة في الإطار. بدلاً من تتبع جميع الكائنات في الإطار ، تركز هذه الطريقة على تلك العناصر المرشحة التي تتوافق مع شكل النموذج المختار [28] [29]. كما هو الحال مع النهج الأول ، يتم إقران الكائنات المكتشفة بين إطارات متتالية لإنتاج مسارات.

من أجل معالجة مشكلة إزالة الخلفية ، ومقارنة أداء البرامج المختلفة على البيانات الحقيقية مقابل خط الأساس الذي نفهمه ونتحكم فيه تمامًا ، نقدم هنا برنامجًا جديدًا لتتبع الخلايا ، والذي نسميه PACT (rogram لـ & # x00100 آليًا ell الأرفف). يعد PACT مناسبًا لتتبع الخلايا المتحركة على الأسطح المسطحة وذات البنية النانوية ، وهو بسيط بما يكفي للمستخدمين لتعديله بحرية وفقًا لاحتياجاتهم التجريبية. نظرًا لأن الأسطح ذات البنية النانوية تحظى حاليًا باهتمام كبير باعتبارها ركائز ثقافة الخلية ويمكن أن تظهر كخلفية غير موحدة للغاية في الصورة ، فإننا نشدد على استخدام مرشح صور مكاني موثوق هنا & # x02013 انظر التفاصيل في قسم المواد والأساليب ، و ملف SuppInfo.zip لرمز ماتلاب.

يتم عرض نتائج الاختبار لأداء PACT ، والتي تتم مقارنتها أيضًا بأداء البرامج الأخرى (TLA [12] و أوتوزيل [11]): الكفاءة فيما يتعلق باكتشاف الأشياء ، ودقة تحديد المواقع النقطية ، وأداء التجزئة في سياق تحليل الفاصل الزمني. ثم يتم إجراء تحليل إحصائي على مجموعة المسارات الفردية للخلايا لتحديد إحصائيات حركية مجموعة الخلايا الإجمالية في فيلم من الخلايا الليفية NIH 3T3 على الزجاج. من المسارات ، يتم تقدير دالة التغاير التلقائي للسرعة (المعادلة S1 في معلومات الملحق). يتم وصفه جيدًا بواسطة دالة أسية بسيطة ذات وقت مميز ، ص، ال إصرار زمن من الحركة (البيانات الموضحة في قسم المعلومات الملحق 4). نحدد أيضًا سعة دالة التغاير التلقائي للسرعة ، & # x003c60، والتي تساوي تقريبًا متوسط ​​السرعة المربعة للخلايا. تتم مقارنة نتائج هذا التحليل التي تم الحصول عليها باستخدام PACT و TLA و Autozell.

على الرغم من الحاجة إلى برامج وخوارزميات تتبع الخلايا ، وجدنا القليل من الدراسات لتقييم أدائها [11] [12] [26]. على حد علمنا ، هذه الورقة هي أول تحليل مقارن لبرامج التتبع مع نطاق توفير إجراءات موثوقة للحصول على البيانات لتطوير نماذج الحركة. وجدنا حساسية كبيرة للنتائج للخوارزمية المحددة / البرنامج المستخدم. وبالتالي ، يجب توثيق خوارزمية التتبع وتأثيرها على النتائج بشكل جيد في الدراسات المستقبلية ، على سبيل المثال كما هو موضح في هذه الدراسة.


2. التنفيذ

تم تلخيص النهج العام للتحليل التكاملي للحركة بواسطة TIAM في الشكل & # x000a01. تم تنفيذ خوارزميات الكشف والتتبع واستخراج الميزات وتحرير المسار في MATLAB (من MathWorks). تم تنفيذ واجهة المستخدم لتسهيل مدخلات المستخدم في Java. تم تنفيذ واجهة مستخدم ثانية للتصور الديناميكي للأفراد أو أزواج المسارات في MATLAB. تم إيداع مشروع برنامج TIAM في GitHub للوصول المجاني إلى كود المصدر (https://github.com/willieneis/TIAM). يتم توفير دليل مستخدم مفصل وعرض توضيحي ورابط URL لمجموعات البيانات المعيارية في مستودع جيثب. يمكن العثور على وصف إضافي للخوارزميات في قسم الطرق التكميلية.

نظرة عامة على مخطط تكامل البيانات في TIAM. تستخدم الصور الضوئية المرسلة للكشف عن الخلايا وتتبعها. يتم حساب العديد من المعلمات التي تحدد خصائص الحركة وتخزينها في مصفوفات MATLAB & # x000a0 & # x02018cell & # x02019. يتم أخذ المسارات الفردية في الاعتبار لاستخراج المعلومات من صور الانعكاس والفلورة التي تعد جزءًا من بيانات الفاصل الزمني متعدد القنوات. يتم استخدام Centroids من مواقع المسار للتجزئة المحلية وتحديد الخطوط العريضة التي تتوافق مع الخلية قيد الدراسة. يتم حساب الميزات من المناطق المحددة وتخزينها مع بقية المعلومات المتعلقة بالمسار.

2.1. كشف الخلايا

تم تجهيز TIAM لاكتشاف وتعقب الخلايا في سلسلة صور الضوء المنقولة ، مثل تلك المكتسبة عن طريق المجال الساطع أو تباين التداخل التفاضلي (DIC) أو الفحص المجهري لتباين الطور. لقد اخترنا هذا النهج لأسباب متعددة: أ) قد يكون من الصعب تمييز حدود الخلايا من معلومات التألق عندما تكون الخلايا في بيئة مزدحمة ، وتضمن الطبيعة المتأصلة للتصوير الضوئي المرسل أن توفر حدود الخلية بعض التباين حتى في بيئة مزدحمة. ب) استخدام التصوير الضوئي المرسل لتتبع الخلايا يحرر قناة الفلورة للحصول على معلومات إضافية حول سلوك الخلايا. ج) استخدام المجهر الضوئي المرسل بدلاً من الفحص المجهري الفلوري يسمح بتصوير الخلايا الحية على المدى الطويل حيث يتم تقليل السمية الضوئية.

تتضمن إستراتيجية اكتشاف الخلايا في TIAM العثور على أنماط على شكل خلية في مجموعة الحواف المكتشفة في الصورة. يتم استخدام مرشح Canny edge (Canny ، 1986) لإنتاج صورة ثنائية تصور جميع الحواف في إطار فيديو معين ، ويعمل تحويل Hough الدائري (CHT) (Duda and Hart ، 1972) على هذه الصورة الثنائية لاكتشاف الخلايا الفردية ( الشكل & # x000a02 a & # x02013d). تم تطبيق هذه الإستراتيجية المكونة من خطوتين سابقًا للكشف عن النوى في أجنة أسماك الزيبرا (Melani et al. ، 2007). يعد تحويل هوغ طريقة قوية لاكتشاف المنحنيات ذات المعلمات في الصور ، حيث يتم تحويل مهمة اكتشاف الأنماط المعقدة للبكسل (مشكلة بحث عالمية مكلفة) إلى مهمة إنشاء قمم في مساحة المعلمة. ينفذ تحويل Hough عملية التصويت ، حيث يقوم كل بكسل حافة بإدلاء الأصوات على معلمات المنحنى التي تتوافق معها بعد ذلك ، ويتم إرجاع المواقع الموجودة في مساحة المعلمة التي حصلت على عدد كافٍ من الأصوات. يمكن اعتبار الحد الأقصى المحلي في مساحة المعلمة هذه بمثابة النقط الوسطى للخلايا. هذه الاستراتيجية مفيدة لاكتشاف الخلايا ذات الحدود منخفضة التباين نظرًا لقدرة CHT على اكتشاف الأشكال بناءً على مجموعة الحواف غير المتجاورة والجزئية. علاوة على ذلك ، فإنه يتجاوز الحاجة إلى تجزئة الخلايا الفردية وبالتالي يساعد في دقة الكشف في البيئات عالية الكثافة (الشكل S1 على سبيل المثال). لقد استخدمنا تنفيذ Tao Peng لـ CHT (CircularHough_Grd من مستودع MATLAB لتبادل الملفات) حيث أنه يعتبر نطاق نصف قطر أثناء عملية التصويت ويتضمن معلمة إضافية للبحث عن الحد الأقصى على الأشكال الدائرية غير الكاملة. وفقًا لذلك ، وجدنا أن تطبيقنا للكشف عن الخلايا التائية المستقطبة وكذلك الخلايا من مختلف الأنواع والتشكيلات وبكثافات خلوية مختلفة في الصور التي تم الحصول عليها من خلال تقنيات الفحص المجهري الضوئي الثلاثة المذكورة أعلاه (الشكل & # x000a02 ، الشكل S1 ، الشكل. S2 ومقاطع الفيديو S1 & # x020133). يتم وصف المعلمات الفردية المتضمنة في خطوة الكشف بشكل أكبر في قسم الطرق التكميلية. يتم أيضًا توفير قيم المعلمات المستخدمة عادةً في تجارب التصوير بالخلايا التائية.

