معلومة

البكتيريا بدون بلازميد

البكتيريا بدون بلازميد


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أعمل حاليًا على مقاومة المضادات الحيوية وسأكون مهتمًا جدًا بمعرفة البكتيريا التي لا تحتوي على بلازميد ، بطريقة مماثلة مرض السل. سيساعدني هذا كثيرًا في عملي ولم أنجح في الحصول على الكثير من المعلومات عبر الإنترنت.

شكرا جزيلا على اجاباتك !


قد ترغب في إلقاء نظرة على العصوية الرقيقة. لا تحتوي معظم سلالات المختبر على البلازميدات ، على الرغم من وجودها في بعض العزلات البيئية.

https://academic.oup.com/femsre/article/21/4/337/490925

كل هذا يعتمد على ما تبحث عنه بالضبط: نوع ليس له بلازميدات معروفة في أي عزلات ، أو بعض سلالات المختبر الشائعة الاستخدام بدون بلازميدات؟

م هي حالة فريدة جدًا. معظم الأنواع الأخرى في المتفطرة جنس يحتوي على البلازميدات.


التحول البكتيري

التكنولوجيا الحيوية يشير إلى التكنولوجيا المستخدمة لمعالجة الحمض النووي. غالبًا ما يشار إلى الإجراءات باسم الهندسة الوراثية.

الحمض النووي هو المادة الجينية لجميع الكائنات الحية وجميع الكائنات الحية تستخدم نفس الشفرة الجينية. يمكن نسخ الجينات من نوع واحد من الكائنات الحية وترجمتها عند وضعها في نوع آخر من الكائنات الحية.

على سبيل المثال ، يتم وضع الجينات البشرية والجينات الأخرى بشكل روتيني في البكتيريا من أجل تصنيع المنتجات للعلاج الطبي والاستخدام التجاري. تنتج البكتيريا الأنسولين وهرمون النمو البشري واللقاحات.

الحمض النووي معاد التركيب يشير إلى الحمض النووي من مصدرين مختلفين. الأفراد الذين يتلقون الجينات من الأنواع الأخرى هم المعدلة وراثيا.

ثلاثة أبعاد

النواقل عبارة عن دنا يستخدم لنقل الجينات إلى خلية مضيفة.

البلازميدات يمكن استخدامها كناقلات لتحويل البكتيريا. تمتص البكتيريا المضيفة البلازميد الذي يتضمن الجين الأجنبي.

يمكن استخدام جينات الواسمات لتحديد ما إذا كان قد تم تناول الجين. يجب أن يكون للجينات الواسمة بعض الخصائص المميزة. على سبيل المثال ، إذا وضعت جينًا يمكّن مقاومة الأمبيسلين على نفس الناقل مثل نفس ناقل الجين الخاص بالبروتين الفلوري الأخضر ، فإن أي بكتيريا تنمو على لوحة الأمبيسلين سيكون لها أيضًا جين البروتين الفلوري الأخضر. البكتيريا التي لا تحتوي على الجين لن تعيش على هذه الصفائح.

البلازميد pGLO

تم تعديل البلازميد المستخدم في هذا التمرين عن طريق إزالة الجينات الهيكلية لأوبيرون الأرابينوز (ara A و ara B و ara D). تم استبدال هذه الجينات بجين من قنديل البحر ذو الإضاءة الحيوية والذي يرمز لإنتاج البروتين الفلوري الأخضر (GFP). يضيء هذا البروتين عندما يضيء بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. لأن هذا الجين مجاور لمحفز الأرابينوز ، فإنه يصبح نشطًا في وجود الأرابينوز. يسمى البلازميد المعدل pGLO.

يحتوي بلازميد pGLO أيضًا على جين يمكّن البكتيريا من مقاومة المضاد الحيوي الأمبيسلين. البكتيريا التي تناولت هذا البلازميد قادرة على النمو على الوسائط التي تحتوي على الأمبيسلين.

المواد المطلوبة

ستحتاج كل مجموعة إلى المعدات التالية:

4 أنابيب دقيقة (تجاهل ألوان الأنابيب):

1 أنبوب صغير يحتوي على محلول التحول

1 أنبوب صغير يحتوي على مرق LB

1 أنبوب دقيق فارغ معنون + (أو + DNA)

1 أنبوب دقيق فارغ مكتوب عليه - (أو - DNA)

1 وعاء من الماء المثلج

1 حزمة من. حلقات التلقيح

1 ماصة ميكروية قادرة على قياس 250 ميكرولتر وأطراف الماصة المجهرية

1 ماصة ميكروية قادرة على قياس 100 ميكرولتر وأطراف الماصة المجهرية

إجراء

أضف محلول التحويل (CaCl2)

يحتوي حامل الأنابيب الدقيقة الرغوية على أنبوب دقيق مع محلول تحويل يسمى T.S. يظهر هذا الأنبوب في الرسم البياني أعلاه. استخدم الماصة الدقيقة لنقل 250 ميكرولتر من محلول التحويل من أنبوب TS في حامل الرغوة إلى الأنبوب المسمى + DNA و 250 ميكرولتر أخرى إلى الأنبوب المسمى -DNA.

ضع الأنابيب مرة أخرى في حامل الأنابيب الدقيقة الرغوية ثم ضع الأنابيب الأربعة في وعاء من الماء المثلج لمدة دقيقتين.

أضف البكتيريا

استخدم حلقة معقمة لالتقاط عدة مستعمرات من البكتيريا من لوحة البداية. يمكن القيام بذلك عن طريق سحب الحلقة عبر اللوحة بحيث تزيل المستعمرات قليلاً عن السطح. انقل البكتيريا إلى أنبوب DNA + عن طريق تدوير الحلقة بسرعة بعد غمرها في السائل.

كرر هذا الإجراء عن طريق نقل عدة مستعمرات من البكتيريا إلى أنبوب DNA.

أضف الحمض النووي

سيقدم لك مدربك زجاجة تحتوي على حمض DNA البلازميد. اغمر حلقة معقمة في الزجاجة التي تحتوي على DNA البلازميد. عندما يكون مركز الحلقة مغلفًا بفيلم شبيه بالصابون ، انقله + أنبوب دقيق للحمض النووي (انظر الصورة أدناه). استخدم حلقة معقمة جديدة لنقل حلقة ثانية من DNA البلازميد إلى نفس الأنبوب الدقيق (+ DNA). لن يستقبل الأنبوب الدقيق - DNA أي DNA بلازميد.

تعويم الأنبوبين في حامل الرغوة في الماء المثلج لمدة 10 دقائق.

ملخص

يحتوي أنبوب + DNA على بكتيريا و DNA من مصدر آخر. يحتوي أنبوب - DNA على البكتيريا فقط.

اثناء الانتظار.

أثناء انتظار تبريد الأنابيب ، استخدم علامة لتسمية لوحات أجار الخاصة بك بحرف يشير إلى نوع البكتيريا التي ستتلقاها.

