معلومة

كيف يمكن إعداد تبريد بطيء في جهاز التدوير الحراري AB Veriti؟

كيف يمكن إعداد تبريد بطيء في جهاز التدوير الحراري AB Veriti؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أريد احتضان العينة عند 50 درجة مئوية ثم تبريدها ببطء إلى 4 درجات مئوية بمعدل 0.1 درجة مئوية / ثانية. أنا أستخدم جهاز التدوير الحراري AB Veriti. لا أحد يعرف كيفية إعداد معدل التبريد؟ يجب أن تفعل شيئًا مع معدل الارتفاع ، والذي يتم تقديمه في المائة ولكني لا أعرف كيفية تحويل هذا إلى معدل حقيقي.


إذا كنت أتذكر بشكل صحيح (منذ أن تدربت في ABI) ، فلا يمكنك تعيين هذا مباشرة في واجهة Veriti. ومع ذلك ، (مرة أخرى ، لست متأكدًا بنسبة 100٪ - لم أجد أي شيء لتأكيد ذلك بعد 30 دقيقة من البحث على Google) ، تشير النسبة المئوية لمعدل المنحدر إلى النسبة المئوية للحد الأقصى لمعدل المنحدر لكتلة التسخين.

وفقًا لموقع المنتج على الويب ، يبلغ الحد الأقصى لمعدل منحدر كتلة التسخين 5 درجات مئوية / ثانية بينما يكون الحد الأقصى عينة معدل المنحدر هو 4.25 درجة مئوية / ثانية ، لذلك تحتاج إلى معدل منحدر بين 2٪ و 2.4٪.


كما أشار توماس ، هناك حد أقصى لمعدل المنحدر يمكنك إعداده على جهاز التدوير الحراري. يمكن أن تتراوح قيمته من 0٪ إلى 100٪. يمكنني بعد ذلك أن أفترض أن معدل المنحدر بنسبة 100٪ سيتوافق مع الحد الأقصى لمعدل المنحدر البالغ 4.25 درجة مئوية / ثانية لكتلة التسخين أو 5 درجات مئوية / ثانية للعينة. مما يعني أن معدل المنحدر ~ 2.4٪. بعد ذلك ، قمت بإعداد رد الفعل الخاص بي بمعدل 2٪ منحدر ، حيث بدأت عداد الوقت في الوقت الذي بدأت فيه دورة المنحدر. لدهشتي ، كانت درجة الحرارة تنخفض ببطء شديد. وهكذا ، اكتشفت تجريبياً أن معدل المنحدر البالغ 5٪ يتوافق مع سرعة تبريد ~ 0.1 درجة مئوية / ثانية.

تمنيت لو كانت هناك طريقة أكثر دقة لحسابها. ربما تغير منحدر الخط عند فترات مختلفة من درجات الحرارة. سيكون من الرائع أن أتحدث إلى أفراد AB حتى يتمكنوا من تبرير اكتشافاتي.


جهاز تدوير حراري فيريتي 96 بشكل جيد

جهاز تدوير حراري فيريتي 96 بشكل جيد الكلمات الرئيسية بعد تحليل النظام يسرد قائمة الكلمات الرئيسية ذات الصلة وقائمة المواقع ذات المحتوى ذي الصلة ، بالإضافة إلى أنه يمكنك معرفة الكلمات الرئيسية الأكثر اهتمامًا بالعملاء على هذا الموقع


1 المقدمة

Synchytrium endobioticum يسبب مرض ثؤلول البطاطس (لانغرفيلد ، 1984). في نهاية القرن التاسع عشر ، انتشر المرض من نطاقه الأصلي في منطقة الأنديز بأمريكا الجنوبية إلى أجزاء من أمريكا الشمالية وأوروبا. في النهاية ، تم العثور على الفطر في بلدان زراعة البطاطس في جميع أنحاء العالم ، بما في ذلك آسيا وأفريقيا وأوقيانوسيا. إنه مرض شديد التدمير في ظل ظروف مواتية لتطور الدرنات المصابة بالمرض يمكن بعد ذلك تحويلها إلى ثآليل إلى حد كبير. على الرغم من إمكانية إصابة عدد من المحاصيل الباذنجانية تجريبياً ، إلا أن البطاطس هي المضيف الرئيسي. الظروف المواتية لتطور الفطريات هي فصول الصيف الباردة ، بمتوسط ​​درجة حرارة 18 درجة مئوية أو أقل ، وهطول الأمطار السنوي لا يقل عن 700 ملم. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن فاشيات جديدة من مناطق في جنوب شرق أوروبا حيث تكون درجات الحرارة في الصيف أعلى. القدرة على الانتشار الطبيعي S. إندوبيوتيكوم محدودة. يمكن أن ينتشر الفطر بمساعدة الإنسان على درنات البطاطس المصابة ، في التربة ، على هذا النحو أو الملتصق بالنباتات ، أو مع نفايات البطاطس. بسبب القدرة المحدودة على الانتشار الطبيعي ، تمت السيطرة على المرض بشكل فعال من خلال الإجراءات القانونية في العديد من البلدان. سمحت المراقبة الصارمة للصحة النباتية والزراعة الإجبارية للأصناف المقاومة باستئصال العامل الممرض في بعض البلدان. الاستئصال بطيء للغاية لأن الفطر يعيش في التربة لعقود. وبسبب هذا ، والطبيعة المدمرة للمرض ، تعتبر الفطريات من الآفات الحجرية الهامة في جميع أنحاء العالم.

Synchytrium endobioticum هو طفيلي ملزم لا ينتج خيوطًا بل سبورانجيا ، والتي تحتوي على أبواغ حيوانية متحركة. sporangia الصيفية رقيقة الجدران وقصيرة العمر. تتشكل في أنسجة البطاطس وتؤدي إلى عدوى جديدة في zoospore. تكون جراثيم الراحة (يشار إليها أحيانًا باسم sporangia الشتوية ، أو جراثيم الشتاء ، أو قشور الشتاء) سميكة الجدران وتبقى قابلة للحياة لفترات طويلة جدًا من الوقت حتى في حالة عدم وجود مضيف. يمكن إنتاجها طوال موسم النمو. يتم إطلاقها من الثآليل المتحللة في التربة. تشخيص S. إندوبيوتيكوم يتعلق بكل من النبات الذي تكونت عليه الثآليل والتربة التي قد تحمل جراثيم الراحة. معيار EPPO PM 3/59 الإجراء الخاص بإزالة القسائم المصابة سابقاً بالجدول الزمني تمت الموافقة عليه مبدئيًا في عام 2003 (تم نشر النسخة المنقحة في هذا العدد من نشرة EPPO). الاختبارات التي يجب تنفيذها في إطار هذا الإجراء موصوفة في هذا البروتوكول.

تم وصف العديد من الأنماط المرضية (الأجناس) في S. إندوبيوتيكوم (باعين وآخرون، 2006). يتم تعريف هذه من خلال ضراوتها على أصناف البطاطس التفاضلية. نادرًا ما يتم الإبلاغ عن إصابة النمط 1 (D1) بالبطاطا في أوروبا نظرًا لأن عددًا قليلاً من أصناف البطاطس المعرضة للإصابة به ، ويرجع ذلك على ما يبدو إلى توفر المقاومة السائدة في العائل. تم الإبلاغ الآن عن حدوث أنماط مرضية أخرى بشكل متكرر في أوروبا الغربية ، وتوجد بشكل خاص في المناطق الجبلية الممطرة في وسط وشرق أوروبا. تحدث أيضًا خارج أوروبا (على سبيل المثال في نيوفاوندلاند وكندا والجزء الآسيوي من تركيا). مقاومة هذه الأنماط المرضية نادرة ، لذا فإن السيطرة عليها أكثر صعوبة. تتميز الأنماط المرضية بخلاف 1 (D1) من خلال الفوعة التفاضلية لأصناف معينة من البطاطس (Stachewicz، 1980 Langerfeld & Stachewicz، 1993 Langerfeld وآخرون. ، 1994 Stachewicz وآخرون. ، 2000) ، ولكن يبدو أن هناك ارتباطًا وثيقًا ببعضها البعض أكثر من ارتباطها بالنوع 1 (D1). تتطلب التدابير الداخلية الموصى بها في بلدان EPPO تحديد الأنماط المرضية. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول يغطي أيضًا تحديد النمط المرضي.

مخططات التدفق التي تصف إجراءات التشخيص لاكتشاف وتحديد S. إندوبيوتيكوم في عينات التربة والمواد النباتية التي تظهر الثآليل في الشكل 1 أ و ب ، على التوالي.


مراجع

جرينمان ، سي وآخرون. أنماط طفرة جسدية في جينوم السرطان الإنسان. طبيعة سجية 446, 153 (2007).