كشف وتتبع الخلايا بواسطة TIAM. يستخدم TIAM الصور الضوئية المرسلة للكشف عن الخلايا وتتبعها. تم توفير رسم توضيحي للكشف عن طريق TIAM مع مثال (a & # x02013d). يتم استخدام صورة مدينة دبي للإنترنت لخلايا CD8 T الأولية البشرية (أ). تمثل الألواح ، من ب إلى د ، مراحل متسلسلة أثناء اكتشاف الخلية. في الخطوة الأولى ، يتم تطبيق مرشح حافة Canny لإنشاء صورة ثنائية لحدود الخلية (ب). بعد ذلك ، يتم تطبيق تحويل Hough الدائري (CHT) على هذه الصورة الثنائية. تقوم هذه العملية بتعيين الخطوط العريضة للخلية إلى نقاط في مساحة المعلمة بناءً على مخطط التصويت (ج). يتم استخدام الحدود القصوى المحلية في مساحة المعلمة لاختيار النقط الوسطى للخلايا (د). يحتوي TIAM على واجهة مستخدم رسومية ترشد المستخدم من خلال اختيار المعلمات لتصفية الحواف و CHT للسماح بالكشف الدقيق عن الخلايا.

الاكتشاف الناجح أمر بالغ الأهمية لجميع الخطوات الحسابية التالية. لذلك قمنا بتطوير واجهة مستخدم رسومية في Java لتغيير معلمات مرشح Canny-edge و CHT بشكل تفاعلي لتحقيق اكتشاف ناجح للخلايا في الصور الضوئية المرسلة. يقدم دليل المستخدم مثالاً على هذه العملية للمساعدة في التحديد البديهي لقيم المعلمات. يُطلب من المستخدم ضبط حجم الصورة بحيث يكون حجم الخلية مشابهًا للمثال الوارد في دليل المستخدم. يحاول هذا التأكد من أن نطاق نصف القطر الافتراضي المستخدم أثناء عملية التصويت على تلال تشيتاجونج يعمل بشكل جيد. وبالمثل ، يمكن اختيار كشف الحواف ومعلمات CHT الإضافية من خلال المقارنة مع أمثلة الصور لهذه المراحل. يتم تحويل مواضع النقطه الوسطى إلى المقياس الأصلي في نهاية خطوة الكشف ، قبل متابعة تتبع الخلايا.

2.2. تتبع

يتم إجراء التتبع في TIAM على خطوتين. في الخطوة الأولى ، يتم تطبيق خوارزمية اقتران أقرب الجيران المعدلة على مخرجات خطوة اكتشاف الخلية للحصول على مسار قصير & # x02018segments & # x02019 (الشكل S3a). في كل خطوة زمنية ر، ترتبط كل خلية بأقرب خلية مكانية مكتشفة للخطوة الزمنية السابقة ر& # x000a0 & # x02212 & # x000a01 ، بشرط أن تكون أقرب خلية مكتشفة ضمن أقصى مسافة مسموح بها ص. تستمر هذه العملية بهذه الطريقة فقط عندما تكون الخلايا منفصلة بشكل كافٍ ولا يوجد غموض في التتبع. إذا كان هناك أكثر من خلية واحدة داخل ص، تقوم الخوارزمية بإرجاع مقطع المسار الذي تم إنتاجه حتى هذا الإطار وتبدأ مسارات جديدة مع الخلايا المجاورة التي تسببت في الغموض. يحدث هذا عادةً في الحالات التي تعبر فيها الخلايا مسارات أو عندما تكون موجودة بكثافة محلية عالية. وبالتالي ، تمثل مقاطع المسار هذه تسلسلات يمكن للخوارزمية أن توفر نتائج تتبع عليها بثقة. فضلنا أقرب خوارزمية مجاورة لبساطتها وحدسها ، سواء في التنفيذ أو الأداء ، عند مقارنتها بأحدث أساليب التتبع القائمة على النموذج. بالإضافة إلى ذلك ، نفضل استخدام فترات زمنية أطول لتقليل السمية الضوئية أثناء التصوير بفاصل زمني متعدد القنوات طويل المدى (أكثر من ساعة). نظرًا لكون الخلايا التائية شديدة الحركة ، فقد لا توفر الفواصل الزمنية الأطول خلايا متداخلة في إطارات لاحقة ، وهو مطلب مقيد للتقنيات القائمة على التطور الكنتوري (Padfield et al. ، 2011). على الرغم من فشل خوارزمية الجوار الأقرب في الأداء الجيد في كثافات الخلايا العالية ، كما تمت مناقشته لاحقًا ، فقد حصلنا على تتبع دقيق لحوالي خمسين خلية في مجال الرؤية.

في الخطوة الثانية ، يتم استخدام خوارزمية التخصيص لربط الأجزاء الأقصر من طرف إلى طرف في مسارات خلوية أطول (الشكل S3b). من أجل إجراء الانضمام إلى المقطع ، يتم تحديد التشابه أولاً بين كل زوج من المقاطع بناءً على عوامل التوافق مثل إطار البداية / النهاية والموقع والسرعة. ثم يتم استخدام الخوارزمية المجرية (Munkres ، 1957) للعثور على رسم خرائط مثالي عالميًا بين المقاطع بناءً على مصفوفة التشابه (Bise et al. ، 2011 Jaqaman et al. ، 2008 Perera et al. ، 2006). من بين هذه التخصيصات المعينة ، يتم ضم المقاطع فقط إذا كان تشابهها أعلى من بعض العتبة. يهدف النهج المكون من مستويين للتتبع إلى أن يكون فعالًا من الناحية الحسابية من خلال تنفيذ خوارزمية غير متطورة وجشعة لأقرب جار عندما يكون سيناريو التتبع بسيطًا ، ومجموعة أكثر تعقيدًا من العمليات الحسابية باستخدام نتائج الجوار الأقرب عندما يكون سيناريو التتبع غامضًا.

تم شرح خوارزميات التتبع بالتفصيل في قسم الطرق التكميلية جنبًا إلى جنب مع قيم المعلمات المستخدمة. معلمات خوارزميات التتبع مشفرة في TIAM. لكننا قدمنا ​​معلومات في دليل المستخدم عن مكان تغيير قيم المعلمات في الكود إذا رغبت في ذلك. يمكن تحديد المعلومات الخاصة بسلسلة الصور من خلال واجهة المستخدم الرسومية من أجل حساب خصائص حركية الخلايا (انظر دليل المستخدم).

2.3 ميزة استخراج وتكامل البيانات

تم تصميم TIAM للاستفادة من سلسلة الصور متعددة القنوات من أجل استخراج معلومات إضافية عن الخلايا المتعقبة لتسهيل التحليل التكاملي وتقديم رؤى حول حركة الخلايا التائية. تهدف خوارزميات استخراج الميزات المطبقة في TIAM إلى استرداد الميزات المادية مثل منطقة التعلق ببعض الركيزة الأساسية (من قناة الانعكاس) ، والقطبية (من قناة الضوء المرسلة) ، وشدة التألق (من ما يصل إلى قناتين مضان) ، وقم بتخزينها / الإبلاغ عنها جنبًا إلى جنب مع خصائص الحركة مثل سرعة الخلية وزاوية الدوران ومعامل التوقف ومؤشر الحبس (انظر الطرق التكميلية للحصول على الوصف). توفر واجهة المستخدم خيارات لتحديد القنوات والميزات المراد استخراجها (انظر دليل مستخدم TIAM). نظرًا للمنظور المتسق لجميع قنوات الصور ، يمكن ربط نتائج التتبع من قناة الصورة الضوئية المرسلة مباشرةً بالقنوات الثانوية. يتم استخدام النقطه الوسطى للخلايا التي تم استنتاجها في خطوة الكشف لربط معلومات البكسل المحلية من هذه القنوات الثانوية بالمسارات (الشكل & # x000a01).