طبق ملصق تعليقات
LB / أمبير + ستتلقى هذه اللوحة البكتيريا المتحولة
LB / أمبير / آرا + ستتلقى هذه اللوحة البكتيريا المتحولة
LB / أمبير - ستتلقى هذه اللوحة بكتيريا طبيعية غير محولة
رطل - ستتلقى هذه اللوحة بكتيريا طبيعية غير محولة

صدمة حرارية

يتم استخدام الصدمة الحرارية لصنع بكتريا قولونية خلايا أكثر نفاذاً بحيث تمتص البلازميدات المعدلة بسهولة أكبر.

أحضر وعاء الماء المثلج والأنابيب الدقيقة إلى حمام مائي 42 درجة.

انقل حامل الأنابيب الدقيقة الذي يحتوي على أنابيب + و- إلى حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 50 ثانية بالضبط ثم أعد الأنابيب إلى الثلج والماء. من المهم أن تستمر هذه الصدمة الحرارية لمدة 50 ثانية بالضبط. للتأكد من أن الوقت صحيح تمامًا ، اطلب من شخص وقت الإجراء بينما يقوم شخص آخر بنقل الأنابيب إلى الحمام المائي وإعادتها بعد مرور 50 ثانية.

اترك الأنابيب في الماء المثلج لمدة دقيقتين.

قم بإزالة حامل الأنابيب الدقيقة الذي يحتوي على الأنابيب الدقيقة من الماء المثلج وضعه على سطح المنضدة. أضف 250 ميكرولتر من مرق LB لكل مزرعة بكتيرية (الأنبوب + والأنبوب) باستخدام الماصة المجهرية.

اترك الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

نقل البكتيريا إلى لوحات الثقافة

امزج المحتويات في كل أنبوب من خلال النقر عليها بظفر إصبع السبابة.

نقل 100 ميكرولتر من المحلول من الأنابيب الدقيقة + إلى سطح أجار إحدى اللوحات المسمى + باستخدام ماصة مجهرية. نقل 100 ميكرولتر إلى اللوحة الأخرى المسمى +. عند الانتهاء ، ستحتوي كل لوحة تحمل علامة + على 100 ميكرولتر من البكتيريا من الأنبوب +.

استخدم طرف ماصة مختلفًا لنقل 100 ميكرولتر من المحلول من - الأنابيب الدقيقة إلى سطح الأجار في إحدى اللوحات المسمى -. نقل 100 ميكرولتر إلى اللوحة الأخرى المسمى -.

انشر الخليط على كامل سطح الأجار في إحدى اللوحات باستخدام حلقة معقمة. استخدم حلقات معقمة مختلفة لنشر الخلائط في الأطباق الأخرى. يوضح الرسم البياني أدناه تقنية معقمة.

احتضان اللوحات

اقلب الألواح بحيث يكون الأجار لأعلى والغطاء على الجانب السفلي. قم بتجميعهم فوق الآخر ثم قم بربطهم معًا. اكتب اسمك على الشريط.

سيقوم مدرسك بنقل لوحاتك إلى حاضنة درجة 37 في مختبر الأحياء الدقيقة. سيبقون في الحاضنة لمدة 24 إلى 48 ساعة.

التخلص والتنظيف

يجب التخلص من الحلقات المستخدمة ، والماصات المستخدمة ، وحامل الرغوة ، والأنابيب الدقيقة في وعاء خطر بيولوجي. يجب أيضًا التخلص من صفيحة الأجار التي تحتوي على البكتيريا التي استخدمتها في ثقافتك الأولية في وعاء خطر بيولوجي.

يجب رش سطح منطقة عملك بمطهر ومسحه بمناشف ورقية.

لا تنس أن تغسل يديك قبل مغادرة المختبر.

اليوم الثاني - جمع البيانات وملخصها

سجل نتائجك في دفتر ملاحظاتك.

اشرح لكل لوحة لماذا يجب أن يكون هناك نمو أو لا نمو ولماذا يجب أن يتوهج أو لا يتوهج. يجب تضمين جدول مثل الجدول أدناه في دفتر ملاحظاتك.


استخدام البكتيريا

تتمثل إحدى الطرق الشائعة في الهندسة الوراثية في العثور على جين لمنتج مفيد (مثل الأنسولين) والحصول على كائن حي دقيق لإنتاجه. المتجه الذي يحمل الأشياء بين الأنواع. عند استخدام البكتيريا ، يكون المتجه هو بلازميد وهي عبارة عن دائرة من الحمض النووي الموجودة في السيتوبلازم البكتيري. يمكن فتحه بسهولة للسماح بإدخال جزء من الحمض النووي فيه. يمكن تشجيع المتجه على دخول الخلية بواسطة صدمة حراريةحيث ترتفع درجة الحرارة بسرعة من 0 إلى 40 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، يمكنك أيضا استخدام التفريد الكهربي، حيث يستخدم الجهد العالي لتعطيل غشاء الخلية.


توضح الخطوات المذكورة أعلاه كيفية إضافة الجين إلى البلازميد. يحتوي البلازميد بالفعل على جين لـ مقاومة المضادات الحيوية إلى التتراسيكلين والأمبيسلين - كما يتضح من المناطق السوداء. ثم يتم إدخال نوكلياز مقيد من شأنه قطع الجين الموجود بين جين مقاومة التتراسيكلين. هنا ، يتم إضافة جين الأنسولين. في الجزء السفلي من الرسم البياني يوضح النتائج المحتملة لهذا الموقف.

هناك حالة أخرى من البلازميد ، وهي نفس الحالة B ، ولكن بدلاً من جين الأنسولين الذي يعطل جين مقاومة Tetra ، فهو جزء جيني آخر (لسنا مهتمين به). لتبسيط الشرح تم حذف هذا.

في الخطوة 3 ، يتم استزراع البكتيريا المختلفة مع هذه البلازميد. باستخدام عملية تسمى تصفيح طبق الأصل حيث يتم وضع قطعة من المخمل فوق بكتيريا اللوحة الرئيسية ، ثم يتم نقلها لعمل نسخة على التي تليها. تُزرع الثقافات بعد ذلك على طبق يحتوي على الأمبيسلين ، وهذا سيقتل البكتيريا دون مقاومة الجين ، أي البكتيريا التي تحتوي على البلازميد ج (حلقة على الأنسولين) والبكتيريا بدون البلازميد لدينا على الإطلاق. ما يتبقى على لوحة Amp سيكون بكتيريا بها بلازميدات A و B (انظر الرسم البياني أعلاه). يتم نقل هذه الآن إلى لوحة نهائية تحتوي على التتراسيكلين. هذا سوف يقتل البكتيريا التي تحتوي على البلازميد ب لأن التيترا. كان الجين المقاومة تعطلت بواسطة جين الأنسولين. الآن كل ما يتعين علينا القيام به هو مقارنة المستعمرات البكتيرية لمعرفة مكان وجود البكتيريا المحتوية على الأنسولين.


