معلومة

الرابط بين منطقة الخلية ومضخة التدفق؟

الرابط بين منطقة الخلية ومضخة التدفق؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد أجريت تجربة تتضمن صبغة F-actin الفلورية تسمى sir-actin والتي يتم إزالتها بواسطة مضخة التدفق. بعد زيادة الوقت وإزالة الوسيط المحتوي على السير-أكتين ، قامت الخلية بإزالة السير-أكتين باستخدام مضخة التدفق ولكن تم الإبلاغ عن زيادة في مساحة الخلية عند معالجة الصور في matlab. كنت أتساءل عما إذا كان بإمكان أي شخص اقتراح سبب محتمل لزيادة مساحة الخلية مع إزالة السير-أكتين بواسطة مضخات التدفق. تم العثور على f-actin للهيكل الخلوي أيضًا ليكون له طول أقل مع زيادة الوقت. شكرا لك مقدما. لقد استخدمت أيضًا MSCs وكانت الخلايا على قيد الحياة حتى تم إصلاحها في كل نقطة زمنية ثم تم تصويرها.


فرط الاستقطاب (علم الأحياء)

فرط الاستقطاب هو تغيير في إمكانات غشاء الخلية مما يجعلها أكثر سلبية. إنه عكس نزع الاستقطاب. يثبط إمكانات العمل عن طريق زيادة الحافز المطلوب لتحريك إمكانات الغشاء إلى عتبة جهد الفعل.

غالبًا ما يحدث فرط الاستقطاب بسبب تدفق K + (كاتيون) عبر قنوات K + ، أو تدفق Cl - (أنيون) عبر قنوات Cl. من ناحية أخرى ، فإن تدفق الكاتيونات ، على سبيل المثال Na + من خلال قنوات Na + أو Ca 2+ من خلال قنوات Ca 2+ ، يمنع فرط الاستقطاب. إذا كانت الخلية بها تيارات Na + أو Ca 2+ في حالة الراحة ، فإن تثبيط تلك التيارات سيؤدي أيضًا إلى فرط الاستقطاب. هذه الاستجابة لقناة الأيونات ذات الجهد الكهربائي هي كيفية تحقيق حالة فرط الاستقطاب. في الخلايا العصبية ، تدخل الخلية في حالة فرط الاستقطاب مباشرة بعد توليد جهد فعل. أثناء الاستقطاب المفرط ، تكون الخلية العصبية في فترة مقاومة للحرارة تدوم حوالي 2 مللي ثانية ، حيث يتعذر على العصبون توليد إمكانات عمل لاحقة. تعيد قواعد ATPases الصوديوم والبوتاسيوم توزيع أيونات K + و Na + حتى تعود إمكانات الغشاء إلى إمكانات الراحة التي تبلغ حوالي -70 ملي فولت ، وعند هذه النقطة تكون العصبون جاهزًا مرة أخرى لنقل جهد فعل آخر. [1]


الرابط بين منطقة الخلية ومضخة التدفق؟ - مادة الاحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يمكن إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من قبل المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة والتي يعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


مقاومة الأدوية المتعددة: ليست حديثة كما كنا نظن

وجد باحثون من جامعة أوساكا أن مضخة تدفق الأدوية القديمة نسبيًا في المستدمية النزلية تمنح مقاومة لنفس الأدوية مثل نظيراتها الأكثر تطورًا ، ولا يتم تخفيفها إلا عن طريق قناة غشاء متسربة قليلاً

صورة: التفاعل بين مضخات التدفق و porins من الإشريكية القولونية و المستدمية النزلية. يمكن لمضخات تدفق AcrB نقل المضادات الحيوية بشكل فعال من محيط الخلايا والسيتوبلازم للخلايا البكتيرية ، مما يؤدي إلى حدوث ذلك. عرض المزيد

أوساكا ، اليابان - توصل باحثون من جامعة أوساكا إلى اكتشاف مذهل مفاده أن البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة ربما كانت موجودة لفترة أطول مما كنا نظن.

في النتائج التي نشرت هذا الشهر في بيولوجيا الاتصالات، حقق الباحثون في العلاقات التطورية بين مئات مضخات التدفق من نوع RND - وهي بروتينات متخصصة تضخ أنواعًا مختلفة من المضادات الحيوية من خلية بكتيرية ، مما يجعلها مقاومة للأدوية المتعددة.

"ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أن RND تدفق ضخ AcrB من المستدمية النزلية كانت قديمة نسبيًا ولكنها صدرت نفس المضادات الحيوية مثل نظيرتها الأكثر تطورًا من الإشريكية القولونية، "يشرح المؤلف الرئيسي للدراسة Martijn Zwama." ما لم تستطع فعله بشكل جيد هو تصدير الأملاح الصفراوية ، وهي ليست شيئًا المستدمية النزلية تصادف في بيئتها الطبيعية ولكنها مكونات شائعة في القناة الهضمية ، حيث بكتريا قولونية يقيم ".

في حين أن هذا يشير إلى تطور المضخات في بيئاتها الطبيعية ، فإنه يشير أيضًا إلى أن التعرف على الأدوية المتعددة هو سمة قديمة. هذا تمييز مهم لأن معظم البكتيريا تكتسب جينات مقاومة أو طفرات في مواجهة الضغط الانتقائي من البيئة.

ولكن بينما يحمي AcrB المستدمية النزلية من عدة فئات مختلفة من المضادات الحيوية ، يظل العامل الممرض عرضة لـ & # 946-lactams و novobiocin ، وهو أمر لم يتمكن الباحثون من تفسيره من قبل.

يقول المؤلف المشارك أكيهيتو ياماغوتشي: "تحتوي الأغشية البكتيرية على قنوات تسمح بشكل انتقائي لركائز مختلفة بالدخول إلى الخلية". "وجدنا ذلك في المستدمية النزلية، إحدى هذه القنوات ، OmpP2 ، كانت بها تسريب طفيف. وهذا يعني أن بعض الأدوية الأصغر التي يتم ضخها من الخلية بواسطة AcrB يمكن أن تتسرب إلى الداخل ، حيث يذهبون للعمل لقتل البكتيريا ".

البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة لها آثار مدمرة - وقاتلة في كثير من الأحيان - على المرضى المصابين. ومع ظهور سلالات جديدة باستمرار ، يمكن القول إن هذه العوامل الممرضة الخارقة هي أكبر تهديد لصحة الإنسان اليوم. لذلك ، تم تطوير الأدوية التي تستهدف مضخات التدفق. ومع ذلك ، وجد الباحثون أن هذه الأدوية ليس لها تأثير على المستدمية النزلية.

"ترتبط مثبطات مضخة التدفق بجيب غني بالفينيل ألانين في AcrB. لسوء الحظ ، تم تصميم هذه الأدوية لاستهداف البروتينات الأكثر تطورًا في الأنواع مثل بكتريا قولونية، "يشرح الدراسة المقابلة المؤلف البروفيسور كونيهيكو نيشينو." لأن المستدمية النزلية يعتبر AcrB أقدم ، ووجدنا أنه لا يحتوي على نفس تكوين الجيب وبالتالي لا يتأثر بمثبطات مضخة التدفق. "

وقد أظهر الكشف عن هذه الاختلافات التطورية أن نهج "مقاس واحد يناسب الجميع" ليس مناسبًا لمعالجة مضخات التدفق من نوع RND. يوفر هذا البحث صورة أكثر دقة لتطور وآلية أنظمة تدفق الأدوية المتعددة ، والتي ستساعد في تطوير مضادات حيوية جديدة لاستهداف مسببات الأمراض المحددة المقاومة للأدوية المتعددة بشكل أكثر فعالية.