يعد تمييز كفاف الحدود لخلية معينة إجراءً شائعًا يتم تطبيقه على أي من قنوات الصور ، والتي يمكن تعريفها على أنها منطقة الاهتمام (ROI) لحساب الميزات المرغوبة من قناة الصورة تلك. بالنظر إلى موضع النقطه الوسطى ، يتم استخدام مربع مربع بحجم محدد مسبقًا حول النقطه الوسطى لعزل الصورة المحلية وتحديدها. تحتوي هذه الصورة المحلية بشكل مثالي على خلية الاهتمام فقط. بالنسبة لقنوات الانعكاس والفلورة ، يتم تجزئة الصورة المحلية عبر طريقة Otsu (Otsu ، 1979) لإعطاء حدود الخلية في تلك القناة. من أجل تجاهل وحدات البكسل المرتبطة بأجزاء تلامس الخلايا المجاورة ، يتم استخدام خوارزمية Watershed (Meyer ، 1994) في تحويل المسافة للصورة المجزأة الأولية. بالنسبة لقناة الضوء المرسلة ، يتم استخدام اكتشاف حافة Canny (Canny ، 1986) أولاً لتمييز حدود الخلية في الصورة المحلية. من أجل تجاهل وحدات البكسل المرتبطة بأجزاء تلامس الخلايا المجاورة ، يتم استخدام خوارزمية مستجمعات المياه في CHT لصورة الحافة. تعتبر أكبر منطقة محددة بواسطة خوارزمية مستجمعات المياه والتي تقع النقطه الوسطى ضمن مسافة معينة من مركز المربع بمثابة الخلية ذات الأهمية.

تم تنفيذ نهج التقسيم المحلي في المقام الأول للتعامل مع سلسلة صور الانعكاس التي تميل إلى أن يكون لها قيم متغيرة مكانياً للبكسل في المقدمة والخلفية ، مما يحول دون استخدام العتبة العالمية. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أثناء عملية التنفيذ أن خوارزمية مستجمعات المياه كانت أكثر موثوقية في الصور المحلية من الصور العالمية.

2.4 ميزات إضافية في TIAM

يسمح TIAM بمعالجة الدُفعات لمجموعات البيانات التجريبية ويمكنه تلقائيًا التمييز بين أنواع الخلايا بناءً على ملصقات الصبغة الحيوية الفلورية التفاضلية (انظر الطرق التكميلية ودليل المستخدم). يوفر TIAM أيضًا خيار وجود قناة الصورة المحددة مع الخطوط العريضة للخلايا المتراكبة في سلسلة صور tiff. يمكن أن يوفر هذا تقييمًا مرئيًا لجودة تجزئة الخلايا الفردية في تلك القناة. يتم توفير واجهة مستخدم قائمة بذاتها تعتمد على MATLAB لتصور فردي أو أزواج من المسارات في وضع الفيديو (انظر دليل المستخدم). يسمح هذا بالفحص اليدوي لنتائج التتبع من TIAM. تهدف واجهة المستخدم هذه أيضًا إلى المساعدة في التسجيل اليدوي لأرقام المسار والإطارات للتصحيحات المطلوبة في تعيينات المسار. يوفر TIAM أيضًا ميزة تحرير المسار المستقلة التي تستخدم القوائم المجمعة يدويًا للتصحيحات المطلوبة في مهام المسار (انظر دليل المستخدم). تعد خوارزمية تحرير المسار عملية من خطوتين ، حيث يتم تقسيم المسارات أولاً عند إطارات محددة (الشكل S4). ثم يتم ضم المسارات و / أو المسارات الفرعية المحددة ، إما الناتجة عن الأعطال في الخطوة الأولى أو تلك التي فاتتها الخوارزمية ، معًا. يوفر Icy ، وهو نظام أساسي لتحليل الصور مفتوح المصدر ، مكونًا إضافيًا لعرض وتحرير المسارات (de Chaumont et al. ، 2012).

2.5 تقييم أداء الكشف والتتبع

يقارن تقييم الأداء ، الذي يشار إليه أيضًا باسم تحليل الأداء ، في تحليل الصور النتائج التي تم الحصول عليها من إجراء مؤتمت مقابل الحقيقة الموضوعة يدويًا & # x02018ground & # x02019. هنا ، يمثل مسار الحقيقة الأرضي & # x02018true & # x02019 مواضع الخلية كسلسلة من المربعات المحيطة. استخدمنا برنامج موارد تقييم أداء الفيديو (ViPER) (Doermann and Mihalcik ، 2000) لرسم المربعات المحيطة يدويًا حول الخلايا في كل إطار فيديو وفهرسة تسلسل المربعات المحيطة المقابلة لكل خلية على حدة لتحديد المسارات.

تم استخدام مقاييس تقييم الأداء لتقييم كمي وشامل لأداء الكشف والتتبع لـ TIAM وأدوات الطرف الثالث. استخدمنا مقاييس دقة اكتشاف إطار التسلسل (SFDA) ومتوسط ​​دقة التتبع (ATA) (Kasturi et al. ، 2009) حيث يمكن حسابها بطريقة مؤتمتة بالكامل وبالتالي تتيح القياس الكمي القابل للتكرار لنجاح اكتشاف وتعقب شاء. علاوة على ذلك ، فهم لا يعانون من خطر الخطأ البشري أو التحيز. تم اعتماد هذه المقاييس كمقاييس موحدة بواسطة برنامج تحليل الفيديو واستخراج المحتوى (VACE) (http://marathon.csee.usf.edu/vace-links.html) وتصنيف الأحداث والأنشطة والعلاقات (CLEAR) ) اتحاد (www.clear-evaluation.org) وهما جهدان واسعان النطاق على مستوى المجتمع يهتمان بتتبع الفيديو وتحليل التفاعل. تستند المقاييس إلى تشابه Jaccard (الشكل S5 للتوضيح البديهي والطرق التكميلية للوصف الرياضي). من أجل حساب الهيئة العامة للغذاء والدواء و ATA ، يجب إنشاء تطابق واحد لواحد بين الحقيقة الأساسية والنتيجة. لإنشاء هذا التعيين ، استخدمنا الخوارزمية المجرية (Munkres ، 1957) بمقاييس تستند إلى تشابه Jaccard المستخدم لإنشاء مصفوفة التشابه (انظر الطرق التكميلية للحصول على التفاصيل).

لقد قمنا بدمج إجراءات البرنامج لإجراء تحليل الأداء في مجموعة منفصلة قائمة على MATLAB نطلق عليها PACT (تحليل أداء تتبع الخلية). يتوفر كود PACT ودليل المستخدم ومجموعات بيانات الحقيقة الأساسية ذات الصلة على https://github.com/willieneis/TIAM/tree/master/PACT/. يتضمن دليل المستخدم أيضًا إرشادات محددة حول استخدام ViPER للتعليق التوضيحي للحقيقة الأساسية.

2.6. تقييم أداء استخراج الميزات

تم أيضًا تقييم أداء استخراج الميزات مقابل الحقيقة الأساسية. تم إدراج الخطوط العريضة المرسومة يدويًا أو عن طريق الإجراءات شبه الآلية في ImageJ (Schneider et al. ، 2012) على أنها ROIs واستخدمت كحقيقة أساسية (انظر الطرق التكميلية للحصول على التفاصيل). تم الحصول على مراسلات فردية بين الخلايا الفردية في الحقيقة الأرضية ونتائج TIAM باستخدام الخوارزمية المجرية (Munkres ، 1957). تم إنشاء مصفوفة التشابه للخوارزمية المجرية لكل إطار باستخدام المسافة بين النقطتين الوسطى لكل اقتران ممكن للخلايا في نتيجة TIAM مع تلك الموجودة في الحقيقة الأساسية. بمجرد تحقيق المراسلات الفردية ، تمت مقارنة الميزات الكمية التي تم الحصول عليها من الحقيقة الأساسية مع تلك الموجودة في TIAM.


المواد والأساليب

نظرة عامة على ICAnet

ICAnet هي أداة تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية تعتمد على الوحدة النمطية ، وهي مصممة للتكامل والتجميع وتحليل الشبكة. تدمج هذه الأداة معلومات التعبير الجيني وشبكة PPI عالية الجودة بطريقة جديدة لاستعادة مشهد أطلس التعبير أحادي الخلية بدقة. يتكون ICAnet من ثلاث خطوات رئيسية: (1) المعالجة المسبقة لمصفوفة التعبير الجيني والتحلل (2) تجميع برامج التعبير عبر الدُفعات و (3) تحديد "الشبكة الفرعية" (الوحدة النمطية) المستندة إلى Walk-trap. يتم وصف تفاصيل هذه الخطوات الرئيسية على النحو التالي.