كيف يمكن استخدام المضادات الحيوية في المختبر؟

تاريخيًا ، استخدمت المضادات الحيوية أيضًا لتعطيل الجينات على المستوى الكروموسومي. أدخل العلماء شريط مقاومة للمضادات الحيوية داخل منطقة الترميز للجين الذي يحاولون تعطيله أو حذفه ، مما يؤدي إلى تعطيل الجين ويعمل كعلامة للطفرة. عند تصميم هذه الأنواع من التجارب ، من الأفضل عدم استخدام نفس شريط المقاومة للطفرة ولانتقاء البلازميد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للعلماء استخدام فقدان المقاومة كمؤشر لنجاح الاستنساخ. في هذه الحالات ، يحتوي ناقل الاستنساخ عادةً على شريطين منفصلين للمقاومة ويتم استنساخ الجين الذي تريده في / يعطل أو يزيل كليًا (في حالة استنساخ البوابة) شريط واحد. يسمح الانتقاء العداد للعالم باختيار البكتيريا التي تقاوم فقط المضاد الحيوي الذي يظل سليماً.


امتصاص البكتيريا للبلازميد: مقارنة بين الطرق والكفاءات

كانت القدرة على إدخال جزيئات فردية من DNA البلازميد في الخلايا عن طريق التحول ذات أهمية مركزية للتقدم السريع الأخير في بيولوجيا البلازميد ولتطوير طرق استنساخ الحمض النووي. تتطلب المعالجة الجينية الجزيئية للبكتيريا تطوير أنظمة تحويل بوساطة البلازميد والتي تشمل (1) التحول الكيميائي ، (2) التحول الكهربائي ، (3) التحول البيولوجي ، و (4) التحول الصوتي ، مما يؤدي إلى إدخال DNA البلازميد الخارجي. في الخلايا البكتيرية. في هذه المراجعة ، تم وصف خصائص المعالجة وكفاءات التحويل لهذه التقنيات. بالإضافة إلى هذه الأساليب ، تم تطوير تقنية تحويل جديدة من الناحية المفاهيمية ، وهي طريقة التعرض للهيدروجيل. توفر طريقة التعرض للهيدروجيل ، المستندة إلى تأثير يوشيدا ، تقدمًا كبيرًا على الوسائل الكيميائية لتحويل العديد من سلالات الإشريكية القولونية ومجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية الأخرى. تم اقتراح المصطلح الجديد "تحولات تريبوس" لهذه التقنية الجديدة. لقد قررنا أيضًا ، مقارنة بالطرق التقليدية ، أن طريقة التعرض للهيدروجيل هي طريقة جديدة ومريحة يمكن من خلالها تحويل البكتيريا.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


النتائج

التحديد المحدد لعمليات الانتقال المزدوجة عن طريق تبديل حالة بيري

المطثية acetobutylicum هو كائن صناعي ينتج بشكل طبيعي الوقود الحيوي الممتاز من البيوتانول ، ولكن يمكن تحسين الإنتاجية والنوعية واستخدام المواد الأولية لعملية التخمير عن طريق إضافة إنزيمات غير متجانسة ترميز الحمض النووي (10). حفزنا هذا على تطوير طريقة قوية لتكامل الحمض النووي لـ C. acetobutylicum . يتطلب نهجنا الأول جينًا يمكن اختياره بشكل إيجابي وسلبي ، مثل بيري أو بيرف ، الذي يشفر إنزيمات التخليق الحيوي للبيريميدين orotate phosphoribosyltransferase و orotidine 5-phosphate decarboxylase ، على التوالي. الخلايا التي تحتوي على بيري و بيرف يمكن اختيارها على وسط نمو يفتقر إلى اليوراسيل ، حيث إنها ضرورية لتخليق اليوراسيل الحيوي. على العكس من ذلك ، الخلايا التي تفتقر إلى أي منهما بيري أو بيرف يمكن اختياره على وسط نمو مكمل بـ FOA ، حيث أن هذا المركب شديد السمية فقط للخلايا التي تحتوي على هذا المسار. تم استخدام FOA في الاختيار المضاد لبعض الوقت (11) وفي الكائنات الحية المختلفة (12-17) بما في ذلك مؤخرًا في المطثية الحرارية ( 18 ).

لعزل الحيوانات المستنسخة مزدوجة التقاطع من خلال استغلال تغيير في حالة بيري ، قمنا بتصميم كاسيت تبادل أليل خاص (الشكل 1 أ). إن منطقتي التماثل ذات أطوال مختلفة جدًا ، في محاولة للتحكم في ترتيب أحداث إعادة التركيب. منطقة تماثل طويلة تقابل 1200 نقطة أساس مباشرة في اتجاه مجرى النهر بيري يهدف إلى توجيه حدث إعادة التركيب الأول بحيث تكون الغالبية العظمى من الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع نتيجة إعادة التركيب في هذه المنطقة ، والتي لن تؤدي إلى تعطيل بيري . حدث إعادة التركيب اللاحق في منطقة ثانية أصغر بكثير من التماثل المقابلة لجزء داخلي 300 نقطة أساس من بيري من شأنه استئصال البلازميد ، مما ينتج عنه خلايا عبور مزدوجة مقاومة لـ FOA (FOA R) حيث بيري الجين غير نشط ، ويتم تسليم الحمض النووي بشكل ثابت إلى الكروموسوم.

تكامل الحمض النووي في بيري موضع C. acetobutylicum . ( أ ) اختيار مستنسخات مستقرة مزدوجة كروس باستخدام pMTL-JH12. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الأول (تكامل البلازميد) من خلال المنطقة الطويلة للتماثل بين pMTL-JH12 و هيدا . يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الثاني (استئصال البلازميد) من خلال منطقة التماثل القصيرة بين pMTL-JH12 وجزء داخلي من بيري . يتم تحديد النسخ المتقاطعة المزدوجة باستخدام FOA. ( ب ) فحص PCR لثمانية مستنسخات أحادية كروس مرشحة باستخدام البادئات lacZa-sF2 و Cac-hydA-sR2 ، والتي تصلب إلى الكروموسوم أحادي التقاطع كما هو موضح في (A). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي البلازميد ، pMTL-JH12 plasmid DNA control WT ، من النوع البري C. acetobutylicum التحكم الجيني DNA 1-8 ، المستنسخات المرشحة. يظهر جميع المرشحين الثمانية النطاق المتوقع 1428 نقطة أساس. ( ج ) فحص PCR لثمانية مستنسخات مزدوجة كروس مرشحة باستخدام البادئات CAC0026-sF2 و M13F التي تصلب إلى الكروموسوم المزدوج المتقاطع كما هو موضح في (أ). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي البلازميد ، pMTL-JH12 plasmid DNA control WT ، من النوع البري C. acetobutylicum التحكم الجيني DNA 1-8 ، المستنسخات المرشحة. جميع المرشحين الثمانية يظهرون النطاق المتوقع 558 نقطة أساس. ( د ) اختيار مستنسخات مستقرة مزدوجة كروس باستخدام pMTL-JH14. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الأول (تكامل البلازميد) من خلال المنطقة الطويلة للتماثل بين pMTL-JH14 و هيدا / لاكز . يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الثاني (استئصال البلازميد) من خلال منطقة التماثل القصيرة بين pMTL-JH14 والجزء المقابل من بيري . يتم اختيار الحيوانات المستنسخة مزدوجة التقاطع باستخدام وسط نمو يفتقر إلى اليوراسيل. ( ه ) فحص PCR لسبعة مستنسخات مزدوجة كروس مرشحة باستخدام البادئات CAC0026-sF2 و M13F والتي تصلب إلى الكروموسوم المزدوج المتقاطع كما هو موضح في (C). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي البلازميد ، pMTL-JH14 plasmid DNA control 1–7 ، المستنسخات المرشحة. ضوابط استخدام الحمض النووي من اثنين من بيري يتم تمييز الحيوانات المستنسخة -minus التي تم الحصول عليها في (A) على أنها استنساخ أصلي. يُظهر جميع المرشحين السبعة النطاق المتوقع 861 نقطة أساس ، وتُظهر النسخ الأصلية النطاق المتوقع 558 نقطة أساس. تتوافق هذه الزيادة البالغة 303 نقطة أساس مع استعادة المقطوعة بيري الجين إلى الطول الكامل.