Mikkers ، H. & amp Berns ، A. طفرات إدخال الفيروسات القهقرية: تحديد مسارات السرطان. حال. الدقة السرطان. 88, 53 (2003).

دوبوي ، أ. وآخرون. الطفرات في الثدييات باستخدام نظام ترانسبوزون للجمال النائم الجسدي عالي الحركة. طبيعة سجية 436, 221 (2005).

كنج ، ف. وآخرون. الفحص الجيني الأمامي للجينات المرتبطة بسرطان الخلايا الكبدية. وقائع الاجتماع السنوي التاسع والتسعين للجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان (سان دييغو ، 2008).

وو ، إكس وآخرون. يحدد الورم الأرومي النخاعي النقيلي في الفئران الناجم عن نقل الجمال النائم الجينات والمسارات المهمة لبدء الورم الأرومي النخاعي وتطوره. وقائع الاجتماع السنوي التاسع والتسعين للجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان (سان دييغو ، 2008).

بندر ، أ. وآخرون. الجمال النائم بوساطة التكوّن الدبقي. وقائع الاجتماع السنوي التاسع والتسعين للجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان (سان دييغو ، 2008).

كوليير ، إل. وآخرون. اكتشاف الجينات السرطانية في الأورام الصلبة باستخدام الطفرات الجسدية القائمة على الترانسبوزون في الفأر. طبيعة سجية 436, 272 (2005).

كويرس ، إتش تي. وآخرون. التكوّن اللمفاوي للخلايا التائية الناجم عن فيروس سرطان الدم مورين: تكامل الفيروسات الأولية في منطقة كروموسومية مميزة. زنزانة 37, 141 (1984).

Ochman ، H. ، Gerber ، A.S. & amp ؛ هارتل ، د. التطبيقات الجينية لتفاعل البلمرة المتسلسل العكسي. علم الوراثة 120, 621 (1988).

ماكلير ، ماجستير ، كوفي ، A.J. & amp Dunham ، I. إنقاذ الحمض النووي بطريقة vectorette. طرق مول. بيول. 226, 393 (2003).

ديفون ، آر إس ، بورتيوس ، دي جي. & amp Brookes، A.J. ناقلات النواقل المحسنة من Splinkerettes لزيادة الكفاءة في المشي PCR. الدقة الأحماض النووية. 23, 1644 (1995).

Hui ، E.K. ، Wang ، P.C. & amp Lo ، S.J. استراتيجيات لاستنساخ متواليات DNA الخلوية المرافقة غير المعروفة من مجموعات أجنبية. خلية مول. علوم الحياة. 54, 1403 (1998).

هينجن ، ب. تضخيم Vectorette ، splinkerette و boomerang DNA. اتجاهات Biochem. علوم. 20, 372 (1995).

أورين ، إيه جي وآخرون. الطفرات واسعة النطاق في p19 (ARF) - والفئران التي تعاني من نقص p53 تحدد جينات السرطان وشبكاتها التعاونية. زنزانة 133, 727 (2008).

مارغوليس ، إم وآخرون. تسلسل الجينوم في مفاعلات بيكوليتر دقيقة التصنيع عالية الكثافة. طبيعة سجية 437, 376 (2005).

وانج ، ج. وآخرون. اختيار موقع تكامل فيروس نقص المناعة البشرية: يكشف التحليل عن طريق التسلسل الحراري المتوازي بشكل كبير عن الارتباط بالتعديلات اللاجينية. الدقة الجينوم. 17, 1186 (2007).

ميكيرز وآخرون. علامات الفيروسات القهقرية عالية الإنتاجية لتحديد مكونات مسارات إشارات محددة في السرطان. نات. جينيه. 32, 153 (2002).

مارا ، ماجستير ، كوكابا ، T.A. ، هيلير ، L.W. & amp Waterston ، R.H. تنقية DNA البلازميد عالية الإنتاجية مقابل 3 سنتات لكل عينة. الدقة الأحماض النووية. 27، e37 (1999).

Mullikin، J.C. & amp McMurragy، A.A. Techview: تسلسل الحمض النووي. تسلسل الجينوم بسرعة. علم 283, 1867 (1999).

باراميسواران ، بي وآخرون. يكشف تصميم الباركود النوكليوتيد المصمم خصيصًا للتسلسل الحراري عن فرص لتعدد إرسال العينات على نطاق واسع. الدقة الأحماض النووية. 35، e130 (2007).

جيوردانو ، FA وآخرون. استراتيجيات المعلومات الحيوية الجديدة لتوصيف مواقع التكامل الفيروسي السريع لناقلات العلاج الجيني. طرق Inf. ميد. 46, 542 (2007).

Kong ، J. ، Zhu ، F. ، Stalker ، J. & amp Adams ، D.J. iMapper: تطبيق ويب للتحليل الآلي ورسم خرائط لبيانات تسلسل الطفرات الإدراجية ضد جينومات Ensembl. المعلوماتية الحيوية 24, 2923 (2008).

Kustikova ، O.S ، Modlich ، U. & amp Fehse ، B. تحليل موقع إدخال الفيروسات القهقرية في الحيوانات المستنسخة المكونة للدم السائدة. طرق مول. بيول. 506, 373 (2009).

Ambrosi، A.، Cattoglio، C. & amp Di Serio، C. عملية تكامل الفيروسات القهقرية في الجينوم البشري: هل هي حقًا غير عشوائية؟ نهج إحصائي جديد. PLoS Comput. بيول. 4، e1000144 (2008).


Zhen Liang and Kunling Chen: ساهم هذان المؤلفان بالتساوي في هذا العمل.

الانتماءات

مختبر الدولة الرئيسي لخلايا النبات وهندسة الكروموسومات ، ومركز تحرير الجينوم ، معهد علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، بكين ، الصين

Zhen Liang و Kunling Chen و Yi Zhang و Jinxing Liu و amp Caixia Gao

جامعة الأكاديمية الصينية للعلوم ، بكين ، الصين

المختبر الرئيسي لبحوث إجهاد النبات ، كلية علوم الحياة ، جامعة شاندونغ نورمال ، جينان ، الصين

مختبر الدولة الرئيسي لعلم الجينوم النباتي ، معهد علم الأحياء الدقيقة ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، بكين ، الصين

Kangquan Yin & amp Jin-Long Qiu

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

Z.L.، K.C. و C.G. صممت التجارب الخاصة بالبروتوكول Z.L. و Y.Z. أجرى التجارب بمساعدة من K.C.، J.L.، K.Y. و J.-L.Q. و Z.L.، K.C. و C.G. كتب المخطوطة.

المؤلف المراسل


دراسات استعمار النبات عن طريق الارتباط الوثيق عصية أميلوليكوفاسينس عوامل المكافحة الحيوية باستخدام مقايسات PCR الكمية المحددة لسلالة

سلالات معينة من عصية أميلوليكوفاسينس يمكن أن يستعمر النباتات وتحسين النمو وإدارة الإجهاد. من أجل دراسة هذه التأثيرات ، فإن ديناميكيات النمو البكتيري على النباتات وفي منطقة الجذور ذات أهمية تتطلب أدوات تحليلية محددة. لهذا الغرض ، تم تطوير مقايسات PCR (qPCR) الكمية في الوقت الحقيقي للتمييز بين ثلاثة B. amyloliquefaciens subsp. أخمصي السلالات (UCMB5033، UCMB5036، UCMB5113) ولتحديد مستوياتها بدقة عالية. تم تصميم بادئات قليل النوكليوتيد لسلالة تسلسل الجينات الفريدة واستخدامها لتحليل SYBR الأخضر qPCR. غطت المنحنيات القياسية نطاقًا خطيًا عريضًا (10 6) من كميات الحمض النووي مع أدنى مستوى للكشف عند 50 fg. أظهر تحليل منحنى الذوبان بعد التفاعل منتجًا واحدًا فقط. تم الحصول على دورات عتبة دقيقة ، حتى في حالة وجود فائض كبير من الدورات ذات الصلة عصية سلالات والحمض النووي البكتيري الكلي من التربة. تحليل عصية أظهر الاستعمار بعد معالجة البذور لصنفين من بذور اللفت الزيتية (Oase و Ritz) المزروعان على دعم أجار تأثيرًا يعتمد على الوقت ولكن البكتيريا موجودة في الغالب على أنسجة الجذر وقليلًا على الأنسجة الخضراء. تنوع الاستعمار على النباتات المزروعة في التربة بين عصية سلالات حيث يبدو أن Oase تأوي بكتيريا أكثر من Ritz. يتم تطبيقه كمزيج ، كل ثلاثة عصية سلالات تتعايش على جذور النباتات المزروعة في التربة. سيكون اختبار qPCR بالاشتراك مع التقنيات الأخرى أداة قوية لدراسة التفاعلات النباتية لهذه B. amyloliquefaciens عوامل المكافحة الحيوية لزيادة فهم متطلبات التفاعلات الناجحة وتحسين خصائص النبات.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