مصفوفة التعبير الجيني المعالجة المسبقة والتحلل

تطبيع التعبير الجيني

تتطلب ICAnet مصفوفات التعبير الجيني أحادية الخلية كمدخلات ، والتي يتم تطبيعها بعد ذلك من خلال خطوة معالجة مسبقة قياسية (تطبيع السجل لجميع مصفوفات التعبير الجيني باستخدام عامل الحجم 10000 لكل خلية ، سجل2CP10K). يمكن للمستخدمين أيضًا تحديد أنواع أخرى من قياس التعبير الجيني (مثل TPM أو RSEM) وطرق التطبيع (على سبيل المثال SCTransfrom) قبل تشغيل الخطوات الأساسية اللاحقة لـ ICAnet.

تقليل الضوضاء من مصفوفة التعبير الجيني

في كل مجموعة بيانات مستخدمة للتكامل أو التجميع ، تهدف ICAnet إلى تحديد الإشارات البيولوجية من مصفوفات التعبير الجيني وتحديد أنماط التعبير المشتركة. بالنسبة للدفعات المختلفة من مجموعات البيانات ذات المستويات المختلفة من تباين البيانات ، سيؤثر تباين تباين البيانات سلبًا على مقارنات برامج التعبير عبر مجموعات البيانات المختلفة ، لأن جزءًا من تباين البيانات (الإشارة) مدفوع بتناثر البيانات ، وليس الإشارة البيولوجية الفعلية ( 30). لتقليل التداخل من تباين البيانات ، نفذت ICAnet استراتيجيتين بديلتين: (1) أعلى الحوسبة ك الجينات المتغيرة لكل دفعة وفقًا لمعامل التباين لكل جين ، مع أخذ مجموعة التقاطع لجميع مجموعات الجينات المتغيرة كمجموعة الجينات المصفاة ، واستخدام ملف تعريف التعبير المقابل لأداء ICAnet (2) باستخدام وحدة Python التي تم تطويرها مؤخرًا ( اسم الشيئ بطريقة عشوائية) استنادًا إلى نظرية المصفوفة العشوائية لتقليل التشويش على مجموعة البيانات (30) ، والتي تعمل بكفاءة عالية في التخلص من الإشارات التي تحركها خلية مفردة (30). استخدمناها لإزالة التشويش من مجموعة البيانات في البداية لمنع تأثير تباين البيانات على تحلل المصفوفة في شبكة ICAnet. في هذه الدراسة ، طبقنا فقط خطوة تقليل الضوضاء للمعالجة المسبقة على مجموعات بيانات جزيرة البنكرياس scRNA-seq لتحسين أداء تصحيح تأثير الدُفعات في ICAnet ، لأن مجموعات البيانات هذه تم إنشاؤها من أنواع مكتبات مختلفة ولكل مجموعة بيانات درجات مختلفة من تباين البيانات.

استخراج الإشارات البيولوجية عن طريق تحليل المكونات المستقلة

لتحديد الإشارات البيولوجية (برامج التعبير) في مجموعة البيانات ، استخدمنا ICA لتحليل مصفوفات التعبير الجيني إلى برامج التعبير الجيني. يعد عدد برامج التعبير معلمة مهمة جدًا في ICAnet ، لذلك اقترحنا طريقة غير خاضعة للإشراف تستند إلى نظرية المصفوفة العشوائية (31 ، 32) لتحديد هذه المعلمة (انظر الملاحظات التكميلية ، القسم 1 في المواد التكميلية). تم توسيط كل مجموعة بيانات قبل إجراء ICA لتحلل المصفوفة. يمكن استخدام تطبيقين مختلفين لـ ICA بواسطة ICAnet. التنفيذ الأول هو التشخيص التقريبي المشترك لمعايير eigenmatrices (JADE) (33). تتمثل الميزة الرئيسية لـ JADE على حلول التنفيذ الأخرى في أنها تستند إلى حسابات المصفوفة التي تتضمن قطرية المصفوفة ، مما يؤدي إلى مكونات غير عشوائية. تعتمد الخوارزميات الأخرى (مثل FastICA) على إجراء التحسين (مثل نقاط البداية ومسارات التحسين) (34) ، وبالتالي ، قد تسفر عن نتائج متغيرة. يعتمد التنفيذ الثاني على الحزمة R. MineICA (25) ، والتي تستخدم نفس الإستراتيجية مثل إيكاسو، للتخفيف من مشكلة العشوائية عند تشغيل FastICA (35) من خلال تجميع المكونات التكرارية. في هذه الدراسة ، استخدمنا ICA المستندة إلى JADE لتحليل مصفوفات التعبير الجيني إلى مكونات مستقلة (مصفوفة المصدر) ، وأوزان الجينات (أهمية) لكل مكون لها تباين وحدة وتعني صفر.

تجميع برامج التعبير عبر الدُفعات

تجميع برامج التعبير عبر دفعات للعثور على إشارات بيولوجية مشتركة

تتمثل إحدى الميزات الرئيسية لـ ICAnet في تجميع المكونات المستقلة (أو برامج التعبير) عبر مجموعات البيانات / الدفعات المختلفة. أولاً ، تم إجراء ICA بشكل مستقل على كل مجموعة بيانات / دفعة. بعد ذلك ، تمت مقارنة المكونات المستقلة المحسوبة من مجموعتين (أو أكثر) من مجموعات البيانات أحادية الخلية عن طريق حساب معامل ارتباط بيرسون بين أوزان الجينات المقابلة للجينات المحددة (قيمة الإسقاط و gt 2.5 الانحرافات المعيارية في المكون المحدد). بعد تجميع المكونات من مجموعات بيانات / دفعات مختلفة ، تم استخدام خوارزمية التقسيم حول Medoids (PAM) (36) بمتوسط ​​عرض صورة ظلية لتقدير العدد الأمثل لأنماط التعبير. أخيرًا ، تم اختيار الوسائط على أنها "البرامج الأساسية" التي يتم مشاركتها عبر مجموعات لزيادة وزن الشبكة.

تنشيط تحديد "الشبكة الفرعية" (الوحدة النمطية)

بناء شبكات PPI الموزونة مع البرامج القاعدية المشتركة عبر دفعات

في الخطوة التالية ، قمنا بدمج شبكات PPI وبرامج التعبير لدمج معلوماتهم. The PPI networks were obtained from the STRING database, a common and widely used PPI database ( 37). In this analysis, we used a threshold of a combined interaction score >600 to filter interactions, which is also a commonly used criterion for obtaining credible PPI networks ( 12, 38).

Those genes that significantly contribute to each expression program have been defined previously as the ‘activated genes’, which are identified using a weight threshold of three or four standard deviations from the mean. Here, we constructed weighted PPI network to produce activated sub-networks (or modules), wherein the edge-weight density is significantly greater than the rest of the network. We used the same weight scheme that used previously in computational epigenome model research ( 39). Specifically, for each component, the absolute weight value of each gene was determined and defined as ICA statistic |$(IC)$|⁠ . Assuming genes ز و ح are connected in the PPI, we assigned the edge weight as the average of the individual node (or gene) statistics, i.e. |$<>> = frac<1><2> ( <>+ IC> )$|⁠ . To avoid prohibitive computational expenditures, we only assigned the edge weights to the edges with endpoint ICA statistics that passed the weight threshold and zero was assigned to other edges. The weight threshold can be manually adjusted, and in this analysis, we set it as 2.5 standard deviations from the mean.

Random walk trapping to identify sub-networks in weighted PPIs

To rapidly and robustly identify dense connected and activated sub-networks, we used the random walk approach ( 40) to decipher all the possible sub-networks (modules). We performed random walks of different lengths using our ICA statistics-weighted PPI networks and detected modules by applying walk-trap algorithm on each random walk-based distance matrix. All the detected modules greater than three were saved and pooled together as module sets. We then applied the AUCell algorithm to the raw single-cell datasets to construct activated module–cell matrix that calculates the enrichment of each module in each cell as an area under the recovery curve (AUC) across the expression value-based rankings of all or some of the genes. The cell–module activity is summarized in a matrix (termed as module activity matrix) wherein columns represent single cells and rows represent the predicted modules.

Evaluation of clustering performance

Adjusted Rand Index (ARI)

When cell labels and batch information are available, the ARI can be used to calculate the similarity between the ICAnet clustering result and the known cell or batch labels (see Supplementary Notes, Section 2 in the Supplementary Materials).

Inverse Simpson's Index (LISI)

We used a score metric, named as LISI, to measure local diversity based on local neighborhood distribution (See Supplementary Notes, Section 2 in the Supplementary Materials). This index represents the expected number of cells that need to be sampled before neighboring cells are drawn from the same batch. The greater the score, the stronger the local batch_ID (iLISI) or cell_type (cLISI) heterogeneity is.