تكامل الحمض النووي في بيري موضع C. acetobutylicum . ( أ ) اختيار مستنسخات مستقرة مزدوجة كروس باستخدام pMTL-JH12. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الأول (تكامل البلازميد) من خلال المنطقة الطويلة للتماثل بين pMTL-JH12 و هيدا . يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الثاني (استئصال البلازميد) من خلال منطقة التماثل القصيرة بين pMTL-JH12 وجزء داخلي من بيري . يتم تحديد النسخ المتقاطعة المزدوجة باستخدام FOA. ( ب ) فحص PCR لثمانية مستنسخات أحادية كروس مرشحة باستخدام البادئات lacZa-sF2 و Cac-hydA-sR2 ، والتي تصلب إلى الكروموسوم أحادي الكروس كما هو موضح في (A). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي البلازميد ، pMTL-JH12 plasmid DNA control WT ، من النوع البري C. acetobutylicum التحكم الجيني DNA 1-8 ، المستنسخات المرشحة. يظهر جميع المرشحين الثمانية النطاق المتوقع 1428 نقطة أساس. ( ج ) فحص PCR لثمانية مستنسخات مزدوجة كروس مرشحة باستخدام البادئات CAC0026-sF2 و M13F التي تصلب إلى الكروموسوم المزدوج المتقاطع كما هو موضح في (أ). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي البلازميد ، pMTL-JH12 plasmid DNA control WT ، من النوع البري C. acetobutylicum التحكم الجيني DNA 1-8 ، المستنسخات المرشحة. جميع المرشحين الثمانية يظهرون النطاق المتوقع 558 نقطة أساس. ( د ) اختيار مستنسخات مستقرة مزدوجة كروس باستخدام pMTL-JH14. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الأول (تكامل البلازميد) من خلال المنطقة الطويلة للتماثل بين pMTL-JH14 و هيدا / لاكز . يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الثاني (استئصال البلازميد) من خلال منطقة التماثل القصيرة بين pMTL-JH14 والجزء المقابل من بيري . يتم اختيار الحيوانات المستنسخة المزدوجة المتقاطعة باستخدام وسط نمو يفتقر إلى اليوراسيل. ( ه ) فحص PCR لسبعة مستنسخات مزدوجة كروس مرشحة باستخدام البادئات CAC0026-sF2 و M13F التي تصلب إلى الكروموسوم المزدوج المتقاطع حيث هو مبين في (C). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي البلازميد ، pMTL-JH14 plasmid DNA control 1–7 ، المستنسخات المرشحة. ضوابط استخدام الحمض النووي من اثنين من بيري يتم تمييز الحيوانات المستنسخة -minus التي تم الحصول عليها في (A) على أنها استنساخ أصلي. يُظهر جميع المرشحين السبعة النطاق المتوقع 861 نقطة أساس ، وتُظهر النسخ الأصلية النطاق المتوقع 558 نقطة أساس. تتوافق هذه الزيادة البالغة 303 نقطة أساس مع استعادة المقطوعة بيري الجين إلى الطول الكامل.

قمنا ببناء البلازميد pMTL-JH12 (الشكل 1 أ) ، والذي يتضمن كاسيت تبادل الأليل الموصوف أعلاه ، وعلامة مقاومة الكلورامفينيكول / ثيامفينيكول catP وأصل النسخ من عصية البلازميد pIM13 (19). مثل العديد من المطثيات الأخرى والعديد من الكائنات الحية الأخرى ، C. acetobutylicum لا يتم تحويله بكفاءة عن طريق التثقيب الكهربائي ، لذلك ليس من العملي بشكل عام استخدام البلازميدات الانتحارية (أي ، لا تظهر مستعمرات على الصفائح الانتقائية بعد التثقيب الكهربائي للبلازميدات الانتحارية). بدلاً من ذلك ، يتم استخدام البلازميدات التكاثرية ، لذلك يتم الحصول على المحولات بسهولة. يعرض النسخ المتماثل pIM13 عدم الاستقرار العنصري في C. acetobutylicum (7) ، والمستنسخات أحادية التقاطع التي تنشأ تلقائيًا داخل المجموعات المتحولة يمكن عزلها عن طريق ثقافة فرعية تحت اختيار المضادات الحيوية.

المطثية acetobutylicum تم تحويل الخلايا باستخدام DNA pMTL-JH12 وطليها على وسط مكمل بالثيامفينيكول واليوراسيل. بشكل نموذجي ، كانت 10-100 مستعمرة مرئية بعد فترة الحضانة لمدة 24-48 ساعة ، وتمت زراعة نسختين من كل من التحولات الأربعة المستقلة مرتين على نفس الوسط. تم فحص الحيوانات المستنسخة الثمانية الناتجة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتبين أن جميعها عبارة عن نسخ أحادية متقاطعة تم فيها دمج pMTL-JH12 في الكروموسوم عبر إعادة التركيب المتماثل في المنطقة الطويلة للتماثل ، على النحو المنشود (الشكل 1 ب). بعد ذلك ، تمت تربية الحيوانات المستنسخة الثمانية أحادية التقاطع على وسط مكمل بـ FOA و uracil لتحديد المطلوب بيري - الحيوانات المستنسخة مزدوجة كروس. تم الحصول على مستعمرات FOA R من كل من الثقافات الفرعية الثماني المستقلة ، وتمت تنقية استنساخ واحد من كل منها عن طريق الثقافة الفرعية مرة أخرى على نفس الوسيلة. أظهر فحص PCR النمط الجيني المزدوج المتقاطع المتوقع لجميع الحيوانات المستنسخة الثمانية (الشكل 1 C) ، وأكد الطلاء المتماثل على الوسط مع وبدون ثيامفينيكول عدم وجود البلازميد المنقولة. catP علامة.