المقال ، "التوصيف التطوري والوظيفي لـ المستدمية النزلية multidrug efflux pump AcrB، "تم نشره في بيولوجيا الاتصالات في DOI: https: / / doi. org / 10. 1038 / s42003-019-0564-6.

عن جامعة أوساكا

تأسست جامعة أوساكا في عام 1931 كواحدة من الجامعات الإمبراطورية السبع في اليابان وتوسعت الآن لتشمل واحدة من الجامعات الشاملة الرائدة في اليابان. شرعت الجامعة الآن في ثورة بحثية مفتوحة من موقعها كجامعة اليابان الأكثر ابتكارًا ومن بين أكثر المؤسسات ابتكارًا في العالم وفقًا لرويترز 2015 أفضل 100 جامعة مبتكرة و Nature Index Innovation 2017. قدرة الجامعة على الابتكار من مرحلة ينبع البحث الأساسي من خلال إنشاء تقنية مفيدة ذات تأثير اقتصادي من طيف تخصصها الواسع.

تنصل: AAAS و EurekAlert! ليست مسؤولة عن دقة النشرات الإخبارية المرسلة على EurekAlert! من خلال المؤسسات المساهمة أو لاستخدام أي معلومات من خلال نظام EurekAlert.


مقالة الفرضية والنظرية

تعد قدرة جميع الخلايا على ضبط وتنظيم حجمها جانبًا أساسيًا من علم وظائف الأعضاء الخلوي. من المعروف منذ فترة ولكن ليس على نطاق واسع أن استقرار الحجم في الخلايا الحيوانية يعتمد على تشغيل مضخة الصوديوم ، من خلال آلية تسرب المضخة (Tosteson and Hoffman ، 1960). تُؤسس الجزيئات غير المنجزة في الخلايا حالة تناضحية غير مستقرة ، تأثير دونان ، الذي يتم إبطاله من خلال تشغيل مضخة الصوديوم ، مما يخلق عدم تناسق في توزيع Na & # 43 و K & # 43 لدرء غمر المياه. في هذه الورقة ، التي تعد جزءًا تعليميًا ، أوضحت كيفية نمذجة الأيونات وتدفقات الماء بشكل كمي في الخلية التي تحدد حجم الخلية وإمكانات الغشاء. إن حركة الماء والأيونات مقيدة بكل من التوازن التناضحي والشحن ، وهي مدفوعة بتدرجات الأيونات والجهد ونقل الأيونات النشط. يسمح لنا تحويل هذه القيود والقوى إلى مجموعة من المعادلات التفاضلية المقترنة بنمذجة كيفية تغير توزيعات الأيونات والحجم والجهد بمرور الوقت. أقدم حلًا تحليليًا لهذه المعادلات يوضح تأثير الموصلات الأيونية ومعدلات الضخ ونفاذية الماء في هذا النظام متعدد الأبعاد. أظهِر أن عدد الأيونات القاتلة (x) ومتوسط ​​شحنتها لها تأثير قوي على توزيع الأيونات والجهد في الخلية. علاوة على ذلك ، أوضح أنه في خلية حيث يؤدي تشغيل نقل الأيونات النشط إلى القضاء على التدرج الاسموزي ، يتناسب حجم الخلية بشكل مباشر مع x. بالإضافة إلى ذلك ، أستخدم الرسوم البيانية للكشف عن كيفية تفاعل القيود الفيزيائية والكيميائية والقوى الكيميائية مع بعضها البعض في تقسيم الأيونات داخل الخلية. شكل النموذج المستخدم هنا ينطبق على جميع أنظمة الأغشية ، بما في ذلك الميتوكوندريا والبكتيريا ، وأظهر كيف يمكن استخدام مضخات أخرى غير مضخة الصوديوم لتثبيت الخلايا. قد يفكر علماء الأحياء الخلوية في الفيزيولوجيا الكهربية على أنها المجال الحصري لعلم الأعصاب ، ولكن يجب أن تصبح التأثيرات الكهربائية لتدفقات الأيونات جزءًا حميمًا من بيولوجيا الخلية إذا أردنا فهم عملية أساسية مثل تنظيم حجم الخلية.


نتائج

الامتدادات المنفصلة للمخلفات تتحكم في اتصال PAP-RND ويتم فحص التعرف على أزواج PAP-RND من خلال عدد صغير من بقايا "أداة التمييز"

تم تحديد PAPs ، من قبلنا وآخرين ، كأهداف ممتازة لتطوير مثبطات التدفق [18 ، 21 ، 22] ولكن المعرفة الدقيقة لبقايا PAP المهمة للتعرف والتجميع المعقد للتدفق محدودة. تسمح تركيبات Cryo-EM الحديثة ذات الدقة شبه الذرية للمجمع الثلاثي المستقر لـ AcrAB-TolC [24] بفحص بقايا PAP المتضمنة في ربط ناقل RND. يكشف رسم خرائط مناطق ربط الناقل المستمدة من الهياكل التجريبية عن عدة امتدادات منفصلة للمخلفات المتضمنة في الاتصال. يتم توفير جهات الاتصال حصريًا من مجالات β-برميل و MP (الشكلان 1A و 2A) ، بينما يشارك مجال lipoyl في الارتباط الذاتي ، وتوفر المجالات α-helical ، جهة اتصال مع OMF والارتباط الذاتي بـ توفير ختم محكم لقناة التدفق بالاتفاق مع ما يسمى بنماذج التجميع من طرف إلى طرف أو عجلة مسننة [37].

  1. الموقع 1:-برميل من PAP 1 إلى مجال قمع (DN) لبروتومر RND الرئيسي (جزء حلزوني ألفا Nα4 في تسمية موراكامي 2002 وقاعدة β-hairpin1) أو-برميل من PAP 2 إلى مجال DC من بروتومر RND المجاور (جزء حلزوني ألفا Cα4 وقاعدة دبوس الشعر 2).
  2. الموقع 2: مجال PAP β-برميل إلى-hairpin من مجال قمع RND (PAP 1- β-hairpin 2 من DC PAP2 - β-hairpin 1 of DN).
  3. الموقع 3: PAP MP- المجال إلى قاعدة مجال قمع RND.
  4. الموقع 4: PAP MP-domain to RND pore (porter)-domain (في حالة PAP1 إلى PC1 في حالة PAP2 إلى PN2).

من اللافت للنظر أنه على الرغم من مساحة السطح الواسعة المتاحة لتفاعل محكم بين PAP والناقل ، يبدو أن البروتينين لهما اتصال محدود نسبيًا ، مع اقتصار تفاعلات التثبيت الرئيسية على الارتباط الذاتي لمجالات الدهون في البروتين. الأشخاص المتأثرين بالمشروع. تؤدي هذه الملاحظة في حد ذاتها مباشرة إلى الاقتراح ، أنه من بين جهات الاتصال القليلة المتبقية نسبيًا ، يجب الحفاظ على الرقم بشكل عام من أجل الصلابة الهيكلية ويمكن حفظه في الطبيعة عبر أزواج ناقل PAP ، بينما لا يزال عدد أقل يلعب دور دور "المميّزات" الذي يتطلب الاقتران الدقيق بين PAP والناقل المماثل.