Clustering methods for cell states identification

For the cell states identification benchmark task, several methods were systemically compared. Before running clustering methods, we used count per million to derive a normalized count matrix. For t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)+ك-means, pcaReduce and SC3, we used a log-transformed dataset and adjusted the number of clusters to optimize the clustering performance, which was evaluated by the ARIنوع من الخلايا. For SINCERA, we used z-score normalized data for the clustering analysis, and we also adjusted the number of expected clusters to optimize the ARIنوع من الخلايا القيم. For Seurat, we used the Seurat packages and processed related datasets in accordance with the tutorial (https://satijalab.org/seurat/v3.2/pbmc3k_tutorial.html). We then performed cell clustering multiple times using Louvain clustering with multi-level refinement algorithms on a shared-nearest-neighbor-based cell graph, during which we adjusted the parameter resolution for the maximal ARIنوع من الخلايا. Three module-based clustering methods, SCENIC, SCORE and ICAnet, were compared in this study. All these methods quantified module activity based on AUCell. We ran each method and used the same aucMaxRank parameters to derive a module-based activity matrix.

For each clustering method, we used two variable gene selection criteria: the Top 5000 genes with the largest coefficient of variation, and the whole gene set. We then performed the above variable gene selection steps separately to select the criterion that produced the best clustering performance. For each test dataset, we re-analyzed the identifying novel rare cell types using Louvain clustering with a multilevel refinement algorithm ( 7) on a shared-nearest-neighbor-based cell graph derived from the module activity matrix to infer cell expression state.

Clustering methods for multi-batch datasets integration

In benchmarking different multi-batch integration methods, we used Louvain clustering with multilevel refinement algorithms on a shared-nearest-neighbor-based cell graph for each method, and adjusted the resolution parameter to obtain the optimal ARIنوع من الخلايا القيمة. We then calculated corresponding LISI, iLISI and ARIحزمة القيم. Additionally, for methods that correct batch effects on the Uniform Manifold Approximation (UMAP) space but not on the gene expression or PCA space in our study [e.g. BBKNN(41)], we applied Hierarchical DBSCAN + UMAP to cluster cells, and adjusted the parameters minPts to optimize the cell-clustering performance for comparisons.

Identification of cell type-specific activated modules

To identify activated modules for each cell type, we first identified cell type-associated modules using a receiver operating characteristic (ROC) curve analysis ( 7). For each gene, we evaluated a classifier that was built on that module alone, to distinguish a specific group of cells from other cells. An AUC value close to 1 indicates that this module is more specifically expressed in a specific cell group. We implemented the above analysis using the FindMarker function provided by Seurat ( 7), with AUC > 0.75 as a threshold to call cell type-associated modules. Then, among the cell type-associated modules, continuous module activity was converted into binary values using AUCell ( 11) and the Spearman's correlation coefficient between each cell type and the binarized module were calculated. The modules with Spearman's coefficient < 0.3 were filtered out. Finally, the resulting modules with statistical significances greater than the threshold (ص-value < 0.05, see Supplementary Notes, Section 5 in the Supplementary Materials) were selected and defined as cell type-specific activated modules.

Stability and robustness evaluation of three module-based clustering algorithms

To test the stability of three module-based clustering algorithms [ICAnet, SCENIC ( 11) and SCORE ( 12)], we performed two different tests: (i) down-sampling the datasets with varied cell numbers (2000, 1000, 500 and 100) and (ii) simulation of low-sequencing depth by reducing the expression level to one-fifth of the original. We used the same down-sampling and gene expression simulation procedures for all the three tested methods, and the tSNE+DBSCAN clustering algorithm was performed to evaluate the newly predicted clusters. Finally, we calculated the ARI between the labels of identified clusters and previously annotated cell-type labels. In the clustering step, we ran DBSCAN multiple times, during which we altered the parameter إبسيلون in the range of 1.0–4.0 and minPts in the range of 1–50 to determine a maximal ARI.

Module recovery analysis

For the ICAnet-weighted PPI network, a ك number of different weighted PPI networks were determined. An over estimation of the number of weighted PPI networks results in some false positives during module recovery therefore, we only computed the first independent component and created corresponding weighted PPI networks for the downstream analysis.

Label-association analysis using graph signal processing

To identify which is the novel cell type (or state) among our cell-type labeling results, the intrinsic ‘label association’ between our cell-type annotations and those defined by the original author need to be determined. Inspired by a recently proposed signal-enhancing model ( 44), we used graph signal smoothing to transform the binary ‘cell-type label signal’ into a continuous ‘cell-type label signal’ to enhance label association.

لذلك ، فإن ذ is the reconstructed continuous signal vector for cell type أنا. We applied graph smoothing to each cell type to derive their continuous signal vector, and calculated the Pearson's correlation matrix between our annotated cell types and those in the raw cell-type annotations. β was assigned a value of 0.8 in this step. Furthermore, we used cor’ = (1+cor)/2 to transform the correlation matrix, and used 0.6 (Pearson's correlation coefficient > 0.2) and the FDR (false discovery rate) < 0.05 as thresholds to identify significant associations.

تحليل تخصيب مجموعة الجينات

We used the software GSEA (version 4.1.0), a Java desktop application to assess potential enrichment of specific gene sets in a ranked list of differentially expressed genes for each cell type. The curated gene sets are consistent of cancer stemness/risk associated gene-sets ( 45) and AML risk-gene BAALC expression associated gene-set ( 46).

Survival analysis of acute myeloid leukemia (AML) patient based on module activity

To measure the activity levels of modules inferred from the scRNA-seq datasets in bulk RNA expression datasets, we first used gene set variation analysis (GSVA) ( 47) to calculate the module activity in each bulk sample. After converting the gene expression matrix into a module activity matrix, we selected the best subset of modules to predict survival in the training cohort. We used a linear regression model named Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO) implemented by the glmnet R package ( 48). By enabling a 10-fold cross-validation to fit a Cox regression model, we were able to identify an optimized set of modules to predict survival. Owing to the randomness of the LASSO model, we applied a bootstrapping strategy to score each module. This procedure generated 100 resampled datasets from the complete sample sets, with a sample size equal to 80% of the whole samples. LASSO was performed with 10-fold cross validation to optimize the parameters for module selection in each resampled dataset. Finally, we scored each module based on how frequent this module was selected by the regression model during bootstrapping. On the basis of the resulting scores, we selected the top-ك modules and performed PAM clustering on the samples guided by the selected feature modules to predict patient survival. We used the Top30 modules as AML patient-associated modules, because they yielded the most significant patient survival difference in the training dataset.


المواد والأساليب

Fermentation analysis

Two cultures of C. acetobutylicum ATCC 824 were grown in pH controlled (pH >5) bioreactors (Bioflow II and 110, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) [7]. Cell density, substrate and product concentrations were analyzed as described [56].

RNA isolation and cDNA labeling

Samples were collected by centrifuging 3-10 ml of culture at 5,000×g for 10 minutes, 4°C and storing the cell pellets at -85°C. Prior to RNA isolation, cells were washed in 1 ml SET buffer (25% sucrose, 50 mM EDTA [pH 8.0], and 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) and centrifuged at 5,000×g for 10 minutes, 4°C. Pellets were processed similarly to [7] but with the noted modifications. Cells were lysed by resuspending in 220 μl SET buffer with 20 mg/ml lysozyme (Sigma, St. Louis, MO, USA) and 4.55 U/ml proteinase K (Roche, Indianapolis, IN, USA) and incubated at room temperature for 6 minutes. Following incubation, 40 mg of acid-washed glass beads (≤106 μm Sigma) were added to the solution, and the mixture was continuously vortexed for 4 minutes at room temperature. Immediately afterwards, 1 ml of ice cold TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was added 500 μl of sample was diluted with an equal volume of ice cold TRIzol and purified. Following dilution, 200 μl of ice cold chloroform was added to each sample, mixed vigorously for 15 s, and incubated at room temperature for 3 minutes. Samples were then centrifuged at 12,000 rpm in a tabletop microcentrifuge for 15 minutes at 4°C. The upper phase was saved and diluted by adding 500 μl of 70% ethanol. Samples were then applied to the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), following the manufacturer's instructions. To minimize genomic DNA contamination, samples were incubated with the RW1 buffer at room temperature for 4 minutes. The method disrupted all cell types equally, as evidenced by microscopy (data not shown). cDNA was generated and labeled as described [7]. The reference RNA pool contained 25 μg of RNA from samples taken from the same culture at 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 44, 48, 54, 58, and 66 h.