الاستنتاجات

قبل دراستنا ، لم يكن معروفًا سوى القليل جدًا عن الشبكة التنظيمية المكونة من مكونين في البكتيريا التي تقلل الكبريتات. نقدم هنا خريطة شاملة إلى حد ما للجينات التي يتم تنظيمها نسبيًا بواسطة غالبية النظامين المكونين في هذا الكائن الحي الذي يخفض الكبريتات (الشكل 7). تتضمن نتائجنا 200 جين مستهدف لـ 24 منظم استجابة وتقدم تنبؤات قوية لأنظمة المكونين المقابلة التي تشمل تنظيم حركية الخلية (الأسواط والشعيرة) ، وإنتاج السكريات الخارجية ، واستقلاب الطاقة (استخدام اللاكتات ، وتنظيم الكحول ، ومستويات الأسيتيل CoA ) ، تخليق الدهون ، أيض النيتروجين والفوسفات ، وفي الاستجابات للضغوط مثل انخفاض البوتاسيوم والنتريت والجوع الكربوني. يتم تنظيم وظائف مثل استخدام اللاكتات وجينات امتصاص البوتاسيوم بواسطة RRs متعددة وتبدو مركزية في استجابة الإجهاد في D. فولغاريس. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضًا استخدام أشكال الربط المؤكدة تجريبياً للعديد من RRs لتقييم أهداف الجينات ووظيفة أخصائي تقويم العظام لهذه المنظمات في البكتيريا ذات الصلة. باستثناء عدد قليل من RRs (على سبيل المثال ، DVU1083 (PhoB) و DVU2934) ، فإن معظم RRs المحتوية على DBD المشفرة في D. فولغاريس يبدو أن Hildenborough فريد من نوعه في التسلسل ديسولفوفيبريو الأنواع ومخفضات الكبريتات وثيقة الصلة. يشير هذا إلى أن الاستجابات المعدلة من قبل معظم النظامين المكونين في بكتيريا تقليل الكبريتات هذه فريدة من نوعها بالنسبة للمنافذ البيئية التي تشغلها. بالإضافة إلى ذلك ، تشير الأعداد الكبيرة من البروتينات والجينات الافتراضية ذات الوظائف غير المعروفة بين المرشحين الخاضعين للتنظيم إلى أنه لا يزال هناك الكثير لنتعلمه عن الضغوط البيئية التي تواجهها هذه النظم البيئية. هناك حاجة إلى معرفة أعمق باستجابة الإجهاد والتنظيم في هذه البيئات من أجل مناهج معالجة حيوية قوية وفهم أفضل للعمليات البيوجيوكيميائية التي تتوسط فيها هذه البكتيريا.


طريقة الرقاقة المنقاة بتقارب الحمض النووي (رقاقة DAP) لتحديد أهداف الجينات للأنظمة التنظيمية البكتيرية المكونة من مكونين

تصف مقالة الفيديو هذه ملف في المختبر طريقة تعتمد على ميكروأري لتحديد أهداف الجينات ومواقع الربط لمنظمي استجابة النظام المكونين.

الملخص

في الجسم الحي طرق مثل رقاقة ChIP هي تقنيات راسخة تستخدم لتحديد أهداف الجينات العالمية لعوامل النسخ. ومع ذلك ، فهي ذات استخدام محدود في استكشاف الأنظمة التنظيمية البكتيرية المكونة من مكونين مع ظروف تنشيط غير معيّنة. تنظم هذه الأنظمة النسخ فقط عند تنشيطها في وجود إشارات فريدة. نظرًا لأن هذه الإشارات غالبًا ما تكون غير معروفة ، فإن في المختبر يمكن استخدام الطريقة القائمة على ميكروأري الموضحة في مقالة الفيديو هذه لتحديد أهداف الجينات ومواقع الربط لمنظمي الاستجابة. يمكن استخدام طريقة الرقاقة المنقاة ذات الصلة بالحمض النووي لأي منظم منقى في أي كائن حي به جينوم متسلسل. يتضمن البروتوكول السماح للبروتين الموسوم المنقى بالارتباط بالحمض النووي الجيني المنفصمة ثم التقارب لتنقية الحمض النووي المرتبط بالبروتين ، متبوعًا بوضع العلامات الفلورية للحمض النووي والتهجين إلى مجموعة تبليط مخصصة. يتم أيضًا وصف الخطوات السابقة التي يمكن استخدامها لتحسين الفحص لمنظمات محددة. تُستخدم القمم التي تم إنشاؤها بواسطة تحليل بيانات الصفيف للتنبؤ بزخارف موقع الربط ، والتي يتم التحقق من صحتها تجريبياً. يمكن استخدام تنبؤات الحافز بشكل أكبر لتحديد أهداف الجينات لمنظمي الاستجابة التقويمية في الأنواع وثيقة الصلة. نبرهن على قابلية تطبيق هذه الطريقة من خلال تحديد أهداف الجينات وزخارف موقع الربط وبالتالي التنبؤ بوظيفة منظم الاستجابة المعتمد على sigma54 DVU3023 في البكتيريا البيئية Desulfovibrio vulgaris هيلدنبره.

مقدمة

تعتمد قدرة البكتيريا على البقاء والنمو بشكل حاسم على مدى قدرتها على إدراك الاضطرابات في بيئاتها والاستجابة لها ، وهذا بدوره يعتمد على أنظمة نقل الإشارات الخاصة بها. يُطلق على عدد أنظمة الإشارات التي تشفرها البكتيريا اسم & # 8220microbial IQ & # 8221 ويمكن أن يكون مؤشرًا على كل من تقلب بيئتها وقدرتها على استشعار إشارات متعددة وضبط استجابتها 1. يعد نظاما تحويل الإشارة المكونين (TCS) أكثر أنظمة الإشارات شيوعًا التي تستخدمها البكتيريا ، ويتكونان من هيستيدين كيناز (HK) الذي يستشعر الإشارة الخارجية وينقل عبر الفسفرة إلى منظم استجابة المستجيب (RR) 2. يمكن أن تحتوي RRs على مجموعة متنوعة من مجالات الإخراج وبالتالي أوضاع المستجيب المختلفة ، ولكن الاستجابة الأكثر شيوعًا هي تنظيم النسخ عبر مجال ربط الحمض النووي 1. تظل الإشارات المحسوسة والوظائف المقابلة للغالبية العظمى من TCSs غير معروفة.

بالرغم ان في الجسم الحي يتم استخدام طرق مثل رقاقة ChIP بشكل روتيني لتحديد مواقع الارتباط الجيني لعوامل النسخ 3 ، ولا يمكن استخدامها إلا في RRs للنظام البكتيرية المكونة من مكونين إذا كانت ظروف التنشيط أو الإشارات معروفة. غالبًا ما يكون تحديد الإشارات البيئية التي تنشط TCS أصعب من تحديد أهدافها الجينية. ال في المختبر يمكن استخدام الفحص المستند إلى المصفوفة الدقيقة الموصوفة هنا لتحديد أهداف الجينات بشكل فعال وسريع والتنبؤ بوظائف TCSs. يستفيد هذا الاختبار من حقيقة أن RRs يمكن فسفرته وبالتالي تنشيطه في المختبر باستخدام مانحين جزيئات صغيرة مثل أسيتيل فوسفات 4.