مع أخذ هذه الاعتبارات في الاعتبار وتبسيط تحليل مواقع الربط ، قمنا بتقسيمها إلى مكونات التسلسل الخطي الفعلية الخاصة بهم وقمنا بترقيمها من N-terminus إلى C-terminus لـ PAP (باستخدام AcrA كقالب). نتج عن ذلك 9 "مربعات ربط" منفصلة سنشير إليها في النص. يتم تصورها في المحاذاة الهيكلية (الشكل 3 أ) وتعيينها على هيكل ه. القولونية أكرا على الشكل 3 ب. يتم توفير مقارنة أكثر تفصيلاً في الشكل S3.

أ. محاذاة متعددة التسلسل لل 4 السالمونيلا يتم دمج PAPs مع المحاذاة الهيكلية للتجربة ه. القولونية يكشف هيكل AcrA (استنادًا إلى سلسلة 5o66.pdb) (أعلى) عن حدود نطاق واضحة واحتمالية عالية في المقابل للحفاظ على البنية الثانوية. البقايا المتطابقة ملونة باللون الأحمر. يتم شرح "مربعات الربط" المقترحة من 1 إلى 9 ويتم تحديدها باستخدام المستطيلات. تم إنتاج الشكل باستخدام إسبريبت. ب. رسم خرائط صناديق تجليد (باللون الأزرق) على الهيكل ثلاثي الأبعاد لـ PAPs (AcrA) يُظهر أنها مقيدة فقط بمجالات-برميل و MPD وخريطة في الغالب على وجه واحد من PAP protomer ، الذي يواجه ناقل RND. ج. خريطة الحفاظ على تسلسل Consurf استنادًا إلى 150 تسلسلًا فريدًا من PAP (هوية التسلسل من 95 ٪ إلى 45 ٪) المسقطة على هيكل AcrA. تتم الإشارة إلى المخلفات المحفوظة بدرجة عالية باستخدام مناطق أرجوانية عميقة ومتغيرة للغاية باللون السماوي. د. صورة مركبة تجمع خريطة Consurf من 3C مع تمثيل مساحة ملء المخلفات التي تشتمل على صناديق تجليد، مما يدل على الحفظ القوي لعناصر التسلسل داخلها.

نمذجة التنادد السالمونيلا يكشف PAPs عن مجموعتين هيكليتين واضحتين

لفهم المزيد حول كيفية حفظ "صناديق ربط" PAP هذه بين عائلة PAP ، أجرينا مزيدًا من العمل فيها السالمونيلا. لقد أبلغنا سابقًا أن الأشخاص المتأثرين بالمشروع في س. المعوية عرض بعض الاختلاط [18] و السالمونيلا هو نموذج ممتاز يتيح دراسة ليس فقط الأنماط الظاهرية لمقاومة الأدوية ، ولكن أيضًا تأثير التدفق على العدوى. في الوقت الحالي ، لا توجد بيانات هيكلية مباشرة متاحة لأي من مضخات RND الخمسة أو أربعة PAPs في مسببات الأمراض البشرية المهمة السالمونيلا. حتى ل ه. القولونية، المعلومات الهيكلية لمضخات RND بخلاف AcrAB غير متوفرة. لذلك ، فإن نماذج التنادد السالمونيلا تم تصميم PAPs للسماح بالتحليل الهيكلي ورسم خرائط الحفظ المتسلسل. تمكنا من بناء نماذج موثوقة من السالمونيلا AcrA على أساس المراسلات المباشرة للتسلسل بينها وبين الجزئية المحددة تجريبيا ه. القولونية الهياكل [32] ، فضلا عن الهياكل طويلة المدى cryo-EM [24] والهياكل كاملة الطول من MexA ذات الصلة من ص. الزنجارية [30].

بناءً على تحليلنا ، كل أربعة السالمونيلا تمتلك PAPs التنظيم النموذجي المكون من أربعة مجالات لـ PAPs المرتبطة بـ RND (كما في الشكل 1C) مع حدود مجال واضحة وأنتجت محاذاة هيكلية موثوقة ، مع درجات الثقة العالية المقابلة لنماذج التماثل الناتجة (S2A الشكل). تراوحت الهوية الإجمالية بين كل PAP والقالب من 92٪ لـ AcrA إلى أقل من 30٪ لـ MdsA. كانت هوية تسلسل البروتين بين AcrA و AcrE 69.3 ٪ لكن المحاذاة الهيكلية أظهرت بنية ثانوية متطابقة تقريبًا ، مع حدود مجال واضحة و RMSD متوقع لـ AcrA و AcrE أقل من 0.5 على كامل طول العمود الفقري C-alpha الشكل المقابل لـ AcrA و MdtA على المجالات الأساسية 4 تقع ضمن 0.6 (S2B الشكل) ، مما يدل على تطابق بنيوي وثيق للغاية ، على الرغم من أن هذه الأرقام تحتاج إلى حساب تحيز نموذجي محتمل.

يشير تحليل التسلسل إلى أن PAPs تنقسم إلى فئتين فرعيتين بينما يرتبط AcrA و AcrE ارتباطًا وثيقًا ويشكلان فرعًا نسبيًا واحدًا ، يتم إزالة كل من MdtA و MdsA تقريبًا عنهما ، مع الكشف عن MdsA ليكون الأكثر تباينًا بين السالمونيلا PAPs (S2A Fig). نتيجة لذلك ، تم تصميم MdsA على أساس بنية MexA حيث كان النموذج الأكثر ارتباطًا بهوية 31.9٪. يظهر التراكب الهيكلي لنماذج AcrA و AcrE و MdtA في الشكل S2B. على وجه الخصوص ، يتم حفظ الهيكل العام للنطاق β-برميل و MP عبر العائلة جنبًا إلى جنب مع أطراف مجال دبوس الشعر α التي يُفترض أنها تتفاعل معها OMF TolC - ولا سيما تسلسل التوقيع "RLSD" المهم موجود في كل منهم [41] (S2 الشكل).

يكشف تحليل الحفظ لصناديق الربط عن أنها محفوظة داخل فصائل فرعية وظيفية ولكنها متباينة بشدة في الخارج

مقارنة "مربعات الربط" المشروحة في كل من الأربعة السالمونيلا كشفت PAPs أن البقايا المتضمنة في ارتباط ناقل RND تختلف بين العائلات الفرعية لـ PAPs [42] (الشكل 3 أ و 3 ب) ، تكون مربعات الربط لـ AcrA و AcrE متطابقة تقريبًا بينما يختلف كل من MdtA و MdsA بشكل ملحوظ في هذه المواقع. الأهم من ذلك ، يتم حفظ موضع هذه الصناديق عبر العائلة ، ولها طول مماثل ومن المتوقع أن تحافظ على اتجاهها بالنسبة إلى الناقل في أزواج PAP-RND المختلفة (S2 الشكل). يشير هذا إلى أن الموضع هو مفتاح الوظيفة وأن المخلفات المحددة تحدد الخصوصية.