تحليل ميكروأري

Agilent technology 22k arrays, (GEO accession number GPL4412) as described in [63], were hybridized, washed, and scanned per Agilent's recommendations. Spot quantification employed Agilent's eXtended Dynamic Range technique with gains of 100% and 10% (Agilent's Feature Extraction software (v. 9.1)). Normalization and slide averaging was carried out as described [7, 63]. A minimum intensity of 50 intensity units was used as described [63]. Microarray data have been deposited in the Gene Expression Omnibus database under accession number GSE6094. To gain a qualitative measure of the abundance of an mRNA transcript, the averaged normalized log mean intensity values were ranked on a scale of 1 (lowest intensity value) to 100 (highest intensity value). Genes were clustered using TIGR's MEV program [64].

Quantitative RT-PCR

Q-RT-PCR was performed as described [48]. Specific primer sequences are included in Additional data file 9 CAC3571 was used as the housekeeping gene.

Microscopy

For light microscopy, samples were stored at -85°C after 15% glycerol was added to the sampled culture. Samples were then pelleted, washed twice with 1% w/v NaCl and fixed using 50 μl of 0.05% HCl/0.5% NaCl solution to a final count of 10 6 cells/μl. Slides were imaged using a Leica widefield microscope with either phase contrast or Syto-9 and PI dyes (Invitrogen LIVE/DEAD BacLight Kit) to distinguish cell morphology.

For electron microscopy, samples were fixed by addition of 16% paraformaldehyde and 8% glutaraldehyde to the culture medium for a final concentration of 2% paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde. For cultures grown on plates, colonies were scraped from the agar and suspended in 2% paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4). Cultures were fixed for 1 h at room temperature, pelleted and resuspended in buffer.

For transmission electron microscopy, bacteria were pelleted, embedded in 4% agar and cut into 1 mm × 1 mm cubes. The samples were washed three times for 15 minutes in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4), fixed in 1% osmium tetroxide in buffer for 2 h, and then washed extensively with buffer and double de-ionized water. Following dehydration in an ascending series of ethanol (25, 50, 75, 95, 100, 100% 15 minutes each), the samples were infiltrated with Embed-812 resin in 100% ethanol (1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1 1 h each) and then several changes in 100% resin. After an overnight infiltration in 100% resin, the samples were embedded in BEEM capsules and polymerized at 65°C for 48 h. Blocks were sectioned on a Reichert-Jung UltracutE ultramicrotome and ultrathin sections were collected onto formvar-carbon coated copper grids. Sections were stained with methanolic uranyl acetate and Reynolds' lead citrate [65] and viewed on a Zeiss CEM 902 transmission electron microscope at 80 kV. Images were recorded with an Olympus Soft Imaging System GmbH Megaview II digital camera. Brightness levels were adjusted in the images so that the background between images appeared similar.

For scanning electron microscopy, fixed samples were incubated on poly-L-lysine coated silica wafers for 1 h and then rinsed three times for 15 minutes in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4). The samples were fixed with 1% osmium tetroxide in buffer for 2 h, washed in buffer and double de-ionized water, and then dehydrated in ethanol (25, 50, 75, 95, 100, 100% 15 minutes each). The wafers were critical point dried in an Autosamdri 815B critical point drier and mounted onto aluminum stubs with silver paint. The samples were coated with Au/Pd with a Denton Bench Top Turbo III sputter-coater and viewed with a Hitachi 4700 FESEM at 3.0 kV.

Phylogenetic tree generation

Based on the genome annotations available at NCBI, we considered any sigma factor that was annotated as σ 70 or unannotated. A second filter was applied by requiring that all the sequences should contain a Region 2, the most conserved region of the σ 70 protein. All members of this class of sigma factor contain Region 2, and it was modeled with the HMM pfam04542. This criterion removed CAC0550, CAC1766 and CAP0157, but they were added to the list again despite their lack of a Region 2. The alignment was made using ClustalW 1.83 using the default settings and visualized as a radial tree as created by Phylodraw v. 0.8 from Pusan National University.

Generation and characterization of antisense strains

Oligonucleotides were designed to produce asRNA complementary to the upstream 20 bp and first 30-40 bp of the targeted genes' transcripts (Additional data file 7). The constructs were cloned into pSOS95del under the control of a thiolase (thl) promoter and confirmed by restriction digest. Plasmids were then methylated and transformed into C. acetobutylicum ATCC 824, as previously described [33, 55, 56]. Strains were grown in 10 ml cultures and characterized using microscopy and HPLC to analyze final product concentrations [56].


أهداف

By doing this course well, students will develop basic knowledge and skills in cell and molecular biology and become aware of the complexity and harmony of the cell. As students proceed through the modules, they will be able to apply this knowledge, skill, and awareness to topics like the following:

  • Basic properties of cells
  • Prokaryotic and eukaryotic cells
  • الفيروسات
  • Biological molecules: carbohydrates, lipids, proteins, and nucleic acids
  • Techniques used in cell and molecular biology
  • الانزيمات
  • الأيض
  • Mitochondrion structure and function
  • Chloroplast structure and function
  • Plasma membrane composition, structure, and function
  • The movement of substances across cell membranes
  • The endomembrane system
  • The extracellular matrix
  • The structure and function of the nucleus
  • Genes and chromosomes
  • تكرار الحمض النووي
  • النسخ
  • ترجمة
  • Cytoskeleton and cell motility
  • Cellular reproduction
  • Cell signaling
  • سرطان

الملخص

Semen cryopreservation is a well-established procedure used in veterinary assisted reproduction technology applications. We investigated damaging effects of cryopreservation on the structural and ultrastructural characteristics of bull sperm induced at different temperatures and steps during standard cryopreservation procedure using transmission (TEM) and scanning electron microscopy. We also examined the effect of cryopreservation on sperm DNA and chromatin integrity. Five healthy, fertile Friesian bulls were used, and the ejaculates were obtained using an artificial vagina method. The semen samples were pooled and diluted in a tris-yolk fructose (TYF) for a final concentration of 80 × 10 6 spermatozoa/ml. The semen samples were packed in straws (0.25 ml), and stored in liquid nitrogen (−196°C). Samples were evaluated before dilution, just after dilution (at 37°C), at 2 h and 4 h during equilibration, and after thawing (37°C for 30 s in water bath). In association with step-wise decline in motility and viability, our results showed that the plasma membrane surrounding the sperm head was the most vulnerable structure to cryo-damage with various degrees of swelling, undulation, or loss affecting about 50% of the total sperm population after equilibration and freezing. Typical acrosome reaction was limited to 10% of the spermatozoa after freezing. We also observed increased number of mitochondria with distorted cristae (15%). Chromatin damage was significantly increased by cryopreservation as evident by TEM (9%). This was mainly due to DNA breaks as confirmed by Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) (8.4%) whereas the chromatin structure was less affected as evaluated microscopically by toluidine blue staining. We concluded that, using standard cryopreservation protocol, the most pronounced damage induced by cryopreservation is observed in the plasma membrane. Further improvement of cryopreservation protocols should thus be targeted at reducing plasma membrane damage. Acrosomal, mitochondrial and chromatin damage are also evident but appear to be within acceptable limits as discussed.


الأساتذه

Michael Ailion | Neuromodulator release and signaling at the cellular and organismal levels.

Chip Asbury | Molecular basis of mitosis.

Jihong Bai | How synapses are assembled into functional circuits using a combination of genetic, biochemical, imaging, and electrophysiological methods..

Wyeth Bair | Computer modeling and electrophysiology of the visual system.

Sandra Bajjalieh | Cell biology of neurons with emphases on membrane trafficking and lipid signaling pathways.

Melissa Barker-Haliski | Preclinical models of epilepsy and mechanisms of epileptogenesis in the elderly.

Andres Barria | Molecular mechanisms controlling synaptic function and plasticity. Role of NMDA receptors.

Michael Beecher | Auditory communication in birds

Olivia Bermingham-McDonogh | Mechanisms of development and regeneration of the mammalian auditory system.

Marc Binder | Properties of voltage-gated membrane channels.

Martha Bosma | Development of central nervous system neurons using physiological and molecular techniques.

Mark Bothwell | Growth factor mechanisms in neural development and degenerative disease.

Geoffrey Boynton | Functional organization of human visual perception.

Eliot Brenowitz | Neural basis of biologically relevant behavior in animals, and the cellular and molecular mechanisms of plasticity in adult brains.

Michael Bruchas | Dr. Bruchas’ laboratory focuses on understanding how brain circuits are wired, how they communicate with one another, and dissecting the neural basis of stress, emotion and reward.

Bingni Brunton | Data-driven low-dimensional dynamic models of neuronal networks.