في هذه الطريقة ، تسمى رقاقة DAP للرقاقة المنقاة بتقارب الحمض النووي (شكل 1) ، يتم استنساخ جين RR ذي الأهمية مع علامة His في بكتريا قولونية، ويسمح للبروتين الموسوم المنقى لاحقًا بالارتباط بالحمض النووي الجيني المنفصمة. يتم بعد ذلك إثراء الحمض النووي المرتبط بالبروتين عن طريق تنقية التقارب ، ويتم تضخيم الحمض النووي المخصب والمدخلات ، وتسمية الفلورسنت ، وتجميعها معًا وتهجينها إلى مصفوفة تبليط مصممة خصيصًا للكائن الحي محل الاهتمام (شكل 1). تخضع تجارب ميكروأري للقطع الأثرية ، وبالتالي يتم استخدام خطوات إضافية لتحسين الفحص. تتمثل إحدى هذه الخطوات في محاولة تحديد هدف واحد لـ RR قيد الدراسة باستخدام مقايسات تحول الحركة الكهربي (EMSA) (انظر سير العمل في الشكل 2). بعد ذلك ، بعد الارتباط بالحمض النووي الجيني وخطوات DAP ، يتم فحص الحمض النووي المرتبط بالبروتين والمدخل بواسطة qPCR لمعرفة ما إذا كان الهدف الإيجابي قد تم إثرائه في الجزء المرتبط بالبروتين بالنسبة لجزء الإدخال ، وبالتالي تأكيد شروط الربط المثلى لـ RR (الشكل 2). بعد تهجين الصفيف ، يتم تحليل البيانات للعثور على قمم ذات إشارة أعلى كثافة تشير إلى المواقع الجينية حيث يرتبط البروتين. يمكن توقع وظائف RR بناءً على أهداف الجينات التي تم الحصول عليها. تُستخدم المواقع الجينومية المستهدفة للتنبؤ بزخارف موقع الربط ، والتي يتم التحقق من صحتها تجريبياً باستخدام EMSAs (الشكل 2). يمكن بعد ذلك توسيع التوقعات الوظيفية والأهداف الجينية لـ RR لتشمل الأنواع ذات الصلة الوثيقة التي تشفر RRs المتعامدة عن طريق مسح تلك الجينومات بحثًا عن أشكال ربط مماثلة (الشكل 2). يمكن أن توفر طريقة رقاقة DAP ثروة من المعلومات لـ TCS حيث لم تكن موجودة في السابق. يمكن أيضًا استخدام الطريقة لأي منظم نسخ إذا كان من الممكن تنقية البروتين وتحديد شروط ربط الحمض النووي ، ولأي كائن حي مع وجود تسلسل الجينوم المتاح.


شكل 1. إستراتيجية الرقاقة المنقاة بتقارب الحمض النووي (DAP-chip) 7 . يتم استنساخ الجين RR من الكائن المعني مع علامة His-carboxy-terminal في an بكتريا قولونية سلالة التعبير. يتم تنشيط البروتين الذي تم تنقيته بواسطة الفسفرة باستخدام فوسفات الأسيتيل ، ويخلط مع الحمض النووي الجيني المنفصمة. يتم حفظ جزء من تفاعل الارتباط كمدخلات DNA ، بينما يخضع الباقي لتنقية التقارب باستخدام راتنج Ni-NTA. يتم تضخيم جينوم المدخلات والحمض النووي المرتبط بـ RR بالكامل ، ويتم تمييزهما بـ Cy3 و Cy5 ، على التوالي. يتم تجميع الحمض النووي المسمى معًا وتهجينه في مجموعة تبليط ، والتي يتم تحليلها بعد ذلك لتحديد أهداف الجينات. تم تعديل الشكل وطباعته باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من 7.


الشكل 2. ملخص سير العمل. بالنسبة لأي بروتين منقى موسوم ، ابدأ بتحديد هدف باستخدام EMSA. السماح للبروتين بربط الحمض النووي الجيني ثم تنقية تقارب الحمض النووي (DAP) والجينوم الكامل (WGA) الحمض النووي المخصب والمدخل. إذا كان هدف الجين معروفًا ، فاستخدم qPCR للتأكد من إثراء الهدف المعروف في الجزء المرتبط بالبروتين. إذا لم يتم تحديد أي هدف ، فانتقل مباشرة إلى وسم الحمض النووي وتهجين الصفيف. إذا تعذر ملاحظة التخصيب بواسطة qPCR ، فكرر خطوات ربط البروتين - جدنا وخطوات DAP-WGA باستخدام كميات بروتين مختلفة. استخدم تحليل المصفوفة للعثور على القمم وتعيينها لاستهداف الجينات. استخدم مناطق المنبع للجينات المستهدفة للتنبؤ بزخارف موقع الارتباط. التحقق من صحة الزخارف تجريبيا باستخدام EMSAs. استخدم الدافع لمسح جينومات الأنواع ذات الصلة المشفرة لتقويم العظام من RR قيد الدراسة ، والتنبؤ بالجينات المستهدفة في تلك الأنواع أيضًا. بناءً على أهداف الجينات التي تم الحصول عليها ، يمكن التنبؤ بالوظيفة الفسيولوجية لـ RR وأخصائيي تقويم العظام. تم تعديل الشكل وطباعته باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من 7.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

بروتوكول

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول أدناه لتحديد أهداف الجينات الخاصة بـ RR DVU3023 من البكتيريا Desulfovibrio vulgaris هيلدنبره. يمكن تكييفه مع أي منظم نسخي آخر مهم.

  1. استنساخ جين RR ، وتحديداً DVU3023 ، من D. فولغاريس Hildenborough الى الإشريكية القولونية ناقل التعبير مثل أن يكون الجين ذو علامات C نهائيًا ويكون التعبير تحت سيطرة محفز T7.
    ملحوظة: يمكن استخدام عدة طرق للاستنساخ ويحددها الباحث. يمكن أيضًا استخدام علامات التقارب البديلة.
  2. تحويل بناء التعبير إلى بكتريا قولونية سلالة التعبير BL21 (DE3).
  3. تنمو 1 لتر من سلالة التعبير BL21 عند 37 & # 176 درجة مئوية. في مرحلة منتصف السجل ، أضف IPTG إلى 0.5 ملي مولار للحث على تعبير البروتين. استمر في النمو في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
  4. خلايا الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 & # 176 درجة مئوية. Resuspend الخلايا في محلول تحلل (20 ملي فوسفات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.4 ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، 40 ملي إيميدازول ، 1 مجم / مل من الليزوزيم ، 1x نوكلياز بنزوناز). خلايا ليس باستخدام مكبس فرنسي في 4 & # 176 درجة مئوية.
  5. محللة الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 & # 176 درجة مئوية. قم بالتصفية باستخدام مرشح حقنة 0.45 & # 181m.
  6. اغسل عمود Ni Sepharose سعة 1 مل على أداة FPLC باستخدام 10 مل من محلول الغسيل (20 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، 40 ملي إيميدازول).
  7. تحميل المحللة على العمود. يغسل العمود بـ 20 مل من محلول الغسيل.
  8. أزل DVU3023 باستخدام تدرج من 0-100٪ محلول شطف (20 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 500 ملي مولار إيميدازول).
  9. تحميل الكسور التالفة على عمود تحلية ، ويغسل مع محلول إزالة الملوحة (20 ملي فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم).
  10. عينة بروتين جهاز الطرد المركزي في مرشح طرد مركزي عالي الوزن الجزيئي لتركيز البروتين. أضف DTT إلى 0.1 ملي مولار والجلسرين إلى 50٪ وقم بتخزين البروتين في -20 & # 176 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب تحسين طرق التنقية بشكل فردي لكل بروتين قيد الدراسة.

2. تحديد الهدف الجيني لـ RR باستخدام اختبار التحول الكهربي للتنقل (EMSA)