ثم قمنا بتعيين حفظ التسلسل على النموذج الهيكلي لـ السالمونيلا AcrA (الشكل 3C) وتراكب ذلك مع المعلومات من التحليل الهيكلي لهياكل AcrA-AcrB cryo-EM التي قدمت قائمة المخلفات المتفاعلة. يُظهر المركب الناتج (الشكل ثلاثي الأبعاد) ارتباطًا قويًا جدًا بالحفظ في المناطق التي تتصل بناقل RND ضمن عائلة معينة من الأشخاص المتأثرين بالمشروع. والجدير بالذكر أنه عندما نقوم بتوسيع بحث التماثل ، يبدو أن البقايا التي تواجه ناقلات RND تفقد درجات الحفظ العالية. هذا يتوافق مع المتطلبات التطورية للحفاظ على جهات الاتصال داخل زوج ناقل PAP.

بالاقتران مع تحليل الحفظ ، يشير التعيين الهيكلي لواجهات الربط بقوة إلى أن "صناديق الربط" المنفصلة التي لوحظت أعلاه توفر الآلية الأساسية للتمييز بين أزواج ناقلة PAP الوظيفية. لذلك ، رأينا أن هذه الاختلافات في التسلسل ، يجب أن تُترجم بسهولة إلى تقييد الارتباط بين مختلف الأشخاص الذين يمكن اكتشافهم في تجارب التكميلية الوظيفية. على وجه التحديد ، على أساس الحفاظ على مربعات الربط بين السالمونيلا افترضنا AcrA و AcrE أن هذين PAPs سيظهران الاختلاط وقابلية التشغيل البيني ، في حين أن الاختلافات التي لوحظت بين AcrA و MdtA و / أو MdsA ستحول دون تكاملهما.

السلالات التي تفتقر إلى العديد من PAPs قللت من التدفق ، وهي أكثر عرضة لمضادات الميكروبات وقللت الفوعة

في المقام الأول ، للتحقيق في هذه الفرضية ، قمنا بشكل منهجي ببناء طفرات السالمونيلا تفتقر إلى كل شخص من الأشخاص المتأثرين بالمشروع وكل مجموعة من اثنين وثلاثة وأربعة من الأشخاص المتأثرين بالمشروع (الجدول 1). كان الحذف الوحيد لـ PAP لتغيير قابلية مضادات الميكروبات هو أكرا أثناء عمليات الحذف المفردة فدان, mdtA أو mdsA (SE04 ، SE05 أو SE06 ، على التوالي) لم تغير من قابلية مضادات الميكروبات ولم تؤثر على معدل تدفق بروميد الإيثيديوم (الشكل 4 أ). المسوخ التي تفتقر إلى اثنين أو ثلاثة من PAPs كان لها نمط ظاهري متغير فقط إذا أكرا تم حذفه. سلالة سليمة أكرا ولكن تفتقر إلى جميع الأشخاص المتأثرين بالمشروع الثلاثة الآخرين (فدان, mdtA و mdsA) كان له نفس النمط الظاهري للتأثر بمضادات الميكروبات مثل سلالة النوع البري (الجدول 1) يوضح أن وجود AcrA كان كافياً لدعم وظيفة التدفق الطبيعي في هذه الظروف ، على الأرجح من خلال AcrB.

أ. تدفق بروميد إيثيديوم في سلالات تفتقر إلى مفردة أو مجموعات من PAPs. عولجت البكتيريا ببروميد الإيثيديوم و CCCP لمدة 60 دقيقة ثم أعيد تنشيطها بالجلوكوز. البيانات المقدمة هي الوقت المستغرق لتقلل الفلورة بنسبة 25٪ +/- SE. (يمكن رؤية البيانات الخاصة بانخفاض 10٪ و 50٪ في جدول S1) ب. البقاء على قيد الحياة جاليريا ميلونيلا نموذج عدوى يرقات عثة الشمع. ج. تواتر مقاومة سيبروفلوكساسين. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ​​ما لا يقل عن 14 مكررات بيولوجية +/- SE. يشار إلى البيانات التي تم تحليلها بواسطة ANOVA أحادية الاتجاه والسلالات التي كان تردد مقاومتها مختلفًا اختلافًا كبيرًا (p & lt0.05) عن SL1344 بواسطة *.

كما هو موضح سابقًا ، تعطيل كلاهما أكرا و فدان معا كان لها تأثير مضاف و أكرا كان الضربة القاضية المزدوجة أكثر عرضة بشكل ملحوظ من أي من الضربات القاضية الفردية لبروميد الإيثيديوم والأوكساسيلين ، وبدرجة أقل ولكن بشكل قابل للتكاثر ، أكثر عرضة للبنفسجي البلوري وحمض الفوسيديك وأزرق الميثيلين والنورفلوكساسين والنوفوبيوسين والستربتومايسين (الجدول 1). ارتبط هذا بتدفق أبطأ بكثير لبروميد الإيثيديوم (الشكل 4 أ). هذا يشير إلى متى أكرا تم حذفه لأن AcrE قد يكون مكملًا جزئيًا للنمط الظاهري المتحور لأن الخسارة الإضافية لـ AcrE زادت من شدة النمط الظاهري في الطفرة. لم يكن لأي مجموعة أخرى من عمليات حذف PAP المزدوجة تأثير إضافي مقارنة بتأثير فقدان AcrA فقط. علاوة على ذلك ، حذف PAP ثالث من سلالة ناقصة أكرا و فدان أو حذف جميع الأشخاص المتأثرين بالمشروع الأربعة (Δ4PAP) لم يغير النمط الظاهري أكثر من النمط المزدوج فدان متحولة من حيث قابلية مضادات الميكروبات أو معدل التدفق (الشكل 4 أ والجدول 1).

يوفر تدفق RND مستوى أساسي جوهري من المقاومة للمضادات الحيوية الركيزة. عدم وجود أي منهما أكرب أو tolC تقليل التكرار الذي يمكن من خلاله اختيار المسوخات ذات القابلية المنخفضة للمضادات الحيوية الركيزة ولكن هذا لم يتم دراسته في غياب PAPs [43 ، 44]. تعطيل الترميز الجيني لـ PAP الرئيسي ، أكرا، قلل بشكل كبير من وتيرة اختيار الطفرات ذات القابلية المتوفاة للسيبروفلوكساسين أثناء تعطيل فدان لم. تم تقليل التردد أيضًا في المسوخ الذي يفتقر إليه أكرا و فدان أو جميع الأشخاص المتأثرين بالمشروع الأربعة (Δ4PAP ، SE10) على الرغم من أن تردد اختيار الطفرات لم يكن مختلفًا بشكل كبير عن تردد الفردي أكرا بالضربة القاضية (الشكل 4 ج).

تدفق RND مطلوب لفوعة البكتيريا سالبة الجرام [45]. أدى حذف إما مضخة RND الرئيسية AcrB أو PAP AcrA إلى زيادة بقاء المضخة بشكل كبير جاليريا نموذج يرقات عثة الشمع للعدوى مقارنة بالنوع البري (53.0٪ و 46.7٪ مقارنة بـ 13.3٪ على التوالي) (الشكل 4 ب). حذف واحد من فدان, mdtA أو mdsA لم يغير بشكل كبير من بقاء Galleria مقارنةً بـ WT (S5A Fig). الأهم من ذلك ، حذف أكرا و فدان كان له تأثير مضاف يسبب السالمونيلا فقدان القدرة على قتل اليرقات مع زيادة بقاء اليرقات بنسبة 100٪. السلالات التي تفتقر إلى ثلاثة أو أربعة من الأشخاص المتأثرين بالمشروع كانت أيضًا عديمة الفوعة في هذا النموذج. تم تأكيد هذا النمط لسلالات مختارة في نموذج الفأر للعدوى. تم تعداد CFU من الكبد والطحال بعد ثلاثة أيام من الحقن داخل الصفاق. لم يتم تغيير عدد CFU لكل كبد / طحال بشكل ملحوظ بعد حذف فقط أكرا، ولكن تم تقليله بشكل كبير عند حذف أكرا و فدان أو حذف جميع الأشخاص المتأثرين بالمشروع الأربعة (S5B الشكل).