تستبدل الإستراتيجية الموضحة أعلاه بشكل فعال الجين القابل للاختيار بشكل سلبي بتسلسل الاهتمام ، والذي يمكن تحقيقه باستخدام كاسيت تبادل الأليل التقليدي (14). الاختلاف الجوهري هو أن ملف بيري تم تكوين موضع سلالة المؤتلف التي تم إنشاؤها باستخدام pMTL-JH12 خصيصًا لتسهيل التعديل الوراثي اللاحق (الشكل 1 د). غير وظيفية بيري لا يتم حذف الجين الموجود في هذه الخلايا تمامًا ، بل يتم اقتطاعه فقط في النهاية 3′. إعادة التركيب المتماثل بين هذا الجزئي بيري الجين والنظير المناسب الجزئي بيري الجين ، الذي تم تقصيره مسبقًا عند الطرف 5′ ، سيؤدي إلى جين وظيفي كامل الطول. قمنا ببناء بلازميد pMTL-JH14 ، وهو مطابق تقريبًا لـ pMTL-JH12 ، باستثناء الجزء الداخلي 300 نقطة أساس من بيري الذي يشتمل على منطقة التماثل الصغيرة يتبعه مباشرة باقي بيري تسلسل الترميز (الشكل 1 د). كما كان من قبل ، فإن منطقة التماثل الطويلة تهدف إلى توجيه تكامل البلازميد ، دون التأثير على بيري النمط الظاهري. سيؤدي الاستئصال اللاحق للبلازميد عبر منطقة التماثل القصيرة التي تبلغ 300 نقطة أساس إلى استنساخ مزدوج التقاطع المطلوب ، والذي يمكن تحديده على وجه التحديد من خلال بيري -إيجابي ، النمط الظاهري uracil prototrophic. قمنا بتحويل أحد المباني التي شيدناها سابقًا بيري الحيوانات المستنسخة متحولة C. acetobutylicum باستخدام الحمض النووي pMTL-JH14 ، والمحولات المختارة على ألواح مكملة بالثيامفينيكول واليوراسيل وزرعها مرتين على هذا الوسط. لتحديد بيري المستنسخات الإيجابية ، تمت زراعة الخلايا في وسط يفتقر إلى اليوراسيل. تم تنقية سبعة مستنسخات مستقلة وتبين أنها عمليات الانتقال المزدوجة المقصودة بواسطة PCR (الشكل 2 د) وحساسية ثيامفينيكول.

تكامل الحمض النووي في thl موضع C. acetobutylicum . ( أ ) اختيار مستنسخات مستقرة مزدوجة كروس باستخدام pMTL-JH31. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الأول (تكامل البلازميد) من خلال المنطقة الطويلة للتماثل بين pMTL-JH31 و CAC2872 / atpB . يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الثاني (استئصال البلازميد) من خلال منطقة التماثل القصيرة بين pMTL-JH31 والنهاية 3′ من thl . يتم اختيار الحيوانات المستنسخة المزدوجة المتقاطعة باستخدام وسط نمو يفتقر إلى اليوراسيل. ( ب ) فحص PCR لخمسة مستنسخات مزدوجة كروس مرشحة باستخدام البادئات Cac-thl-sF1 و M13F والتي تصلب كما هو موضح في (A). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي البلازميد ، pMTL-JH31 plasmid DNA control WT ، من النوع البري C. acetobutylicum التحكم الجينومي في الحمض النووي 1-5 ، المستنسخات المرشحة. جميع المرشحين الخمسة يظهرون النطاق المتوقع 1101 نقطة أساس. ( ج ) اختيار مستنسخات مستقرة مزدوجة كروس باستخدام تحتوي على pMTL-JH16 ADH . يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الأول (تكامل البلازميد) من خلال المنطقة الطويلة للتماثل بين pMTL-JH16 و CAC2872 / atpB . يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الثاني (استئصال البلازميد) من خلال منطقة التماثل القصيرة بين pMTL-JH16 ونهاية 3′ من thl . يتم اختيار الحيوانات المستنسخة مزدوجة التقاطع باستخدام الاريثروميسين. ( د ) فحص PCR لمرشح واحد ADH - التعبير عن استنساخ مزدوج كروس باستخدام البادئات Cac-thl-sF1 و Cac-atpB-sR1 التي تلدين كما هو محدد في (C). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي WT ، من النوع البري C. acetobutylicum التحكم الجينومي في الحمض النووي الذي يظهر النطاق المتوقع 1660 نقطة أساس ADH ، استنساخ مرشح يظهر النطاق المتوقع 3523 نقطة أساس. ( ه ) تركيزات الأسيتون والأيزوبروبانول في طاف الثقافات البرية من النوع C. acetobutylicum (WT) أو ملف ADH - التعبير عن استنساخ مؤتلف بعد 72 ساعة من النمو. تختلف تركيزات كل من منتجات التخمير بشكل كبير بين السلالتين ( ص & لتر 0.01).

تكامل الحمض النووي في thl موضع C. acetobutylicum . ( أ ) اختيار مستنسخات مستقرة مزدوجة كروس باستخدام pMTL-JH31. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الأول (تكامل البلازميد) من خلال المنطقة الطويلة للتماثل بين pMTL-JH31 و CAC2872 / atpB . يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الثاني (استئصال البلازميد) من خلال منطقة التماثل القصيرة بين pMTL-JH31 والنهاية 3′ من thl . يتم اختيار الحيوانات المستنسخة مزدوجة التقاطع باستخدام وسط نمو يفتقر إلى اليوراسيل. ( ب ) فحص PCR لخمسة مستنسخات مزدوجة كروس مرشحة باستخدام البادئات Cac-thl-sF1 و M13F والتي تصلب كما هو موضح في (A). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي البلازميد ، pMTL-JH31 plasmid DNA control WT ، من النوع البري C. acetobutylicum التحكم الجينومي في الحمض النووي 1-5 ، المستنسخات المرشحة. جميع المرشحين الخمسة يظهرون النطاق المتوقع 1101 نقطة أساس. ( ج ) اختيار مستنسخات مستقرة مزدوجة كروس باستخدام تحتوي على pMTL-JH16 ADH . يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الأول (تكامل البلازميد) من خلال المنطقة الطويلة للتماثل بين pMTL-JH16 و CAC2872 / atpB . يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. يتم التوسط في حدث إعادة التركيب الثاني (استئصال البلازميد) من خلال منطقة التماثل القصيرة بين pMTL-JH16 ونهاية 3′ من thl . يتم اختيار الحيوانات المستنسخة مزدوجة التقاطع باستخدام الإريثروميسين. ( د ) فحص PCR لمرشح واحد ADH - التعبير عن استنساخ مزدوج كروس باستخدام البادئات Cac-thl-sF1 و Cac-atpB-sR1 التي تلدين كما هو محدد في (C). MW ، 2-Log DNA Ladder (NEB) علامة الوزن الجزيئي WT ، من النوع البري C. acetobutylicum التحكم الجينومي في الحمض النووي الذي يظهر النطاق المتوقع 1660 نقطة أساس ADH ، استنساخ مرشح يظهر النطاق المتوقع 3523 نقطة أساس. ( ه ) تركيزات الأسيتون والأيزوبروبانول في طاف الثقافات البرية من النوع C. acetobutylicum (WT) أو ملف ADH - التعبير عن استنساخ مؤتلف بعد 72 ساعة من النمو. تختلف تركيزات كل من منتجات التخمير بشكل كبير بين السلالتين ( ص & لتر 0.01).