  1. يقوم PCR بتضخيم 400 نقطة أساس في المنبع للجين المستهدف المرشح DVU3025 ، باستخدام D. فولغاريس الحمض النووي الجيني Hildenborough كقالب ، وتمهيدي أمامي غير مسمى وكتامة عكسية 5 & # 8217-biotin.
    ملحوظة: نصائح لاختيار جين مستهدف مرشح: غالبًا ما تربط RRs مناطق المنبع لجينها / مشغلها ، أو قد تنظم الجينات المشفرة تقريبًا. إذا كان لدى RR أطباء تقويم في الأنواع الأخرى ، فابحث عن الجينات المحفوظة في الحي. تتضمن الطرق البديلة اختيار الجينات المرشحة بناءً على تنبؤات اللوائح (على سبيل المثال، & # 160RegPrecise 5) ، أو توقع المروجين المعتمدين على sigma54 6 لـ RRs التي تعتمد في حد ذاتها على sigma54.
  2. قم بتشغيل منتج PCR على هلام agarose 1٪ ، وقطع المنتج بحجم 400 نقطة أساس ، وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف استخراج هلام.
  3. امزج بروتين DVU3023 (0.5 pmol) مع 100 fmol من ركيزة DNA المكوّنة من حمض نووي في 10 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 50 ملي مول كلوريد ، 5 ملي مول كلوريد2، 1 مم DTT ، 25٪ جلسرين و 1 & # 181 جم / مل بولي دي دي سي (DNA منافس غير محدد) بحجم إجمالي قدره 20 & # 181 لتر. قم أيضًا بإعداد تفاعل بدون أي بروتين كعنصر تحكم. احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء لمدة 20 دقيقة.
  4. ملاحظة: هذه هي الشروط القياسية المدرجة ويمكن إضافة مكونات تفاعل أخرى اعتمادًا على RR ذات الأهمية. إذا كان التنشيط مطلوبًا ، أضف 50 ملي أسيتيل فوسفات إلى التفاعل (غالبًا ما ترتبط RRs بالحمض النووي في المختبر بدون تفعيل).
  5. قم مسبقًا بتشغيل هلام بولي أكريلاميد -0.5x TBE صغير مسبق الصب 6٪ في محلول مؤقت 0.5x TBE عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة. أضف 5 & # 181 لتر من محلول تحميل 5x (0.1٪ بروموفينول أزرق ، 0.1٪ سيانول زيلين ، 30٪ جلسرين في 1x TBE) إلى تفاعلات الربط وتحميل 18 & # 181 لتر من التفاعلات على الجل. اركض بسرعة 100 فولت لمدة ساعتين.
    ملاحظة: من أجل تجنب ارتفاع درجة الحرارة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تفكك معقدات البروتين والحمض النووي ، املأ الغرفة العازلة الخارجية في نظام الرحلان الكهربي بمخزن مؤقت يعمل بحيث يتم عزل غالبية الهلام بواسطة المخزن المؤقت. بالتناوب ، يمكن تشغيل الجل عند 4 & # 176 درجة مئوية.
  6. قطع غشاء نايلون مشحون بحجم الجل وانقعه في 0.5x TBE لمدة عشر دقائق على الأقل. قم بإزالة الجل من الكاسيت. قم بقطع أي نتوءات من الجل وسندويش الهلام والغشاء بين ورقتي ترشيح سميكتين مبللتين في 0.5x TBE ، وضعها داخل جهاز تنشيف شبه جاف وتشغيلها عند 20 فولت لمدة 30 دقيقة.
  7. ضع الغشاء داخل أداة كروس لينكر ضوء الأشعة فوق البنفسجية التجارية واضبط الوقت على 3 دقائق.
    ملاحظة: يمكن الآن تخزين الغشاء جافًا في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  8. استخدم مجموعة أدوات الكشف عن اللمعان الكيميائي المتاحة تجاريًا والتي تستخدم بيروكسيديز الفجل المتقارن streptavidin-horse لتطوير البقعة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة & # 8217s.
  9. قم بتصوير اللطخة باستخدام جهاز كمبيوتر متصل بكاميرا مجهزة بـ CCD وابحث عن تحول في حركة ركيزة الحمض النووي في وجود RR ، مما يشير إلى أن RR يربط الحمض النووي الذي يتم اختباره.
    ملحوظة: يمكن اختبار خصوصية تحول البروتين إلى الحمض النووي من خلال تضمين التفاعل فائضًا من الحمض النووي المنافس غير المصنف ، والذي ينبغي أن يزيل أو يقلل التحول الملحوظ.

3. تحقق من تخصيب الهدف بعد ربط الحمض النووي بالبروتين الجيني

  1. تفاعل ربط بروتين الجينوم DNA
    1. قص الحمض النووي إلى متوسط ​​حجم 500 نقطة أساس عن طريق صوتنة 100 & # 181 لتر من الحمض النووي الجيني (بتركيزات 100-200 نانوغرام / & # 181 لتر) في أنبوب دقيق بسعة 1.5 مل باستخدام طرف ميكرو مع 9 نبضات منخفضة السعة من 1 ثانية ، مع 2 فجوة ثانية بين كل منهما.
      ملاحظة: إذا تناثر الحمض النووي على جوانب الأنبوب ، فقم بتدوير المحتويات لأسفل بعد كل 3 نبضات. تختلف الشروط الدقيقة المستخدمة باختلاف أداة السونيك المستخدمة. قد تتراوح شظايا الحمض النووي المنفصمة من 100-1000 زوج قاعدي ، ولكن يجب أن يكون متوسط ​​الحجم في حدود 400-600 زوج قاعدي. قد يؤدي القص المفرط إلى عدد أقل من مواقع الربط السليمة ، وسيؤثر القص الزائد أو القليل جدًا على إعداد المكتبة أثناء خطوات تضخيم الجينوم بأكمله.
    2. امزج 2-3 & # 181 جم من الحمض النووي الجيني المنفصمة مع بروتين RR (0.5 pmol من DVU3023) في 10 ملي مولار من Tris-HCl الأس الهيدروجيني 7.5 ، 1 ملي مولار DTT ، 50 ملي بوكل ، 5 ملي MgCl2، 25٪ جلسرين ، و 50 ملي فوسفات أسيتيل. احتضان التفاعلات عند 25 & # 176 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نقل 10 & # 181l من هذا التفاعل إلى أنبوب 1.5 مل وتسمية كمدخلات DNA.
      ملحوظة: يضاف فوسفات الاسيتيل لتنشيط البروتين بواسطته في المختبر الفسفرة. تحفز الفسفرة ارتباط الحمض النووي ، لكن العديد من RRs تربط أيضًا الحمض النووي في المختبر بدون تفعيل 7. ستعتمد كمية البروتين المضافة إلى التفاعل على نشاط تحضير البروتين. يمكن استخدام EMSA لتحسين هذا المبلغ.
    1. أضف 30 & # 181 لتر من راتينج الاغاروز Ni-NTA إلى أنبوب ميكروفيوج 0.6 مل. الطرد المركزي في 100 x g لمدة 1 دقيقة لجمع الراتنج في الجزء السفلي ، وإزالة المادة طافية. أضف 100 & # 181 لترًا من المخزن المؤقت للغسيل (10 مم Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 5 ملي MgCl2، 50 ملي بوكل ، 25٪ جلسرين) ، نفض الغبار عن الأنبوب للخلط ، وجهاز الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة دقيقتين. إزالة طاف.
    2. أضف 90 & # 181l المتبقية من تفاعل الارتباط إلى راتينج Ni-NTA المغسول واحتضنها في شاكر دوار لمدة 30 دقيقة.
    3. الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 2 دقيقة ، وإزالة المادة طافية (الحمض النووي غير منضم). أضف 100 & # 181 لترًا من المخزن المؤقت للغسيل ، ثم حرك الأنبوب لخلط المحتويات ، وجهاز الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة دقيقتين. إزالة طاف. كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين.
    4. أضف 35 & # 181 لترًا من محلول الشطف (20 ملي مولار من فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 8 ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، 500 ملي إيميدازول) إلى الراتينج واخلطه عن طريق دوامة. احتضان على مقاعد البدلاء في RT لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي عند 100 x g لمدة دقيقتين. نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديد والتسمية ككسر الحمض النووي المرتبط بالبروتين.
    5. أضف أيضًا 35 & # 181 لترًا من المخزن المؤقت لشطف الحمض النووي للإدخال.
    6. تنقية المدخلات وكسور الحمض النووي المرتبطة بالبروتين باستخدام مجموعة تنقية PCR.
    1. أضف 10 & # 181 لترًا من المدخلات والحمض النووي المرتبط بالبروتين لفصل أنابيب PCR. أضف 1 & # 181l من المخزن المؤقت للتجزئة 10x ، و 2 & # 181l من المخزن المؤقت لإعداد المكتبة ، و 1 & # 181l من محلول تثبيت المكتبة لكل عينة. تخلط جيدا عن طريق الدوامة. قم بالتسخين في جهاز تدوير حراري عند 95 & # 176 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، ثم قم بتبريده على الثلج.
      ملاحظة: يجب أن تكون كمية البداية من الحمض النووي 10 نانوغرام على الأقل لتجنب إدخال تحيز التضخيم.
    2. أضف 1 & # 181l من إنزيم تحضير المكتبة ، واخلطه عن طريق الماصات ، واحتضانه في دائري حراري عند 16 & # 176 درجة مئوية / 20 دقيقة ، 24 & # 176 درجة مئوية / 20 دقيقة ، 37 & # 176 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، 75 & # 176 درجة مئوية / 5 دقيقة ، مع الاستمرار في 4 & # 176 درجة مئوية.
    3. لكل أنبوب ، أضف 47.5 & # 181 لترًا من الماء ، و 7.5 & # 181 لترًا من المزيج الرئيسي للتضخيم 10x ، و 5 & # 181 لترًا من البوليميراز. اخلطي جيدًا وسخنيها عند 95 درجة مئوية 176 درجة مئوية / 3 دقائق ، متبوعة بـ 20 دورة من 94 درجة مئوية 176 درجة مئوية / 15 ثانية ، 65 درجة مئوية 176 درجة مئوية / 5 دقائق. عقد ردود الفعل في 4 & # 176C.
    4. تنقية عينات الحمض النووي المكبرة باستخدام مجموعة تنقية PCR وقياس تركيز الحمض النووي الطيفي.
    1. صمم بادئات qPCR لتضخيم 200 نقطة أساس من منطقة المنبع للجين المستهدف الذي تم التحقق منه بواسطة EMSA (DVU3025) باستخدام أي برنامج تصميم تمهيدي متاح مجانًا.
    2. قم بإعداد تفاعلات qPCR ثلاثية لكل قالب DNA مع كل مجموعة أولية. قم بإعداد مزيج رئيسي لكل مجموعة برايمر. 1x Master mix يحتوي على 10 & # 181l من 2x Sybr Green qPCR mix، 0.5 & # 181M من كل برايمر وماء بإجمالي 18 & # 181 لتر. قسامة 18 & # 181 لترًا من المزيج الرئيسي لكل بئر من صفيحة PCR بها 96 بئر.
    3. قم بتخفيف المدخلات المنقاة والمضخّمة وعينات الحمض النووي المرتبطة بالبروتين إلى 5 نانوغرام / & # 181 لتر بالماء واستخدمها كقالب للحمض النووي. أضف 2 & # 181l من قالب DNA إلى الآبار.
    4. ختم اللوحة بفيلم qPCR الختم شديد الوضوح ، قم بتدوير اللوحة في جهاز طرد مركزي عند 200 × جم / 1 دقيقة. ضع اللوحة في آلة qPCR في الوقت الحقيقي. دورة على النحو التالي باستخدام برنامج qPCR المرتبط: 95 & # 176C / 1 دقيقة ، و 40 دورة من 95 & # 176C / 10 ثوانٍ ، و 59 & # 176C / 15 ثانية ، و 70 & # 176C / 35 ثانية.
    5. قم أيضًا بإعداد تفاعلات qPCR ثلاثية مع بادئات لتضخيم مناطق المنبع لجين غير ذي صلة (تحكم سلبي).
    6. احسب & # 916Cتي بطرح Cتي قيمة الحمض النووي المرتبط بالبروتين من DNA المدخلات. احسب إثراء الجين المستهدف في الحمض النووي المرتبط بالبروتين كـ 2 & # 916C تي.
      ملاحظة: إذا تم إثراء منطقة المنبع المستهدفة في الحمض النووي المرتبط بالبروتين مقابل الحمض النووي المدخل ، فهذا يشير إلى أن تفاعلات الربط وتنقية التقارب كانت ناجحة. انتقل إلى الخطوة 4. إذا لم يتم ملاحظة تخصيب منطقة المنبع المستهدفة ، كرر تفاعلات الربط (الخطوة 3.1) بكمية مختلفة من البروتين.