مطلوب أيضًا تدفق RND لتكوين الأغشية الحيوية ، لذا تمت إضافة قدرة المسوخ على تكوين الأغشية الحيوية. لم يكن لدى أي من طفرات PAP التي تم اختبارها قدرة متغيرة بشكل كبير على تكوين غشاء حيوي في نموذجنا (S5C الشكل).

تدعم هذه البيانات معًا التحليل الهيكلي الذي يشير إلى قابلية التشغيل البيني لـ AcrA و AcrE ولكن ليس MdtA و MdsA لأن تأثير التعطيل أكرا و فدان كان مضافًا ولكن هذا لم يكن صحيحًا بالنسبة إليه mdtA أو mdsA.

فقط AcrA أو AcrE يمكن أن يكمل Δالنمط الظاهري متحولة 4PAP

للتحقيق في الفرضية القائلة بأن AcrA و AcrE سيكونان قابلين للتشغيل المتبادل ، لكن MdtA و MdsA لن يكونا كذلك ، Δتم استكمال سلالة 4PAP بشكل منفصل ببلازميدات ترميز واحد من أربعة PAPs. في ظل الظروف المختبرية القياسية ، يتم التعبير عن المضخة الرئيسية AcrB بمستويات أعلى بكثير من أي من مضخات RND الأخرى ، كما أن تعطيل المضخات الأخرى لا يغير من الحساسية للمضادات الميكروبية ، لذلك فإن أي تأثير تكميلي يظهر بعد تعبير PAP المرئي سيتم تأمله من خلال تكوين مركب مضخة AcrB.

تكملة ل Δسلالة 4PAP مع pET20b أكرا زيادة MICs لمعظم مضادات الميكروبات مقارنة مع Δسلالة 4PAP على الرغم من عدم مستويات النوع البري (الجدول 2). هذا ليس مفاجئًا كتكملة مع أكرا من المفترض استعادة وظيفة مضخة التدفق الرئيسية AcrAB-TolC. كما اقترحت التنبؤات الهيكلية ، كان التكميل مع PAP الثانوي ، AcrE ، قادرًا أيضًا على زيادة MIC للعديد من نفس مضادات الميكروبات والأصباغ بما في ذلك acriflavine و ethidium bromide و methylene blue و novobiocin و rhodamine 6G على الرغم من أنه في بعض الحالات إلى مستويات أقل من اتباع التكامل مع أكرا. تكملة Δسلالة 4PAP مع pET20b mdtA أو pET20b mdsA لم يغير قابلية التعرض لأي من العوامل التي تم اختبارها مما يشير إلى أن هذين الشخصين المتأثرين بالمشروع غير قادرين على تكوين تفاعلات مختلطة مع AcrB حتى عند الإفراط في الإنتاج مقارنة بمستوى التعبير العادي.

قد يتوقع المرء أن تأثير التعبير فدان من البلازميد في Δيجب أن تكون سلالة 4PAP هي نفسها السلالة SE22 التي تفتقر أكرا, mdtA و mdsA ولكن لا يزال لديها نسخته الكروموسومية من فدان سليمة ولكن هذا ليس هو الحال. هذا على الأرجح لأن مستوى فدان المنتج من بناء pET20b يمثل تعبيرًا زائدًا مقارنةً بالمستوى الناتج من نسخة الكروموسومات في النوع البري وأيضًا في SE22. هذا يدل على أن مدى التكميل يعتمد بشكل كبير على كمية بروتين AcrE الموجود. لمزيد من التحقيق في تأثير هذا فدان (وكل من PAPs الآخرين) تم استنساخه في نسخة أعلى من البلازميد (pTRC) وهذا كشف عن أنماط مختلفة. كما هو موضح سابقًا ، مستوى عالٍ جدًا من التعبير المفرط عن أكرا تم تحمله بشكل سيئ من قبل الخلية ، مما تسبب في معدل نمو بطيء ، وخيوط وعدم تكامل النمط الظاهري (الجدول S1 والشكل S6) [19]. كان المستوى الأكبر من تعبير AcrE قادرًا على استكمال النمط الظاهري لقابلية مضادات الميكروبات في Δسلالة 4PAP إلى نفس مستوى النوع البري ولمجموعة أكبر من مضادات الميكروبات والأصباغ بما في ذلك الإريثروميسين وحمض الفوسيديك وحمض الناليديكسيك وتدفق بروميد الإيثيديوم المستعاد (الجدول 2 والشكل 5 أ). بمعنى آخر ، إما AcrA أو مستوى عالٍ من AcrE ، قادر على استكمال النمط الظاهري الناجم عن نقص جميع PAPs الأربعة. ومع ذلك ، حتى عند إنتاجه على هذا المستوى الأعلى من ذلك بكثير ، لم يقدم أي من MdtA أو MdsA أي مكمل للنمط الظاهري للتدفق من Δمتحولة 4PAP تؤكد الفرضية القائلة بأنها غير قادرة على تكوين نفس التفاعلات المختلطة أو الزائدة عن الحاجة مثل AcrA أو AcrE.

عولجت البكتيريا ببروميد الإيثيديوم و CCCP لمدة 60 دقيقة ثم أعيد تنشيطها بالجلوكوز. البيانات المقدمة هي الوقت المستغرق لتقلل الفلورة بنسبة 25٪ +/- SE. (يمكن رؤية البيانات الخاصة بانخفاض 10٪ و 50٪ في جدول S1). A. يظهر البيانات الخاصة بـ Δسلالة 4PAP مع وبدون تكملة من PAPs واحد B. يظهر بيانات لـ Δ4PAP الذي يفتقر أيضًا إلى AcrB أو AcrF مع أو بدون التكامل مع أكرا أو فدان.