سيكون من المفيد تطبيق الاستراتيجية أعلاه على المطثية النيابة. غير ذلك C. acetobutylicum . قمنا ببناء بلازميدات مكافئة لـ pMTL-JH12 و pMTL-JH14 لـ C. sporogenes NCIMB 10696 ، والذي يُظهر إمكانات في علاجات الأورام الجديدة (20) وإجهاد 630 درجة erm من مسببات الأمراض البشرية الهامة جيم صعب (21) (الجدول 1). يمكن اختيار الحيوانات المستنسخة المزدوجة المتقاطعة لكل من هذه الكائنات باستخدام وسائط مكملة بـ FOA ، كما هو موضح في البيانات التكميلية والموضح في الشكل التكميلي S2. التكامل في بيرف موضع C. acetobutylicum ، بما في ذلك إدخال أجزاء من DNA phage lambda بأحجام مختلفة ، موصوفة أيضًا في البيانات التكميلية والموضحة في الشكل التكميلي S1.

اقتران التعبير عن علامات اختيار غير متجانسة بمحفز كروموسومي

باستخدام البلازميد pMTL-JH14 في التكوين الخاص بيري متحولة شيدت باستخدام pMTL-JH12 ، قمنا بدمج جزئين معًا بشكل فعال بيري الجينات لينتج عنها وظيفية كاملة بيري عن طريق إعادة التركيب في منتصف تسلسل الترميز. لقد أدركنا أن حدث إعادة التركيب الذي يجمع بين جينين جزئيين لتكوين جين واحد كامل لا يجب أن يحدث في تسلسل الترميز. في ترتيب بديل ، يمكن ربط تسلسل الترميز الكامل لعلامة انتقائية ، والذي يفتقر إلى المحفز فقط ، عن طريق إعادة التركيب بمحفز موجود على الكروموسوم ، مما يكمل الجين ويؤدي إلى تعبيره. لقد صممنا البلازميد pMTL-JH31 (الشكل 2 أ) لتنفيذ هذا المفهوم المعدل من خلال دمج أ بيري الجين الذي يفتقر إلى المحفز الخاص به في كروموسوم المركب السابق بيري متحولة C. acetobutylicum . كان الإدراج مستهدفًا إلى موقع أسفل مجرى الثيولاز ( thl ) المروج ، المعروف بإظهاره تعبيرًا قويًا طوال فترة النمو (22 ، 23). لمنع إعادة التركيب المتماثل المحتمل في بيري locus ، يستخدم pMTL-JH31 المتعامد بيري الجين من C. sporogenes ATCC 15579 ، والذي يتطابق بنسبة 47.6 ٪ فقط مع C. acetobutylicum الجين. كما كان من قبل ، فإن منطقة التماثل الطويلة (1200 نقطة أساس) توجه تكامل البلازميد دون تغيير بيري يتم الحصول على النمط الظاهري ، والمستنسخات أحادية التقاطع على وسط يحتوي على ثيامفينيكول. بعد ذلك ، استئصال البلازميد بوساطة منطقة ثانية من التنادد يضع الصمت (غير المعبر عنه) بيري الجين المصب مباشرة من thl على الكروموسوم ، مما يؤدي إلى مشاركته في التعبير مع thl ، والسماح باختيار هذه الحيوانات المستنسخة المزدوجة المتقاطعة على متوسط ​​يفتقر إلى اليوراسيل (الشكل 2 أ). لاختبار هذا المخطط ، قمنا بتحويل بيري متحولة C. acetobutylicum باستخدام pMTL-JH31 DNA ، وأجرى إجراء التكامل كما هو موضح أعلاه لـ pMTL-JH14. تم فحص خمسة مستنسخات مستقلة بواسطة PCR (الشكل 2 ب) وحساسية ثيامفينيكول ، وتم التحقق منها جميعًا ، مما يؤكد فائدة هذا النهج المعدل.

يمثل استخدام إعادة التركيب لربط محفز الكروموسومات بعلامة اختيارية داخل كاسيت تبادل أليل استراتيجية مرنة للغاية ، لا تقتصر على استعادة متحولة التغذية إلى التغذية الأولية. قمنا ببناء pMTL-JH16 ، وهو مطابق لـ pMTL-JH31 ، باستثناء موقع ربط الريبوسوم وتسلسل تشفير بيري يتم استبدالها بواسم مقاومة المضادات الحيوية بماكرولايد - لينكوساميد - ستربتوجرين (MLS) ermB (24). كما كان من قبل ، فإن منطقة التماثل الطويلة (1200 نقطة أساس) توجه تكامل البلازميد. بعد ذلك ، حدث إعادة التركيب الذي يتوسط مواقع استئصال البلازميد ermB المصب مباشرة من thl ، يؤدي إلى ermB التعبير والنمط الظاهري المقاوم لـ MLS والذي يمكن استخدامه لتحديد الحيوانات المستنسخة مزدوجة التقاطع (الشكل 2 ج). اختبرنا pMTL-JH16 في النوع البري C. acetobutylicum باستخدام إجراء تكامل مشابه كما كان من قبل ، زراعة المحولات مبدئيًا على ثيامفينيكول ، وتمكنت بسهولة من اختيار الحيوانات المستنسخة مزدوجة التقاطع باستخدام المضاد الحيوي إريثروميسين الماكروليد. تم فحص ستة استنساخ مأشوب بنفس الطريقة كما كان من قبل ، وتم تأكيد جميعها على أنها المؤتلفات المرغوبة (البيانات غير معروضة).