    4. وسم الحمض النووي وتهجين الصفيف

    1. تسمية إدخال DNA مع Cy3 والحمض النووي المخصب مع Cy5
      ملاحظة: أصباغ Cy3 و Cy5 حساسة للضوء ويجب توخي الحذر لتقليل التعرض للضوء إلى الحد الأدنى.
      1. امزج 1 & # 181g DNA مع 40 & # 181l Cy3 / Cy5 المسمى 9 أمتار واضبط الحجم على 80 & # 181l بالماء.
      2. تفسد الحرارة عند 98 & # 176 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام (في جهاز التدوير الحراري). برد سريعًا على الجليد لمدة دقيقتين.
      3. أضف 2 & # 181l Klenow polymerase (3 & # 8217-5 & # 8217-exo - ، 50000 وحدة / مل) ، و 5 ملي مولار من dNTPs ، و 8 & # 181 لتر ماء لكل تفاعل ، واخلط جيدًا ، واحتضان عند 37 & # 176 درجة مئوية من أجل 2 ساعة في الظلام (في جهاز التدوير الحراري).
      4. أضف EDTA إلى 50 ملي لإيقاف التفاعل ومحلول كلوريد الصوديوم إلى 0.5 م.
      5. نقل العينات إلى 1.5 مل أنابيب تحتوي على 0.9 حجم من الأيزوبروبانول ، واحتضانها في الظلام لمدة 10 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي في 12000 × ز لمدة 10 دقيقة. يجب أن تكون الحبيبات باللون الوردي للحمض النووي المسمى Cy3 والأزرق للحمض النووي المسمى Cy5.
      6. اغسل الحبيبات بنسبة 80٪ من الإيثانول (500 & # 181 لتر) وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة دقيقتين. الكريات تجف بالهواء لمدة 5-10 دقائق في الظلام.
        Note: Pellets may be stored at -20 °C.
      7. Resuspend pellet in 25 µl water. Measure DNA concentration spectrophotometrically.
      8. Pool together 6 µg each of the Cy3- and Cy5-labeled DNA in a 1.5 ml tube and vacuum dry in a centrifuge on low heat in the dark (cover the centrifuge lid if it is transparent).
        Note: Pellets may be stored at -20 °C until ready for hybridization.
      1. Turn the hybridization system on 3-4 hr prior to use and set the temperature to 42 °C.
      2. Prepare a hybridization solution master mix such that 1x solution contains 11.8 µl 2x Hybridization buffer, 4.7 µl Hybridization Component A, and 0.5 µl alignment oligo.
      3. Resuspend the pellets in 5 µl water. Add 13 µl of this mix to the sample. Vortex for 15 sec, incubate at 95 °C in a dry bath for 5 min. Keep samples at 42 °C in the hybridization system until ready for loading.
      4. Prepare the microarray slide-mixer assembly, according to manufacturer’s protocol.
      5. Place the mixer-slide assembly within the hybridization system. Load 16 µl of sample into the fill port, seal the ports with an adhesive film, turn mixing on in the system, and hybridize for 16-20 hr at 42 °C.
      6. Prepare 1x wash buffers I (250 ml), II (50 ml) and III (50 ml) by diluting the 10x commercially available buffers in water, and to each add DTT to 1 mM. Warm Buffer I to 42 °C.
      7. Slide the mixer-slide into a disassembly tool, and place inside a dish containing warm Buffer I. Peel the mixer off, while vigorously shaking the disassembly tool by hand.
      8. Place the slide into a container with 50 ml of Wash buffer I and shake vigorously for 2 min by hand.
      9. Transfer slide into a second container with 50 ml Wash buffer II and shake vigorously for 1 min by hand.
      10. Transfer slide into a third container with 50 ml Wash buffer III, and shake vigorously for 15 sec by hand.
      11. Quickly blot the edges of the slide on a paper towel, and place in a slide rack. Centrifuge at 200 x g for 2 min to dry the slide. Place within slide case, wrap it with foil, and store in a desiccator.
      1. Place the slide within the microarray scanner according to the instrument’s instructions.
      2. Use a scanner software to set the wavelengths as 532 nm = Cy3 and 635 nm = Cy5, and the initial photomultiplier gains between 350 and 400.
      3. Preview the slide to locate the array on the slide. Select the array region for scanning.
      4. Scan the array and adjust the photomultiplier settings such that the array features are mostly yellow. The histogram should show the red and green curves superimposed or as close to each other as possible. The curves should end above the 10 -5 normalized counts at saturation.
      5. Save both 532 and 635 nm images separately.
      1. Import the images into an array analysis software. Using the software, create two pair reports (.pair) for each array (for Cy3 and Cy5 images). Create scaled log2ratio files using the pair files. Use log2ratio files to search for peaks using a sliding window of 500 bp. Map the peak loci to the upstream regions of gene targets.
      2. Check if the positive target (determined using EMSA and confirmed by qPCR, DVU3025 in this example) appears within the top peaks.
        Note: If the positive target is not among the top hits, it is possible that the RR under consideration has several gene targets and replicate DAP-chips can be conducted and peaks common to all replicates can be used to generate a target list.

      5. Binding Site Motif Prediction and Validation

      1. Retrieve sequences for upstream regions (400 bp) for the top gene targets as generated by DAP-chip analysis. Apply MEME on these sequences through Microbes Online (meme.nbcr.net) to predict motifs.
        Note: Enhancer binding proteins such as sigma54-dependent regulators can bind several hundred base pairs upstream of the start site. For other transcriptional regulators, a shorter region such as 200 bp upstream will be sufficient.
      2. Design top and bottom strand DNA oligomers that contain the predicted binding site motif flanked by 10 bases on either end. Order the top strand 5’ biotinylated.
      3. Mix the top and bottom strand oligos in 1:1.5 ratio in 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, and 50 mM NaCl in a total reaction volume of 20 µl in PCR tubes. Heat to 95 °C for 5 min in a thermal cycler, followed by slow cooling to 25 °C. Dilute ten fold and use as wild type dsDNA substrate for EMSA.
      4. Prepare modified substrates using the same steps as above, but design oligomers to carry 4-6 substitutions in the conserved bases of the binding motif.
      5. Set up binding reactions with the RR and the wild type or modified substrates and examine using EMSA as described in step 2.
      6. Note: The predicted motif is validated if the RR binds the wild type substrate but not the modified one.

      6. Conservation of Motif in Other Related Bacterial Species

      1. Select genomes of interest that contain orthologs of DVU3023. Obtain sequence and annotation files for the genomes from the NCBI site.
      2. Use a programming language such as Perl to write scripts that will use the motif sequences from the DAP-chip targets to build a position weighted matrix and use the matrix to score similar motifs present in other sequenced genomes.

      Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

      Representative Results

      The above method was applied to determine the global gene targets of the RRs in the model sulfate reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 . This organism has a large number of TCSs represented by over 70 RRs, indicating the wide variety of possible signals that it senses and responds to. في الجسم الحي analyses on the functions of these signaling systems are hard to perform since their signals and thus their activating conditions are unknown. Here the DAP-chip method was used to determine the gene targets and thus predict possible functions for a representative RR DVU3023.

      DVU3023 is a sigma-54-dependent RR encoded in an operon with its cognate HK (Figure 3A). The C-terminal His-tagged gene was cloned into and purified from بكتريا قولونية. For initial target determination, the purified RR was tested for binding to its downstream operon which is a ten gene-operon (DVU3025-3035) consisting of lactate uptake and oxidation genes. RR DVU3023 shifted the upstream region of DVU3025 (Figure 3B). Next RR DVU3023 was allowed to bind to sheared D. vulgaris Hildenborough genomic DNA. Although phosphorylation was not required for binding to the promoter region of DVU3025, acetyl phosphate was added to the reaction in case it was required for binding to other promoters. Following affinity purification of the protein-bound DNA fraction, qPCR was used to show that the upstream region of DVU3025 is enriched (8.45 fold) in the protein-bound fraction (Cتي= 6.9) relative to the input DNA (Cر =9.98) (Figure 3C), thus indicating that the binding conditions used were appropriate for RR DVU3023. Lack of enrichment of the promoter region of a randomly chosen gene (DVU0013) was used as a negative control.

      The protein-bound and input DNA samples were then labeled fluorescently and hybridized to a D. vulgaris Hildenborough tiling array that had a high probe density in the intergenic regions. The top four peaks were chosen as the most likely targets for DVU3023 (Figure 3D). These four peaks were followed by several others, which were also identified in DAP-chip analyses for several other RRs and hence appear to be sticky DNA (الجدول 1). Figure 3E is a schematic representation of the genes regulated by DVU3023. The positive target DVU3025 was the first peak obtained with the highest score. Two gene targets are two other singly encoded lactate permeases (DVU2451 and DVU3284). The fourth gene target does not lie in an upstream region, but in the intergenic region between two convergently transcribed genes/operons (DVU0652 and DVU0653). This is a large intergenic region, and additionally also encodes a predicted sigma54-dependent promoter. It is possible that there is an undiscovered sRNA encoded in this region that is regulated by RR DVU3023.

      Using the upstream regions of the targets obtained by DAP-chip, MEME was used to predict a binding site motif (Figure 3F, الجدول 2). EMSA substrates carrying the specific motif upstream of DVU3025 were designed to confirm that RR DVU3023 recognizes and binds the predicted motif. The motif was further validated by making substitutions in the conserved bases within the motif which eliminated the binding shift (Figure 3G). This validated motif was then used in Perl-generated scripts to scan the genome sequences of other closely related sulfate reducing bacteria that had orthologs for DVU3023. Loci were chosen as possible gene targets when the motif was located in upstream regions of open reading frames (Table 3). Using the motif sequences predicted for the orthologous RRs, a consensus binding site motif was generated (Figure 3F) which closely resembled the one obtained for D. vulgaris Hildenborough alone.


      Figure 3. Determining genomic targets for D. vulgaris response regulator DVU3023. أ. DVU3023 is encoded in an operon with its cognate HK. The downstream operon has a sigma54-dependent promoter (bent black arrow) and was used as a candidate target gene. ب. Purified RR DVU3023 bound and shifted the upstream region of DVU3025 7 . ج. q-PCR of upstream regions of DVU3025 (positive target) and DVU0013 (chosen as a negative control). E is protein-bound enriched DNA fraction, I is input DNA. د. Top four peaks obtained after DAP-chip analysis. Start and End refer to DNA coordinates at the start and end of the peaks score refers to the log2R ratio of the fourth highest probe in the peak Fdr = false discovery rate cutoff_p is the cutoff percentage at which the peak was identified. E. Schematic representation of the gene targets for DVU3023 based on the DAP-chip peaks. Numbers in boxes indicate the peak number in D. The HK-RR genes are in green, target genes in blue and other genes in grey. Black bent arrows are sigma54-dependent promoters, green filled circles are predicted binding site motifs. Gene names are as follows: por –pyruvate ferredoxin oxidoreductase llp – lactate permease glcD- glycolate oxidase glpC- Fe-S cluster binding protein pta – phosphotransacetylase ack- acetate kinase lldE – lactate oxidase subunit lldF/G – lactate oxidase subunit MCP – methyl-accepting chemotaxis protein. F. Weblogo 8 images of the predicted binding site motif. Top – derived from DAP-chip targets Bottom – derived from binding sites present in genomes with orthologs of DVU3023 7 . G. Validation of predicted binding site motif using EMSA. DVU3023 shifted the wild type motif (w) but not the modified motif (m). Sequences for the w and m motifs are shown on the right 7 . Figure modified and reprinted using the creative commons license from Rajeev وآخرون 7 .


      Table 1. Top 20 peaks from the DAP-chip array analysis. The table is divided into three sections. Peak attributes show details of the peaks as generated by array analysis software, where Location refers to whether the peak was found in the genome or the extrachromosomal plasmid, Start and End refer to the start and end loci for the peak, Score refers to the log2R ratios for the fourth highest probe in the peak, Fdr refers to the false discovery rate value, and cutoff_p is the cutoff percentage at which the peak was identified. The other two sections Start coordinate mapping and End coordinate mapping map the start and end loci, respectively, of the peak to the gene. In these sections Gene strand refers to the strand coding the gene, Offset indicates distance from the start of the gene (positive values indicate loci is upstream of gene, while negative values indicate loci is within the gene), Overlap gene value is TRUE if the locus overlaps a gene, DVU refers to the DVU# of the gene that the coordinates map to, and Description indicates the gene annotation. Table modified and reprinted using the creative commons license from Rajeev وآخرون 7. Please click here to view a larger version of this table.


      Table 2. Sequences used to build the consensus DAP-chip target based motif in Figure 3. Table modified and reprinted using the creative commons license from Rajeev وآخرون 7 .


      Table 3. Binding site motifs for DVU3023 orthologs present in other sequenced ديسولفوفيبريو and related species. For each genome scanned, the organism name is indicated, followed by the locus tag for the DVU3023 ortholog and its percent identity to DVU3023 in parentheses. Score indicates the value assigned by the Perl program based on similarity to the input sequences. Description states the gene annotations for the genes in the target operon. Table modified and reprinted using the creative commons license from Rajeev وآخرون 7. Please click here to view a larger version of this table.

      Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

      مناقشة

      The DAP-chip method described here was successfully used to determine the gene targets for several RRs in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 of which one is shown here as a representative result. For RR DVU3023, choosing a candidate gene target was straightforward. DVU3025 is located immediately downstream of the RR gene, and the RR and target genes are conserved in several ديسولفوفيبريو species, and additionally DVU3025 has a predicted sigma54-dependent promoter. The EMSA provides a simple method to rapidly test the RR for binding to the candidate target gene, and also allows the assessment of the activity of the purified protein sample, as well as determine optimal protein-DNA binding conditions.

      The DNA binding activity can also be tested in the presence and absence of acetyl phosphate to see if phosphorylation is necessary for DNA binding. Not all RRs are phosphorylated by small molecule donors 9 , in these cases the purified cognate sensor kinase, if available, may be used to activate the protein. There are also atypical RRs known that lack key active site residues in the receiver domain and are not activated by phosphorylation 10 . For the majority of RRs studied, phosphorylation stimulates DNA binding 11 . However there are examples where phosphorylation does not affect في المختبر DNA binding 12 , and there are examples where phosphorylation is required for binding 13 , and also cases where the subset of promoters bound increases with phosphorylation 14 . The DAP-chip method may be performed with and without phosphorylation to determine if there are differences in the set of promoters bound by the RR. However, it should also be noted that some RRs may be purified in a functionally phosphorylated form from بكتريا قولونية 13 .

      The protocol described here is for a His-tagged protein such that the protein-bound DNA is affinity purified using Ni-NTA agarose resin, but it can easily be adapted for any kind of tagged protein by using the appropriate affinity resin for pull-down. Following the DAP-WGA steps, the qPCR step provides an additional control to ensure that the protein-gDNA binding conditions were appropriate and that the protein-bound DNA was successfully enriched by the affinity purification. Greater than 3-fold enrichment is sufficient to proceed with the hybridization step. Unlike the EMSA reaction, there is no non-specific competitor DNA like poly-dI.dC added to the gDNA binding reaction since it interferes with the WGA step. Due to this if the protein sample has non-specific DNA binding activity then clear enrichment of the confirmed target DNA will not be observed by qPCR. Thus the qPCR control step can be used to optimize the amount of protein used in the gDNA binding reaction. Commercially available kits for whole genome amplification claim to introduce no amplification bias when following their guidelines for minimum starting DNA material and low number of amplification cycles. The amplification bias may be checked using qPCR with various primer sets on amplified versus unamplified DNA. Any effect on downstream array hybridization may also be determined by differentially labeling and hybridizing pooled amplified and unamplified genomic DNA.