يمكن أن يعمل AcrE مع AcrB

في السلالات المستخدمة لتجارب التكميل ، تم استنساخ الترميز الجيني لـ PAP فقط في البلازميد والإفراط في التعبير ، وليس مضخة RND. بالنظر إلى أنه في ظل الظروف المختبرية القياسية ، يتم التعبير عن المضخة الرئيسية AcrB بمستويات أعلى بكثير من نظيرتها المتجانسة AcrF وهذا تعطيل فدان, acrF أو acrEF لا يغير من قابلية مضادات الميكروبات ، يبدو من المحتمل أن الإفراط في التعبير عن AcrE يمكن أن يمارس تأثيره التكميلي من خلال العمل مع مضخة AcrB بدلاً من ، أو كذلك ، نظام AcrF الأصلي. من أجل تأكيد هذه السلالات التي تم إنشاؤها والتي تفتقر إلى جميع PAPs الأربعة وأحد جينات المضخة ، أكرب أو acrF. تم استكمال هذه الضربة القاضية الخماسية ببلازميدات ترميز أحد PAPs أيضًا أكرا أو فدان. إن حذف ترميز الجينات لأي من المضخات AcrB أو AcrF في سلالة تفتقر بالفعل إلى جميع PAPs الأربعة لم يكن له تأثير كبير على قابلية مضادات الميكروبات ، ويفترض أن نقص PAPs جعل هذه المضخات غير وظيفية (الجدول 3). تكملة مع أي منهما أكرا أو فدان لم يكن قادرًا على زيادة MIC إذا كان AcrB غائبًا مما يشير إلى أن مضخة AcrB هي الوسيط الرئيسي للإنقاذ في تجارب التكميل ، وليس AcrF. بشكل حاسم ، التكامل مع فدان لا يزال يزيد MICs لركيزة المضادات الحيوية ، ويزيد معدل التدفق ويقلل من تراكم سيبروفلوكساسين حتى في غياب المضخة المماثلة ، AcrF ، بينما في حالة عدم وجود AcrB فإنه لا يمكن (الجدول 3 والشكلان 5 ب و S6C). هذا يدل على أن AcrE يمارس تأثيره التكميلي من خلال التفاعل مع AcrB وكذلك ، أو بدلاً من AcrF.

في حالة عدم وجود AcrA ، من الممكن تحديد AcrE over-expression

حقيقة أن AcrE قادر على العمل مع AcrB في غياب AcrF يحتمل أن يعقد مسألة إيجاد مثبطات PAPs لأنه يشير إلى وجود احتمال لمقاومة مثبط يستهدف AcrA فقط من خلال زيادة التعبير عن AcrE. من أجل معرفة ما إذا كان هذا هو احتمال حدوث طفرات ذات حساسية منخفضة للسيبروفلوكساسين تم اختيارها من أكرا متحولة (الشكل 4 ج) لتحديد آلية انخفاض الحساسية. الآلية الأكثر شيوعًا لمقاومة الفلوروكينولونات هي الطفرات داخل منطقة تحديد مقاومة الكينولون (QRDR) من جيرا الجين ونادرا في جيرب [46]. QRDR الخاص بـ جيرا تم تسلسلها في بعض الطفرات المختارة والسلالات المختارة موضحة في الجدول 4. وقد وصفت غالبية الطفرات المختارة طفرات gyrase (على سبيل المثال D87G ، S83F) موضحًا قابليتها المنخفضة للتأثر بالسيبروفلوكساسين. ومع ذلك ، لم يكن هناك متحولة واحدة ، M15 جيرا أو جيرب الطفرات ولكنها زادت من MICs إلى سيبروفلوكساسين والفلوروكينولونات الأخرى وكذلك للأمبيسيلين والإريثروميسين وهما ركائز جيدة التوصيف لتدفق RND. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من عدم وجودها أكرا يبدو أن M15 قد استعاد التدفق حيث تراكمت مستويات مماثلة من صبغة Hoechst وكان لها حركية تدفق مماثلة مثل سلالة النوع البري (الشكل 6 أ و 6 ب). جينوم SE03 (آكر) و M15 وكشف عن تكرار 36 نقطة أساس بما في ذلك جزء من منطقة ربط الحمض النووي صرع في M15 (الشكل 6 ج). RamR هو عامل نسخ عائلي TetR ينظم بشكل سلبي التعبير عن عامل النسخ araC منظم الأسرة RamA ، الذي يعزز التعبير عن أكراب. كشف RT-PCR أنه في التعبير M15 عن راما تمت زيادته بمقدار 76 ضعفًا ، ويفترض أن ذلك يرجع إلى بروتين RamR غير الوظيفي. بالإضافة إلى ذلك ، نسخ الترميز الجيني لـ PAP الثانوي فدان تمت زيادته بمقدار 95 ضعفًا ومضخة RND المماثلة acrF بمقدار 77 ضعفًا (الشكل 6 د). الأهم من ذلك ، وهذا يدل على أنه في حالة عدم وجود أكرا، كان من الممكن اختيار متحولة مع زيادة التعبير عن PAP / مضخة متجانسة وأن هذا كان كافياً لاستكمال النمط الظاهري للطفرة إلى مستويات النوع البري.

أ. تدفق بروميد الإيثيديوم. ب. تراكم Hoechst. ج. رسم تخطيطي لذاكرة الوصول العشوائي مع الازدواجية المميزة بالمربع الأحمر د. في الوقت الحقيقي النسخ العكسي PCR. البيانات من A و B هي متوسط ​​ثلاث مكررات بيولوجية +/- متوسط ​​SE.

المستوى العالي جدًا من التعبير المفرط لـ راما في M15 أدى إلى زيادة التعبير عن أكرب وكلاهما فدان و acrF. ال أكرب و acrF تم تعطيل كل من الجينات في M15 لتوضيح ما إذا كانت استعادة التدفق المكتشفة في هذه السلالة ناتجة عن مستويات عالية من زوج AcrE / AcrF أو إذا كانت التفاعلات المختلطة بين AcrE و AcrB مهمة أيضًا لممارسة هذا التأثير. تعطيل acrF في M15 (Δأكرا ΔacrF) لم يغير من الحساسية لمضادات الميكروبات التي تم اختبارها مقارنةً بالوالد M15 مما يشير إلى أن المستوى العالي من بروتين AcrE الموجود يجب أن يعمل مع مضخة AcrB لتوفير وظيفة التدفق (الجدول 5). تعطيل أكرب بشكل طفيف ، ولكن بشكل متكاثر ، قلل MICs إلى ركيزة من المضادات الحيوية. يشير هذا معًا إلى أن تفاعلات AcrE / AcrB هي الوسيط الرئيسي لقدرة التدفق التي تم إنقاذها في M15 ولكن مجمعات AcrE / AcrF مهمة أيضًا.

تتحقق هذه البيانات معًا من صحة تنبؤاتنا الهيكلية بأن AcrA و AcrE يمكنهما العمل بالتبادل لكن MdtA و MdsA لا يمتلكان هذا التشغيل البيني. بالإضافة إلى ذلك ، لقد أظهرنا أن هذا وثيق الصلة بيولوجيًا لأنه في حالة عدم وجود وظيفة AcrA ، من الممكن الاختيار للتعويض عن طريق زيادة التعبير عن AcrE الذي تم الحفاظ على تسلسلات الصندوق الملزمة بشكل أكبر.

تتحقق الطفرات الموجهة من الموقع من الأدوار الحاسمة لمربعات الربط

لمزيد من التحقق من صحة أدوار مربعات التسلسل المحددة حديثًا ، استهدفنا كلاً من الأكثر حفظًا (المقترح لتشكيل مواقع الإرساء على مستوى الأسرة) والمخلفات غير المحفوظة (من المتوقع أن تعمل كمميزات بين أزواج ناقل PAP المختلفة) عن طريق الطفرات الموجهة للموقع followed by quantitative EtBr efflux assay (Fig 7A) and measurement of antimicrobial susceptibility (S2 Table). Mapping of the mutations onto the structure of the AcrABZ-TolC complex [24] is presented in Fig 7B with the mutations with the statistically significant impact on the efflux function coloured magenta. Significantly most of the boxes appear to have a measurable effect on function, with mutations affecting the conserved residues in box 1 (G58F), box 4 (TT270-271FF GS272-273PP) box 5 (F292G R294F) and box 9 (G363F) being comparable to the phenotype of the Δ4PAP strain, while measurable impact can also be detected for mutations affecting box 6 (R318A), and intriguingly, mutations in some PAP residues which are predicted to only make contact with the RND transporter in one of the two protomers had a measurably impaired efflux–notably PAP1-specific Q310F (PAP1 specific pre-box 6) (see additional comments in the S1 Text). To validate that the observed effects are not due to changes in protein expression levels or stability of the products we introduced a C-terminal His-tag reporter and quantified protein levels using Western blotting (Fig 7C).