Linda Buck | Odors, tastes, pheromones, stimulating specific behaviors or physiological effects in conspecifics.

Steven Buck | Focuses on human color vision and linking perceptual visual experience and the underlying neural/genetic substrate.

Elizabeth Buffalo | Our research is aimed at understanding the neural mechanisms that support learning and memory.

Clemens Cabernard | The Cabernard lab is studying asymmetric cell division (ACD), a process that generates cellular diversity.

Erik Carlson | The study of cerebro-cerebellar circuits in mice relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease.

Steven Carlson | Synapse formation – focusing on the formation of the active zone, the site of neurotransmitter release in the nerve terminal.

William Catterall | Molecular basis of electrical excitability molecular and cellular biology of ion channels function of calcium channels in neurotransmission.

Charles Chavkin | Using mouse genetic and optical stimulation of CNS pathways, we study how stress exposure affects depression, drug addiction risk, and cognition by affecting neural circuits and molecular signaling.

Daniel Chiu | The development of new tools, based on nanmaterials, optics, and microfluidics, for interfacing and interrogating neuronal systems and synaptic function at the nanometer scale.

Howard Chizeck | Biorobotics, telerobotics and neural engineering.

Eric Chudler | Cortical and basal ganglia mechanisms of nociception and pain, the neuroactive properties of medicinal plants and herbs, and translating basic neuroscientific research into language and activities for the general public.

John Clark | Characterizing the functional mechanism for the protective actions of the stress protein, human alphaB crystallin, a lens protein that is upregulated in aging diseases and protects against protein unfolding/misfolding and aggregation in Alzheimer’s, Huntington’s, Parkinson’s disease and cataracts.

David G. Cook | Molecular mechanisms of neurodegenerative disorders.

Mark Cooper | Gastrulation and neurulation in zebrafish embryos cell motility.

Ellen Covey | Structure and function of the central auditory system and the neural basis of echolocation neural mechanisms for processing temporal patterns of sound.

Dennis Dacey | Structure and function of the primate retina.

Valerie Daggett | Molecular modeling of proteins implicated in disease. Design and testing of diagnostic and therapeutic agents for neurodegenerative diseases.

Raimondo D’Ambrosio | Pathophysiology of glial cells and basic mechanisms of epilepsy. Specific current interest include glial extracellular ion homeostasis in traumatic brain injury, stroke and posttraumatic epilepsy membrane potassium channels edema.

Thomas Daniel | Sensorimotor control of animal movement.

Marie Y. Davis | The goal of my research is to understand mechanisms causing neurodegeneration in human movement disorders.

Horacio de la Iglesia | Neural basis of circadian behavior.

Nikolai C. H. Dembrow | How dendritic integration and the neuromodulation of intrinsic neuronal properties in distinct neuron types shapes neocortical function.

Peter Detwiler | Signal transduction in retinal photoreceptors.

Ajay Dhaka | Biology of somatosensation via molecular, cellular, developmental and behavioral investigation.

Jaime Diaz | Disruptions of the growth program affecting adult brain function and how other metabolic systems function.

Adrienne Fairhall | Computational approaches in neuroscience: adaptive and multimodal sensory processing, biophysics of computation by single neurons and small circuits, algorithms of computation in diverse systems .

Angela Fang | neurobiological correlates of maladaptive social cognition in anxiety and obsessive-compulsive related disorders to inform personalized treatment prediction role of oxytocin in the pathophysiology of these disorders.

Susan Ferguson | Using novel viral vector methods to unravel the role of cortico-basal ganglia circuitry in the development of behaviors that contribute to drug addiction, as well as in the processes that regulate decision-making, motivation and impulsivity.

Eberhard Fetz | Properties of cortical and spinal neurons controlling limb movement in primates dynamic neural network modeling implanted recurrent brain-computer interfaces.

Ione Fine | Effects of long-term visual deprivation, perceptual learning and plasticity, psychophysics, fMRI and computational vision.

Albert Folch | Neurobiology on a chip (Neuro-MEMS): Microengineered systems to study synaptogenesis, axon guidance, ion channel activity, and olfaction, among other neuroscience topics

Stanley Froehner | Molecular basis of synapse formation and function.

Jose M. Garcia | My research focuses on neuroendocrinologic aspects of traumatic brain injury and on hormonal pathways in wasting conditions.

David Gire | How neural circuits process natural spatiotemporal olfactory sensory cues to guide flexible, ethologically relevant behaviors.

Sam A. Golden | Neurobiology and circuitry of affective social behaviors and neuropychiatric disease.

Sharona Gordon | Ion channel biophysics & trafficking and regulation of neuronal plasticity in sensory transduction.

Thomas Grabowski | Functional magnetic resonance imaging studies of the neural systems basis of language and cognition in health and disease.

Brock Grill | Proteomic and genetic interrogation of neuronal signaling.

Chris Hague | Functional characterization of adrenergic receptors.

Julie Harris | Understanding the relationship between anatomical and functional neural circuitry between brain areas in normal and disease states.

Jeffrey Herron | Developing new research tools and systems to explore the applications of bi-directional neural interfaces to enable or improve the treatment of neurological diseases, disorders, and injuries.

Bertil Hille | Modulation of ion channels by G protein coupled receptors and membrane phosphoinositide lipids.

Greg Horwitz | Visual perception and viral vector-mediated gene transfer in primates.

Clifford Hume | Mammalian inner ear development, gene therapy of inner ear disorders, and imaging analysis of the inner ear.

James Hurley | Mechanisms of phototransduction light and dark adaptation.

Sandra Juul | Developing neuroprotective strategies for infants at high risk for neurodevelopmental impairment using in vivo and in vitro models of preterm and term brain injury.

Brian Kalmbach | Neurophysiology of primate neocortical cell types. Ion channels, neuromodulators and related genes.

Franck Kalume | Investigations of mechanisms and treatments of genetic epilepsies in animal models.

Jeansok Kim | Neurocognitive effects of stress basic mechanisms of fear.

Natalia Kleinhans | Multimodal imaging and neuropsychological assessment of neuropsychiatric disorders.

Andrew Ko |My research focuses on human electrophysiological and imaging correlates of behavior, disease, and interventions for epilepsy, movement disorders and pain.

Brian Kraemer |Molecular causes of neurodegeneration in Alzheimer’s disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and related disorders of the nervous system.

Patricia Kuhl | Speech perception throughout the lifespan with an emphasis on early development behavioral as well as ERP, fMRI, and MEG studies on language processing.

Adrian KC Lee | Auditory brain sciences and neuroengineering.

Ed Lein | Molecular, cellular and circuit organization of the developing and adult human neocortex.

Nicole Liachko | Seeks to understand the biology underlying neurodegenerative diseases of aging including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Alzheimer’s disease.

Michael Manookin | Neural circuits, cells, and synapses that mediate early visual processing.

Ludo Max | The role of sensorimotor integration in human motor learning and motor control, with an emphasis on auditory-motor learning in speech production and visuo-motor integration in limb movements.

G. Stanley McKnight | The role of intracellular signaling systems in the neuronal circuits that affect feeding and energy metabolism.

Kathleen Millen | The Millen laboratory uses molecular genetic approaches to explore the pathogenesis of congenital birth defects of the human and mouse brain and to study genes essential for normal neurodevelopment.

Dana Miller | We use C. elegans to understand how changes in environmental conditions are integrated into organism physiology, and how these responses modulate cellular processes involved in neurodegeneration.

Sheri J.Y. Mizumori | Neurobiology of learning and memory.

Cecilia Moens | Developmental genetics of brain patterning in the zebrafish.

William Moody | The role of spontaneous activity in cortical development, with some emphasis on the basic mechanisms underlying pediatric epilepsy.

Randall Moon | Functions and mechanisms of action of the wnt signaling pathways in embryonic development, regeneration, and diseases, and development of therapies to treat these diseases based on high throughput small molecule screens and genome-wide RNAi screens.

Claudia Moreno | Molecular mechanisms of aging.

Chet Moritz | We are developing neuroprosthetic technology for the treatment of paralysis and other movement disorders.

Gabe J. Murphy | We determine how particular synapses, cells, and circuits organize and extract the information that enables visually-guided behavior.

Scott O. Murray | Understand the brain mechanisms and cognitive process by combining behavioral and functional (fMRI) measurements of neural activity.

Neil M. Nathanson | Regulation of expression and function of muscarinic and neurokine receptors.

Jay Neitz | Biology of vision and vision disorders.

Maureen Neitz | Biology of vision and vision disorders.

John Neumaier | Molecular, cellular, and circuitry aspects of stress and addiction.