      The list of peaks that are generated following array data analysis is usually long with several peaks having a false discovery rate value of 0. Therefore a combination of other peak attributes such as high log2R scores and cutoff_p values (as generated by the array analysis software used in this study) are used to cull the list down to the highest confidence gene targets. The presence of the pre-determined gene target among the top five hits greatly strengthens the confidence in the data set. Performing this assay for a number of regulatory proteins from the same organism will also help to identify “sticky” DNA sequences that appear in several data sets 7 . Additionally if a binding site motif can be predicted and validated then the presence of the motif in peaks lower down in the list may also be used to choose a conservative target gene list. Enrichment of DNA sequences other than promoter regions may be artifacts of array hybridization or may indicate the regulation of previously unidentified open reading frames or small RNAs 7 . For regulators where a gene target could not be predetermined using EMSA, the DAP-chip assay may be performed “blind” 7 . In such cases also, identification of a binding site motif will improve the selection of gene targets. Determining the protein concentration to be used in the assay will depend on the non-specific binding activity of the protein, which may be assessed by EMSA using randomly chosen DNA substrates. Lower concentrations work better for those proteins with high nonspecific binding activity. The reliability of a blind DAP-chip may be improved by performing replicate assays with different protein concentrations. For RRs with few targets, just two or even a single assay may be sufficient to generate a target list which may be validated using subsequent EMSAs. The DAP-chip data for such RRs usually show a clear jump in the log2R scores or cutoff_p values beyond the initial few peaks. For RRs with several targets, data from three replicates may be analyzed to generate a list of common peaks, some of which may be selected for EMSA validation.

      The ability to predict binding site motifs based on the DAP-chip targets adds to the value of this method and vastly increases the information gained. EMSA again provides an efficient protocol to experimentally verify the predictions. Software scripts in Perl or other programming language may be used to rapidly search through available genome sequences. The results will identify both orthologous target genes as well as target genes uniquely regulated in the genomes searched. In the representative result shown here, three of the four upstream target regions identified for DVU3023 have annotated gene functions related to lactate uptake and oxidation. Additionally since the binding site motif for DVU3023 was validated, other genomes could be searched for similar motif sites. Together the results indicate that the DVU3022-3023 TCS is well conserved in the ديسولفوفيبريو and other related sulfate-reducing bacteria, and that it regulates genes for lactate transport and oxidation to acetate. Since lactate is the primary carbon and electron source used by these organisms, DVU3023 likely plays a key role in their physiology. Among the top DAP-chip peaks for RR DVU3023, there was also an intergenic region. Although a binding site motif was not found in this region, the presence of a predicted sigma-54-dependent promoter suggests that there may be an unidentified orf or sRNA encoded, and that it could be a true target for DVU3023. This finding highlights the value of the experimental DAP-chip approach combined with binding site predictions as opposed to determining target sites based on computational predictions alone.

      مشابه في المختبر methods such as the one described here have only been used in a few cases 15-17 and very rarely for a previously unstudied regulator. The optimization EMSA and qPCR steps prior to the array hybridization will substantially aid in analyzing the results when the method is to be used for a novel regulator. If array printing becomes an impediment, the DAP steps may be combined with next generation sequencing to obtain binding sites 18,19 . As more array-based methods become substituted with sequencing based strategies, such future adaptation of the method circumvents the need to design custom tiling microarrays for the organism of interest. ChIP-Seq technologies result in greater sensitivity and specificity of detection of peaks when compared to ChIP-chip methods, and are also rapidly becoming more cost-effective 20 . Although this article focused on two component response regulators, this method can be used for any prokaryotic or eukaryotic transcription factor 15 . Nucleosome occupancies often have an effect on targets that are regulated and comparing the target binding sites for eukaryotic transcription factors by في الجسم الحي و في المختبر analyses can reveal these effects 21 .


      خلفية

      Signal transduction to sense and respond to environmental and intracellular changes governs key cellular regulatory functions. In bacteria, two component systems, composed typically of a sensor histidine kinase (HK) and a response regulator (RR), are the primary and best-studied mechanisms for perceiving such changes and controlling downstream responses [1-3]. The regulatory network of an organism is often a reflection of the environments in which it can survive and the signal transduction systems in microbes have been correlated to their sensory IQs [2]. Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, an anaerobic sulfate reducing bacterium, occupies a variety of ecological niches and encodes a strikingly large number of these systems with unusual diversity attributed to lineage-specific expansion of existing gene families [4]. Studied since the 1940s, D. vulgaris Hildenborough has come to serve as a model system to evaluate dissimilatory sulfate reduction and hydrogen cycling [5]. However, the function of none of its two component systems, encoded by 72 RRs and 64 HKs, have been characterized to date.

      The distribution of RRs in D. vulgaris Hildenborough is considerably different from in other microbes. Of the 72 RRs in D. vulgaris Hildenborough, 29 have a DNA binding domain (DBD), indicating function via gene regulation. Twenty-two of these fall into the NtrC family of 𼍔-dependent RRs. 𼍔-dependent response regulators in bacteria typically make up approximately 9% of the total RRs in most organisms [2] but in D. vulgaris Hildenborough this group constitutes 30% of the total RRs, and 75% of the ones with DBDs. On the other hand, the OmpR family, which typically constitutes the most abundant class of RRs in bacteria, has only two representatives in D. vulgaris Hildenborough. The remaining five RRs fall into the LytR and NarL families (Table S1 in Additional file 1). With the exception of DVU1083, which is an ortholog of the الإشريكية القولونية PhoB [6], none of the RRs have any characterized orthologs. The targets of these 29 RRs represent the transcriptional portion of the two component regulatory network of this organism and to date remains almost entirely undetermined.

      With the exception of a few model organisms such as بكتريا قولونية [7,8], Caulobacter الهلال [9], and العصوية الرقيقة [10,11], genes regulated by these systems remain largely unmapped in most organisms. Even in model bacteria, systematic approaches to delineate gene targets and regulatory networks controlled by two component systems are rare and the available knowledge of their networks represents information compiled from a large body of literature, في السيليكو efforts [8,12], or by indirect inference of targets based on transcriptomics analysis [10]. While mapping of binding sites via ChIP-on-chip assays is now done routinely for transcription factors, it is effective for two component RRs only if the activating signal or conditions are known. As a result, even in بكتريا قولونية و B. الرقيقة the function and targets of some two-component systems remain unmapped.

      Here we present a systematic experimental determination of the genes regulated by the transcriptionally acting RRs in D. vulgaris Hildenborough. We optimized an في المختبر approach in order to bypass the requirement of using activating conditions that are largely unknown for these two component systems. To our knowledge, this is the first extensive use of an في المختبر genome-wide method to map bacterial two component system RR binding sites.


      Lina Mattsson, Catherine Legrand, Elin Lindehoff, and Martin Olofsson conceived and designed the experiment. Lina Mattsson performed the experiments. Lina Mattsson and Elin Lindehoff analyzed the data. Lina Mattsson, Catherine Legrand, Elin Lindehoff, and Martin Olofsson wrote the paper.

      Lina Mattsson, Conceptualization-Equal, Data curation-Equal, Formal analysis-Equal, Investigation-Equal, Methodology-Equal, Project administration-Equal, Software-Equal, Visualization-Equal, Writing-original draft-Equal, Writing-review & editing-Equal Elin Lindehoff, Conceptualization-Equal, Funding acquisition-Equal, ethodology-Equal, Project administration-Equal, Resources-Equal, Supervision-Equal, Writing-original draft-Equal, Writing-review & editing-Equal Martin Olofsson, Conceptualization-Equal, Resources-Equal, Writing-original draft-Equal, Writing-review & editing-Equal Catherine Legrand, Conceptualization-Equal, Funding acquisition-Equal, Methodology-Equal, Supervision-Equal,Writing-original draft-Equal,Writing-review & editing-Equal.

      يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.



تعليقات:

  1. Odhran

    هناك شيء مماثل؟

  2. Guzshura

    إنه لأمر مؤسف أنني لن أستطيع المشاركة في المناقشة الآن. ليس لدي المعلومات التي أحتاجها. لكن هذا الموضوع يهمني كثيرا.

  3. Tujar

    تهانينا ، هذا الفكر الرائع سيكون مفيدًا.

  4. Eoin Baiste

    مبروك ، فكرة رائعة وفي الوقت المناسب



اكتب رسالة