أ. Efflux of ethidium bromide by strains complemented with mutated versions of AcrA. Mutants labelled above bar according to which binding box is mutated. Bacteria were treated with ethidium bromide and CCCP for 60 min and then re-energized with glucose. Data presented are the mean of three independent biological replicates and are shown as the time taken for the fluorescence to decrease by 50% +/- SE. Data were analysed by one way ANOVA. B. Mapping of PAP box mutations to the structure of the assembled complex based on the cryo-EM structure of ه. القولونية AcrAB-TolC. The PAP 1 protomer bound to the green RND protomer is colored blue PAP 2 protomer is colored red. For clarity the hairpins of both PAP 1 and PAP 2 protomers are removed. Mutations of residues with prominent phenotypic effect on efflux are colored magenta and the residues responsible are presented in spacefill. Mutations colored orange were responsible for a measurable (although not statistically significant effect) while mutations in green had no measurable effect. The mapping reveals that the majority of the mutations with a statistically significant effect are mapping to the beta-barrel domain of the PAP. In particular, it is notable that the efflux-sensitive mutations cluster around the two beta-hairpins at the crown of the porter domains of the RND-transporter and that the same residues appear to be grasping the hairpin 1 and hairpin 2 respectively in PAP 1 and PAP 2 in a pincer-like fashion. This finding strongly supports the primary role of the beta-hairpins in the PAP assembly. ج. Western Blot analysis of the expression and stability of selected mutated AcrA constructs with pronounced phenotypic effects. C-terminal His-tagged versions of the proteins were expressed from pET20b in السالمونيلا Δ4PAP background and protein expression visualised using a monoclonal anti-His AP-conjugated antibody.

Structural mapping of the mutations revealed that with the exception of the G363 (box 9), the rest of the detrimental mutations belong to β-barrel domain residues of the PAP forming a tight cluster around the β-hairpins (DN and DC respectively) of the AcrB funnel domain, which provides the largest buried surface on the PAP-RND complex. Consistent with this, the mutations within rest of the boxes, that are less conserved and make lower number of interactions with RND protomers had very limited impact on the efflux function.


Restraining the multidrug efflux transporter STY4874 of السالمونيلا Typhi by reserpine and plant extracts

Moazur Rahman, Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan.

Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan

Institute of Engineering and Applied Sciences, Islamabad, Pakistan

These authors contributed equally to this work.Search for more papers by this author

Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan

Institute of Engineering and Applied Sciences, Islamabad, Pakistan

These authors contributed equally to this work.Search for more papers by this author

Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan

Institute of Engineering and Applied Sciences, Islamabad, Pakistan

Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Gujrat, Hafiz Hayat Campus, Gujrat, Pakistan

These authors contributed equally to this work.Search for more papers by this author

Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan

Institute of Engineering and Applied Sciences, Islamabad, Pakistan

Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan

Institute of Engineering and Applied Sciences, Islamabad, Pakistan

Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan

Institute of Engineering and Applied Sciences, Islamabad, Pakistan

Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark

Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan

Institute of Engineering and Applied Sciences, Islamabad, Pakistan

Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan

Institute of Engineering and Applied Sciences, Islamabad, Pakistan

Moazur Rahman, Drug Discovery and Structural Biology group, Health Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan.

الملخص

Efflux-mediated multidrug resistance is a well-known phenomenon facilitated by multidrug resistant (MDR) transporters. One of the approaches to counteract efflux-mediated resistance is the use of MDR pump inhibitors, and thus be used in combination with the conventional antibiotics to treat deadly diseases like typhoid fever. We have previously reported that STY4874, an efflux transporter of السالمونيلا serotype Typhi, exhibited promising characteristics as MDR pump. In this study, we aimed to get an insight into possible STY4874 inhibitors of plant origin. STY4874 was overexpressed in الإشريكية القولونية and extracts from pomegranate peel, milk thistle seeds and reserpine, a synthetic plant alkaloid, were screened for inhibition of ciprofloxacin efflux. The extracts of milk thistle seeds and reserpine when incubated with ciprofloxacin showed statistically significant STY4874-mediated inhibitory activity, rendering the efflux pump inactive and hence early growth inhibition of host cells compared with cells expressing efflux pump and incubated only with ciprofloxacin. This efflux pump inhibitory activity was further confirmed by time-kill experiments. This study is the first to report on efflux pump inhibition of S. Typhi STY4874 and results can be extended towards its close homologues such as MdfA and MdtM from بكتريا قولونية.

Significance and Impact of the Study

Understanding and combating resistance governed by multidrug efflux transporters is an ongoing research intensive area, affecting treatment of various nosocomial and endemic/epidemic infections. Confronting drug resistance requires that inhibitors debilitating the underlying mechanisms should be included in combination therapy. One such example is the prescription of clavulanic acid as combination therapy with amoxicillin, collectively called as co-amoxiclav to combat β-lactamase-mediated resistance. However, research related to finding the inhibitors of efflux transporters, the resistance mechanism distinct from β-lactamase mediated resistance is at an early stage. The current study finds that plant-derived inhibitors can be an option towards restraining efflux-mediated resistance.


In animals, autosomal cells are diploid (2n), with two copies of each chromosome. Germ cells, on the other hand, are haploid (n), containing only one copy of each chromosome. Eukaryotic cells replicate through the cell cycle, a specific series of phases during which a cell grows, synthesizes DNA, and divides. Derangements of the cell cycle can lead to unchecked cell division and may be responsible for the formation of cancer.

Preparation

  • Interphase - DNA is loosely packed chromatin (chromosomes not visible), cell spends most time here (90%)
  • G1 phase (presynthetic gap) - Cell grows to mature size and makes sure it has all material necessary for DNA synthesis, also obtains nutrients and begins metabolism
  • G1 checkpoint (aka restriction point)- Cell irreversibly commits to the cell division process and goes into S phase (if all conditions favorable) or advances into G0. Growth factors (and other external influences) play a role in carrying the cell past the G1 checkpoint. The cell (1) must be of appropriate size, (2) have adequate energy reserves, (3) no damage to DNA.
  • G0 phase (inactive phase) - Cell makes the decision to exit cycle after G1 and does not replicate DNA or divide (ex: fully developed cells in the central nervous system)
  • S phase - DNA is replicated (synthesized) so that each daughter cell will have a complete set of chromosomes after the parent cell divides transition to S phase is signaled by cyclins and CDKs. Following S phase, each chromosome consists of two identical chromatids that are bound together at a specialized region known as the centromere.
  • G2 phase (postsynthetic gap) - Cell grows more and prepares for division by making sure that it has the material (ex: doubles of organelles) necessary for the physical separation and formation of daughter cells
  • G2 checkpoint - Bars entry into mitotic phase if conditions not met. The cell checks for DNA integrity and DNA replication, and if errors or damage are detected, the cell will pause to allow for repairs if the damage is irreparable, the cell may undergo apoptosis. If no problems are found, CDKs signal beginning of mitotic cell division.