التكامل والتعبير عن نازعة هيدروجين الكحول

في الإستراتيجية السابقة ، كان التعبير عن جينات الواسمات غير المتجانسة مقترنًا بتكوين كروموسوم مزدوج متقاطع متشابك ، مما يوفر وسيلة لاختيار هذه الحيوانات المستنسخة. بعد ذلك سعينا إلى توسيع هذا المبدأ ليشمل التعبير عن الجينات غير المتجانسة الأخرى ذات الأهمية ، لأغراض أخرى. إلى جانب البوتانول ، فإن المنتجات الرئيسية الأخرى لتخمير السكر C. acetobutylicum هي الأسيتون والإيثانول ، وغالبًا ما تسمى العملية بتخمير الأسيتون - البوتانول - الإيثانول (ABE) (25). يعتبر البوتانول المنتج الأكثر قيمة ، ولكن الإيثانول له قيمة أيضًا كسلعة كيميائية وكوقود حيوي. يعتبر الأسيتون أقل قيمة وغير مناسب كوقود ، لذلك فهو يمثل منتجًا ثانويًا غير مرغوب فيه أو منتج نفايات لعملية ABE الصناعية. كلوستريديوم بيجرينكي NRRL B593 له نفس الفيزيولوجيا C. acetobutylicum , but reduces the acetone it produces to isopropanol (propan-2-ol) using an NADPH-dependent primary/secondary alcohol dehydrogenase ( 26 ). Isopropanol is more valuable than acetone, and could be used as biofuel in a blend with butanol and ethanol, so it would be useful to add the adh gene which encodes this activity to C. acetobutylicum .

We inserted the coding sequence of adh into pMTL-JH16 along with a ribosome-binding site, but did not provide a promoter ( Figure 2 C). Double-crossover recombinants will therefore contain an artificial thl - ermB - adh operon, with all three genes dependent upon the thl promoter for expression. The integration procedure was performed as before, and double-crossover clones were selected using erythromycin. We picked only one clone of the many obtained to screen for integration of adh , because the experiments described in the previous sections suggested that screening multiple clones was unnecessary. ال adh -containing clone was verified as before by PCR ( Figure 2 D) and thiamphenicol sensitivity. We compared the fermentation products of the adh -containing clone to the wild-type using anaerobic batch cultivation conditions under which C. acetobutylicum exhibits classic bi-phasic growth, switching from organic acid production to acid re-uptake and solvent production as it enters stationary phase. After 72 h growth, supernatants of wild-type cultures contained typical concentrations of fermentation products, including 91.9 ± 8.4 mM butanol, 52.9 ± 4.7 mM acetone and 12.6 ± 1.5 mM ethanol. At the same timepoint, supernatants from cultures of the adh clone contained 15.4 ± 3.1 mM acetone and 27.9 ± 6.7 mM isopropanol ( Figure 2 E). None of the other fermentation product concentrations differed significantly from the wild-type. This result demonstrates expression of functional adh , and the recombinant strain represents an improvement over the wild-type from an industrial perspective.

Multistep integration of the phage lambda genome

Up to 1.8 kb of heterologous DNA was integrated in the experiments described above, and larger fragments of up to 6.5 kb were integrated in additional experiments described in the Supplementary Data . However, there must be limits to the size of DNA that can be delivered in a single step. ل C. acetobutylicum , this limitation may well be imposed by the frequency of transformation, which is low even for small plasmids ( 7 ). Sequences too large to be integrated in a single step could be delivered in a series of steps using overlapping subfragments of the desired sequence, as in the domino method for العصوية الرقيقة ( 3 ). This might be achieved either by alternately switching on and off a positively and negatively selectable gene such as pyrE ( Figure 1 ) or by alternately linking expression of two different heterologous selectable markers to a chromosomal promoter ( Figure 2 ). In either scheme, the short region of homology would remain the same in every step, whereas the long region of homology would target the end of the previous insert in the second and subsequent steps.

To test multistep DNA delivery using ACE, we attempted to insert the entire genome of phage lambda into the chromosome of C. acetobutylicum . We identified three restriction fragments of circular phage lambda DNA (circularized by ligation of the cohesive ends of the linear chromosome) that covered the entire genome and provided regions of overlap suitable to direct the initial recombination events in the second and third ACE steps ( Figure 3 ). We used restriction ligation cloning to insert the 28 kb fragment (L28), 18 kb fragment (L18) and 6.5 kb fragment (L6.5) into ACE vectors pMTL-JH16, pMTL-JH30 and pMTL-JH15, respectively. Vectors pMTL-JH30 and pMTL-JH15 are similar to pMTL-JH31 and pMTL-JH16, but do not include a long region of homology, so these vectors are appropriate when the long region of homology depends upon a previous step, and must therefore be provided with the insert or as part of the insert ( Table 1 ). When we inserted L18 into pMTL-JH30, we obtained clones with deletions in the lambda sequence. It appears that cloning this region (which includes lysis genes) into pMTL-JH30 is toxic to بكتريا قولونية , so clones with spontaneous deletions are selected. In one of these constructs, 6 kb of DNA is deleted, but the regions required for recombination between fragments are not affected. We used this 12 kb of lambda DNA (L12) instead of L18, and proceeded to the multistep integration.

Multistep insertion of the chromosome of phage lambda into the chromosome of C. acetobutylicum . ( أ ) Chromosome of phage lambda showing restriction sites used to excise the three overlapping fragments. Yellow, 28 kb XmaI-XmaI fragment L28 blue, 18 kb NheI-AscI fragment L18 green, 6.5 kb XmaI-XhoI fragment L6.5 white, regions of overlap between fragments cross-shaded deletion, 6 kb region of L18 absent from L12 coh , ligated cohesive ends. ( ب ) Integration plasmids pMTL-JH16::L28, pMTL-JH30::L12 and pMTL-JH15::L6.5. The lambda sequences are colored as in (A). Gray arrows ه و ص , inactive (non-expressed) ermB و pyrE , respectively black, homology to thl locus E, EcoRI sites dashed lines, EcoRI fragments (except those spanning the plasmid backbone) numeric labels, EcoRI fragment lengths in kilo base pair. (ج) ال thl locus of C. acetobutylicum before and after 1, 2 and 3 insertions of lambda DNA. Elements are labeled as in (B). The first recombination event at each step, indicated, is directed by a long region of homology. A short region of homology mediates plasmid excision and simultaneously activates ermB أو pyrE in alternate steps, shown by red arrows ه و ص , respectively, by positioning them under the control of the chromosomal thl المروجين. ( د ) Southern blot of EcoRI digests of the plasmids and chromosomes shown in (B) and (C), using lambda DNA as probe. MW, HindIII-digested lambda DNA molecular weight marker.