Jeffrey Ojemann | Electrocorticography studies of cognition and brain-computer interface.

Jaime Olavarria | Structure, function, and development of topographically organized circuits in the mammalian visual system.

Shawn Olsen | Cortical mechanisms of visual behavior and cognition.

Amy Orsborn | Engineering and understanding learning to develop neural interfaces

Lee Osterhout | Psychological and neural underpinnings of human language psychophysiological studies of human language and memory.

Leo Pallanck | Genetic analysis of neurotransmitter release mechanisms in ذبابة الفاكهة.

Richard Palmiter | Our laboratory uses mouse genetic models and viral gene transfer to dissect neural circuits involved in innate behaviors.

Jay Parrish | We are broadly interested in understanding the form and function of somatosensory neurons in Drosophila.

Anitha Pasupathy | Neural basis of visual shape representation and recognition in the primate brain.

David Perkel | Neural mechanisms of learning, focusing on vocal learning in songbirds anatomical and electrophysiological techniques for study of neuronal processing related to behavior.

Steve I. Perlmutter | Understanding and manipulating neural plasticity in mammalian motor systems to develop new therapies that improve recovery after spinal cord injury and brain damage.

Paul Phillips | The role of rapid dopamine neurotransmission in motivated behavior and decision making, and its dysfunction in mental health disorders including addiction.

Nicholas Poolos | Mechanisms of ion channel dysregulation in epilepsy, and impact on dendritic excitability.

Chantel Prat | My research investigates the biological basis of individual differences in language and cognitive abilities.

Daniel Promislow | We use quantitive genetics and systems biology to identify naturally occurring modifiers of neurodegenerative disease in the fruit fly.

David Raible | Zebrafish mechanosensory hair cell development, damage and regeneration: models for hearing loss.

Akhila Rajan | Fat-brain communication: how fat signals to the brain.

Jan-Marino (Nino) Ramirez | Understanding the neuronal basis of a variety of brain functions to find novel ways to treat and cure neurological disorders in children, including epilepsy, Rett syndrome, brain tumors, and sudden infant death syndrome.

Rajesh P.N. Rao | Computational neuroscience, machine vision and robotics, and brain-computer interfaces.

Wendy Raskind | The genetic etiologies of Mendelian neurodegenerative disorders, including ataxias and parapareses, and the complex neurobehavioral disorder dyslexia.

Jeff Rasmussen | Molecular and cellular regulation of zebrafish somatosensory neuron development and repair

Tom Reh | Determination of the mechanisms that control neuronal proliferation and differentiation during neurogenesis of the vertebrate CNS.

R. Clay Reid | Deciphering how information is encoded and processed in neural networks of the visual system, using behavior, anatomy and physiology.

Fred Rieke | Visual signal processing and computation phototransduction.

Jeff Riffell | Olfactory neurobiology and chemical communication processes.

Farrel R. Robinson | Cerebellar control of movements using monkey eye movements as a model.

Ariel Rokem | Conducts research on the biological basis of brain function using computational tools that we develop and maintain.

Edwin Rubel | evelopment and habilitation of the inner ear and CNS auditory pathways.

Jay Rubinstein | Signal processing, physiology, and perception with inner ear implants using both computational modeling and experimental techniques.

Hannele Ruohola-Baker | Regulation of stem cell self renewal and regeneration.

Ramkumar Sabesan | Functional imaging of the human retina.

Abigail G. Schindler | Computational medicine, iterative translation, and systems biology to understand traumatic stress and its comorbidities.

John Scott | Specificity of synaptic signaling events that are controlled by kinase anchoring proteins.

Eric Shea-Brown | Computational and theoretical neuroscience.

Andy Shih | Our lab uses imaging approaches to better understand the regulation of brain microvascular health, and the factors that lead to its dysfunction during disease.

Joseph Sisneros | Understanding how the vertebrate auditory system processes species-specific vocalizations and the adaptive mechanisms that are used to optimize the receiver’s sensitivity to social communication signals.

Stephen Smith | The behavior of protein interaction networks at the neuronal synapse.

William Spain | Transformation of synaptic inputs into patterns of action potential output information flow within the network of neurons.

Kat Steele | Dynamics and control of human movement.

Nicholas A. Steinmetz | Distributed neural circuits underlying visually-guided behavior in mice.

Nephi Stella | Activation of immune cells in the CNS.

Jennifer Stone | Study of cellular and molecular mechanisms underlying generation of sensory hair cells in the inner ear during development, under normal conditions, and after injury.

Daniel Storm | Molecular and cellular basis of long-term memory and memory persistence using an interdisciplinary approach.

Garret Stuber | Research in the Stuber lab uses an interdisciplinary approach to study the neural circuit basis of motivated behavior.

Jane Sullivan | Cellular and molecular mechanisms controlling synaptic transmission and plasticity.

Billie Swalla | he evolution of chordates, especially the central nervous system. We are studying the gene networks that specify the central nervous system, in invertebrate deuterostomes and chordate embryos and adults.

Gregory W. Terman | Neurophysiology and pharmacology of synaptic plasticity in pain transmission pathways of the central nervous system as a model for the pathogenesis of chronic pain.

James Thomas | Molecular evolution, especially the evolution and function of gene families implicated in environmental interactions and other rapidly changing selective pressures. Work is mostly on nematode and mammalian gene families, with some comparative analyses to other groups.

Jonathan T. Ting | Biophysical, anatomical, and molecular features of human neocortical cell types and leverage this information to develop novel molecular genetic tools for accessing and perturbing brain cell types across diverse mammalian species.

Eric Turner | The mechanisms of brain development and neural gene regulation, and brain pathways affecting mood and anxiety. Using transgenic mouse models.

John Tuthill | Neural mechanisms of somatosensory processing and adaptive motor control.

Russell Van Gelder | Natural and synthetic inner retinal and extraocular photoreception.

Oscar Vivas | My lab uses electrophysiology and imaging to understand the changes in the autonomic nervous system during aging.

Jack Waters | Cells and circuits of the neocortex and their modulation with behavioral state, studied primarily with optical techniques.

Kurt Weaver | My research focuses on the dynamic interplay between large-scale neural systems and cognitive function, how this interaction can better inform contemporary models of neurological and psychiatric disorders.

Sara J. Webb | The use of physiological and neuroimaging methods to study attention, perception and social learning in children and adults with autism and other neurodevelopmental disorders

Jonathan Weinstein | The neuroimmune response in stroke and ischemic preconditioning (IPC) with emphasis on the role of type 1 interferon signaling in microglia in IPC-mediated endogenous neuroprotection.

John Welsh | Our work focuses on the role of neuronal oscillation in cognitive and motor function.

Rachel Wong | Circuit assembly and reassembly in the developing nervous system.

Zhengui Xia | The effect of genes and environmental exposure on adult neurogenesis, cognitive impairment, and neurodegeneration.

Libin Xu | The roles of lipid oxidation and metabolism in neurological diseases.

Smita Yadav | Elucidating the role of kinase signaling in neuronal development and disease using chemical-genetics, proteomics and stem cell techniques.

Azadeh Yazdan-Shahmorad | Developing novel neural technologies for neurorehabilitation.

Jason Yeatman | Quantitative neuroimaging of brain development and learning to read

Jessica Young | Building robust human models of Alzheimer’s disease.

Cyrus P. Zabetian | The genetics of neurodegenerative diseases with an emphasis on Lewy body disorders.

William N. Zagotta | Mechanisms of ion channel function.

Jing Zhang | Proteomics investigation of molecular mechanisms of Parkinson’s disease, and biomarker discovery for neurodegenerative diseases.

Larry Zweifel | Understanding the mechanisms of phasic dopamine-dependent modulation of reward and punishment, and the role of dopamine in generalized fear and anxiety.


الملخص

Mitochondrial quality is under surveillance by autophagy, the cell recycling process which degrades and removes damaged mitochondria. Inadequate autophagy results in deterioration in mitochondrial quality, bioenergetic dysfunction, and metabolic stress. Here we describe in an integrated work-flow to assess parameters of mitochondrial morphology, function, mtDNA and protein damage, metabolism and autophagy regulation to provide the framework for a practical assessment of mitochondrial quality. This protocol has been tested with cell cultures, is highly reproducible, and is adaptable to studies when cell numbers are limited, and thus will be of interest to researchers studying diverse physiological and pathological phenomena in which decreased mitochondrial quality is a contributory factor.


شاهد الفيديو: 7-4 تحفيز ومكافأة العاملين على إنتاجاتهم وإنجازاتهم (شهر فبراير 2023).