Depending on the type of cell, either meiosis or mitosis can proceed.

الانقسام المتساوي

Mitosis, taking up 10% of the cell cycle, divides an autosomal cell into 2 diploid (2n) daughter cells.

  • Prophase - Nucleus and nucleolus disappear chromosomes appear as two identical, connected sister chromatids mitotic spindle (made of microtubules) begins to form centrioles move to opposite poles of the cell (plant cells do not have centrioles)
  • Metaphase - the sister chromatids line up along the middle of the cell, ready to split apart
  • M checkpoint (spindle checkpoint) - occurs near the end of the metaphase stage of mitosis and determines whether all the sister chromatids are correctly attached to the spindle microtubules mitosis will not proceed until the kinetochores of each chromatid pair are firmly anchored to at least 2 spindle fibers arising from the opposite poles of the cell
  • Anaphase - The sister chromatids split and move via the microtubules to opposite poles of the cell (pulled by the spindle apparatus so that each pole of the cell has a complete set of chromosomes
  • Telophase - the nuclei for the newly split cells form the nucleoli reappear, and the chromatin uncoils
  • Cytokinesis - Newly formed daughter cells split apart. Animal cells are split by the formation of a cleavage furrow, plant cells by the formation of a cell plate

الانقسام الاختزالي

Meiosis, divided into two stages, divides one diploid (2n) cell into 4 haploid (n) daughter cells. It occurs in cells of gonads to produce gametes (part of process of sexual reproduction).

الانقسام الاختزالي الأول

  • Prophase I - Each chromosome pairs with its homolog. Crossover (synapsis) occurs in this phase. The nuclear envelope breaks apart and spindle apparatus begins to form.
  • Metaphase I - Chromosomes align along the metaphase plate matched with their homologous partner. This stage ends with the separation of the homologous pairs.
  • Anaphase I - Separated homologous pairs move to opposite poles of the cell.
  • Telophase I - Nuclear membrane reforms process of division begins.
  • Cytokinesis - After the daughter cells split, the two newly formed cells are haploid (n).

Following meiosis I, cells enter a period of rest called interkinesis or prophase II. No DNA replication occurs during this stage.

الانقسام الاختزالي الثاني

  • Prophase II - Nuclear envelope breaks apart and spindle apparatus begins to form.
  • Metaphase II - Sister chromatids line up along the equator of the cell.
  • Anaphase II - Sister chromatids split apart and are called chromosomes as they are pulled to the poles.
  • Telophase II - The nuclei and the nucleoli for the newly split cells return.
  • Cytokinesis - Newly formed daughter cells physically divide.

Biology ch. 1-15

A. Prokaryotes are a more homogenous group of organisms than are eukaryotes.

B. Only prokaryotes have cell walls.

C. Eukaryotic cells have a nucleus.

C. NH2—an amino functional group

D. COOH—a carboxyl functional group

A. Speed up chemical reactions

B. Form antibodies and complement proteins attack pathogens

C. Form Motor and contractile proteins move the cell or molecules within the cell

D) phosphate-sugar-
phosphate-base.

C) 0.34 nanometers per
basepair

A. Lack of the -OH group on each 2′ carbon of the deoxyribose sugar decreases its reactivity.

B. The double-stranded nature of the molecule increases its stability.

C. The hydrophobic interior of DNA is difficult to disrupt due to hydrophobic bonding between the nonpolar nitrogenous bases that orient toward the center.

A. Amino acids, nucleic acids, and carbohydrates all polymerize via condensation reactions.

B. Amino acids, nucleic acids, and carbohydrates can all form complex macromolecules.

C. Amino acids, nucleic acids, and carbohydrates all link as only linear molecules.

A) molecules from areas of higher concentration to areas of lower concentration.

B) molecules from areas of lower concentration to areas of higher concentration.

C) water molecules across a membrane.

D) gas molecules across a membrane.

A) molecules of sugar stop moving.

B) water and sugar molecules are moving at the same speed.

C) the dissolved sugar molecules are evenly distributed throughout the solution.

D) there are the same number of water molecules as dissolved sugar molecules.


Same but different: Researchers uncover a mechanism of how bacteria with the same genotype can show a different phenotype

Bacterial populations pose an intriguing puzzle: in so-called isogenic populations, all bacteria have the same genes, but they still behave differently, for example grow at different speeds. Researchers at the Institute of Science and Technology Austria (IST Austria) now solved a part of this puzzle by studying how the bacterium الإشريكية القولونية divides up a protein complex that detoxifies cells by pumping multiple drugs such as antibiotics out of the cell. They found that when a bacterium divides into two, the pump proteins are distributed so that one cell inherits more of the pump proteins than the other cell. Bacterial cells that inherit more pump proteins grow more quickly in low concentrations of antibiotics. Partitioning the pump protein is one way to achieve different behaviors in a bacterial population, and could be a stepping-stone to developing antibiotic resistance. The study, published in علم, was carried out by an interdisciplinary duo: an experimentalist, Tobias Bergmiller, and a theorist, Anna Andersson, from the groups of C?lin Guet and Ga&scaronper Tka?ik at IST Austria.

A bacterial population is made up of thousands of individual bacteria, all with the same genetic make-up. But these individuals can have a range of phenotypes, i.e. look and behave differently, due to random processes in the cells that influence how the genetic instructions are used. For proteins in the cytosol, the liquid inside the cell, these random molecular processes include differences in the break-down of proteins, or random partitioning into the two cells that form during cell division. In the current study, the researchers looked at how a protein complex in the cell envelope, which surrounds the cell, contributes to this heterogeneity or diversity of phenotypes.

AcrAB-TolC, the protein complex studied, is the main protein complex that pumps drugs out of الإشريكية القولونية الخلايا. It is found in the cell envelope, where proteins cluster together as "islands." Unlike in the cytosol, where proteins are generally well-mixed by diffusion, proteins in the envelope can segregate asymmetrically. Some of these clusters form at the cell poles, the rounded ends of rod-shaped bacteria like الإشريكية القولونية. In these bacteria, the cells that are "born" at cell division can be distinguished by their poles. One cell, the mother cell, keeps an old cell pole that originated in a past division, where efflux pump proteins have formed stable clusters.

The authors show that AcrAB-TolC accumulates at these old cell poles in mother cells. These mother cells can pump out drugs more efficiently than the daughter cells which did not inherit old cell poles. At low concentrations of antibiotics, the mother cells grow faster than daughter cells. Based on these observations, the researchers developed a mathematical model to identify how this biased partitioning of the drug pump affects the bacterial population. They found that mother cells which can pump out drugs quickly become more common. The population becomes heterogeneous as this extreme phenotype becomes more prevalent as this heterogeneity is long lived.

C?lin Guet explains how biased partitioning may be one step on the road to antibiotic resistance: "Recent research by other groups has shown that mutations that cause antibiotic resistance can emerge quickly at low concentrations of antibiotics. Such low concentrations are increasingly found in natural habitats or in patients during drug treatments. Indeed, studies looking at selection due to antibiotics have found that AcrAB, the genes we studied, were amplified. Heterogeneity in a bacterial population that arises through a mechanism of biased partitioning of drug efflux pumps, as we identified in our study, could be a stepping-stone on the path of bacterial populations towards antibiotic resistance."