Multistep insertion of the chromosome of phage lambda into the chromosome of C. acetobutylicum . ( أ ) Chromosome of phage lambda showing restriction sites used to excise the three overlapping fragments. Yellow, 28 kb XmaI-XmaI fragment L28 blue, 18 kb NheI-AscI fragment L18 green, 6.5 kb XmaI-XhoI fragment L6.5 white, regions of overlap between fragments cross-shaded deletion, 6 kb region of L18 absent from L12 coh , ligated cohesive ends. ( ب ) Integration plasmids pMTL-JH16::L28, pMTL-JH30::L12 and pMTL-JH15::L6.5. The lambda sequences are colored as in (A). Gray arrows ه و ص , inactive (non-expressed) ermB و pyrE , respectively black, homology to thl locus E, EcoRI sites dashed lines, EcoRI fragments (except those spanning the plasmid backbone) numeric labels, EcoRI fragment lengths in kilo base pair. (ج) ال thl locus of C. acetobutylicum before and after 1, 2 and 3 insertions of lambda DNA. Elements are labeled as in (B). The first recombination event at each step, indicated, is directed by a long region of homology. A short region of homology mediates plasmid excision and simultaneously activates ermB أو pyrE in alternate steps, shown by red arrows ه و ص , respectively, by positioning them under the control of the chromosomal thl المروجين. ( د ) Southern blot of EcoRI digests of the plasmids and chromosomes shown in (B) and (C), using lambda DNA as probe. MW, HindIII-digested lambda DNA molecular weight marker.

We integrated each of the three lambda DNA fragments in turn into the chromosome of the pyrE mutant of C. acetobutylicum ( Figure 3 ). Double-crossover clones were selected using erythromycin ( ermB +) for the L28 insertion, then medium lacking uracil ( pyrE +) for the L12 insertion, then erythromycin again for the L6.5 insertion. At each step, the insertion was initially verified by thiamphenicol sensitivity and PCR. After all three insertions were completed, a Southern blot of EcoRI-digested genomic DNA from the three recombinant strains (containing one, two or three lambda DNA insertions) was performed, using lambda DNA as the probe ( Figure 3 D). EcoRI-digested genomic DNA from the parental pyrE mutant strain was also included, as was EcoRI-digested plasmid DNA of the three integration plasmids. All samples showed the expected distinguishing pattern of fragments (none in the case of the pyrE strain control) confirming the successful multistep insertion. The insertions were also verified by sequencing.


Linking plasmid-based beta-lactamases to their bacterial hosts using single-cell fusion PCR

The horizonal transfer of plasmid-encoded genes allows bacteria to adapt to constantly shifting environmental pressures, bestowing functional advantages to their bacterial hosts such as antibiotic resistance, metal resistance, virulence factors, and polysaccharide utilization. However, common molecular methods such as short- and long-read sequencing of microbiomes cannot associate extrachromosomal plasmids with the genome of the host bacterium. Alternative methods to link plasmids to host bacteria are either laborious, expensive or prone to contamination. Here we present the One-step Isolation and Lysis PCR (OIL-PCR) method, which molecularly links target ARGs with the bacterial 16S rRNA gene via fusion PCR performed within an emulsion. After validating this method, we apply it to identify the bacterial hosts of three clinically relevant beta-lactamases in a neutropenic patient population who are particularly vulnerable multidrug-resistant infections. We detect novel associations of two low-abundance genera, Romboutsia و Agathobacter, with a multi-drug resistant plasmid harbored by Klebsiella pneumoniae. We put forth a robust, accessible, and high-throughput platform for sensitively surveying the bacterial hosts of mobile genes in complex microbial communities.


Plasmid Vectors for في فيفو Selection-Free Use with the Probiotic بكتريا قولونية نيسل 1917

الإشريكية القولونية Nissle 1917 (EcN) is a probiotic bacterium, commonly employed to treat certain gastrointestinal disorders. It is fast emerging as an important target for the development of therapeutic engineered bacteria, benefiting from the wealth of knowledge of بكتريا قولونية biology and ease of manipulation. Bacterial synthetic biology projects commonly utilize engineered plasmid vectors, which are simple to engineer and can reliably achieve high levels of protein expression. However, plasmids typically require antibiotics for maintenance, and the administration of an antibiotic is often incompatible with في الجسم الحي experimentation or treatment. EcN natively contains plasmids pMUT1 and pMUT2, which have no known function but are stable within the bacteria. Here, we describe the development of the pMUT plasmids into a robust platform for engineering EcN for في الجسم الحي experimentation, alongside a CRISPR-Cas9 system to remove the native plasmids. We systematically engineered both pMUT plasmids to contain selection markers, fluorescent markers, temperature sensitive expression, and curli secretion systems to export a customizable functional material into the extracellular space. We then demonstrate that the engineered plasmids were maintained in bacteria as the engineered bacteria pass through the mouse GI tract without selection, and that the secretion system remains functional, exporting functionalized curli proteins into the gut. Our plasmid system presents a platform for the rapid development of therapeutic EcN bacteria.

الكلمات الدالة: microbiome probiotic engineering synthetic biology.

بيان تضارب المصالح

The authors declare the following competing financial interest(s): Authors have filed a provisional patent application based on the work presented in this paper.


The discovery of toxin-antitoxin systems

Toxin-antitoxin systems were first discovered in 1983 when Teru Ogura and Sota Hiraga found that if a mini-F plasmid carried a specific 700 bp segment of DNA, the plasmid was propagated better than plasmids without this DNA.

They eventually designated this fragment as the ccdB region (for “ ج oupled ج إل د ivision”). The encoded toxin-antitoxin system consists of CcdB (toxin) and CcdA (antitoxin) where CcdB inferes with DNA replication by binding the GyrA subunit of DNA gyrase and trapping it in the cleaved complex. This results in DNA breakage and cell death. Conversely, CcdA binds to and blocks the activity of CcdB.


Can bacteria grow without a plasmid or am i stupid? - or did ampicillin wear out? (Jun/20/2007 )

I am trying to clone PCR products in to TOPO vector. I am using Invitrogen TOPO-TA cloning kit. its the PCR4-TOPO. The problem is, i ligated the pcr product in to topo vector, transformed (here i used a control plasmid too i.e. puc19) and grow the bacteria. I saw colonies the next day in the pcu19 control (where the number of colonies are more) and the pcr ligated topo plates. The plates have 100ug/ml ampicilin. Then i grow the culture in liquid LB ON at 37 deg in 5 ml and tried to do miniprep (i am using quick plasmid kit from invitrogen) to extract plasmid and ran the gel, i am seeing bands only in the puc19 controls and not in the pcr ligated sample lane. I am also seeing a very faint band in both puc19 control and sample at 12kb. could it be genomic DNA? How could bacteria grow with out plasmid? or am i missing something here? Please help me

Ampicilin degrade with time. Ampicilin also degrades faster when exposed to high temperature. Was the Amp stocks defrosted using high temperature, or perhaps were the plates old?

I wouldn't use plates more then 2 weeks old.

quite true, As ampicillin degrades, this promotes growth of the all bacteria which don't have the resistance gene.

You could check your plates by streaking out untransformed competent E. coli, which should give you no colonies if your plates (and competent cells too) are OK.


شاهد الفيديو: الإقتران في البكتيريا (سبتمبر 2022).


تعليقات:

  1. Maular

    لقد حصلنا على الكثير من ATP.

  2. Fidel

    كل إجازة شخصية اليوم؟

  3. Sefu

    ماذا سنفعل بدون عبارة رائعة

  4. Akigar

    انظر إلى منزلي!



اكتب رسالة