معلومة

14.1 ب: التطبيقات الحديثة للحمض النووي - علم الأحياء

14.1 ب: التطبيقات الحديثة للحمض النووي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الحمض النووي له العديد من التطبيقات في مجموعة متنوعة من المجالات بما في ذلك الطب الشرعي والطب.

أهداف التعلم

  • اشرح سبب كون الحمض النووي أداة عملية في مختلف المجالات ، مثل الطب الشرعي والطب

النقاط الرئيسية

  • الحمض النووي فريد لكل فرد ، وبالتالي يمكن استخدامه لأغراض تحديد الهوية.
  • يتكون الجينوم البشري من حوالي 3 مليارات زوج أساسي ، أي ما يعادل حوالي 20000 إلى 25000 جين وظيفي.
  • يتم توريث الحمض النووي لكل شخص من والديهم: 23 كروموسومًا من الأم ، و 23 كروموسومًا من الأب.

الشروط الاساسية

  • الطراز العرقى: توليفة من الأليلات ، الموجودة على الكروموسومات المقابلة ، والتي تحدد سمة معينة للفرد.
  • اللاقحة: الخلية الوحيدة التي تنشأ من اتحاد اثنين من الأمشاج ؛ في الحيوانات ، الخلية التي تنشأ من اتحاد الحيوانات المنوية والبويضة.
  • الجين: وحدة وراثية. الوحدات الوظيفية للكروموسومات التي تحدد خصائص معينة عن طريق ترميز RNAs أو بروتينات معينة.
  • النمط الظاهري: ظهور كائن حي بناءً على مزيج متعدد العوامل من السمات الوراثية والعوامل البيئية.

أصبح الاختصار "DNA" مرادفًا لحل الجرائم ، واختبار الأبوة ، والتعرف على الرفات البشرية ، والاختبار الجيني. يمكن استرجاع الحمض النووي من الشعر أو الدم أو اللعاب. تعد تسلسلات الحمض النووي لكل شخص فريدة من نوعها ، ومن الممكن اكتشاف الاختلافات بين الأفراد داخل النوع على أساس هذه الميزات الفريدة. يمكن أيضًا استخدام اختبار الحمض النووي لتحديد مسببات الأمراض ، وتحديد البقايا البيولوجية في الحفريات الأثرية ، وتتبع تفشي الأمراض ، ودراسة أنماط الهجرة البشرية. في المجال الطبي ، يُستخدم الحمض النووي في التشخيص وتطوير لقاحات جديدة وعلاج السرطان. من الممكن الآن أيضًا تحديد الاستعدادات لبعض الأمراض من خلال النظر في الجينات.

استنساخ

الاستنساخ التناسلي هو طريقة تستخدم لعمل نسخة أو نسخة متطابقة من كائن حي متعدد الخلايا بأكمله.
في الاستنساخ يكون لكل من الكائن الأصلي والمستنسخ DNA متطابق. التوائم المتطابقة هي ، من ناحية ، مستنسخات من بعضها البعض ؛ لديهم الحمض النووي المتطابق ، بعد أن تطوروا من نفس البويضة الملقحة.
أصبح الاستنساخ مشكلة في الأخلاق العلمية عندما أصبح الخروف أول حيوان ثديي مستنسخ من خلية بالغة في عام 1996.
منذ ذلك الحين ، تم استنساخ العديد من الحيوانات مثل الخيول والثيران والماعز بنجاح ، على الرغم من أن هؤلاء الأفراد غالبًا ما يظهرون تشوهات في الوجه والأطراف والقلب.

كانت هناك محاولات لإنتاج أجنة بشرية مستنسخة كمصادر للخلايا الجذعية الجنينية ، والتي يشار إليها أحيانًا باسم "الاستنساخ لأغراض علاجية". ينتج الاستنساخ العلاجي خلايا جذعية لمحاولة معالجة الأمراض أو العيوب الضارة (على عكس الاستنساخ لأغراض التكاثر ، الذي يهدف إلى تكاثر كائن حي). ومع ذلك ، واجهت جهود الاستنساخ العلاجي مقاومة بسبب اعتبارات أخلاقية حيوية.

كريسبر

تتيح تقنية كريسبر (التكرارات القصيرة المتناظرة القصيرة المنتظمة والمتباعدة بانتظام) للعلماء تحرير الجينوم ، وهو أفضل بكثير من التقنيات القديمة للربط الجيني والتحرير. تتمتع تقنية كريسبر بإمكانيات هائلة للتطبيق ، بما في ذلك تغيير السلالة الجرثومية للإنسان والحيوان والكائنات الحية الأخرى ، وتعديل جينات المحاصيل الغذائية.
ظهرت مخاوف أخلاقية حول هذه التكنولوجيا الحيوية واحتمال تعديل السلالة الجرثومية البشرية وصنع ما يسمى "الأطفال المصممون".

تقنية كريسبر: هذا الفيلم يمر بعملية كريسبر.

الكائنات المعدلة وراثيا

الكائن المعدل وراثيا (GMO) هو أي كائن تم تغيير مادته الوراثية باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية. تعد الكائنات المعدلة وراثيًا مصدرًا للأدوية والأغذية المعدلة وراثيًا وتستخدم أيضًا على نطاق واسع في البحث العلمي ، إلى جانب إنتاج سلع أخرى.
يتضمن التعديل الجيني طفرة أو إدخال أو حذف الجينات. عادة ما تأتي الجينات المُدخلة من أنواع مختلفة في شكل نقل جيني أفقي.

تم تعديل البكتيريا والنباتات والحيوانات وراثيًا منذ أوائل السبعينيات للأغراض الأكاديمية والطبية والزراعية والصناعية. في الولايات المتحدة ، تعد الكائنات المعدلة وراثيًا مثل فول الصويا Roundup-Ready والذرة المقاومة للحفر جزءًا من العديد من الأطعمة المصنعة الشائعة. كما هو الحال في العديد من مجالات التكنولوجيا الحيوية ، هناك جدل كبير في استخدام الكائنات المعدلة وراثيًا.


هذا يعني أنه من خلال تسلسل امتداد الحمض النووي ، سيكون من الممكن معرفة الترتيب الذي توجد به قواعد النوكليوتيدات الأربعة - الأدينين والجوانين والسيتوزين والثايمين - تحدث داخل جزيء الحمض النووي هذا.

تم توضيح ضرورة تسلسل الحمض النووي لأول مرة من خلال نظرية فرانسيس كريك بأن تسلسل النيوكليوتيدات داخل جزيء الحمض النووي يؤثر بشكل مباشر على تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات. في ذلك الوقت ، كان الاعتقاد السائد هو أن الجينوم المتسلسل بالكامل سيؤدي إلى قفزة نوعية في فهم الكيمياء الحيوية للخلايا والكائنات الحية.

يتكون تسلسل الحمض النووي الحديث من طرق عالية الإنتاجية تسمح باكتشاف تسلسل الحمض النووي بالكامل في غضون ساعات. سمحت هذه التكنولوجيا للعديد من الشركات بالبدء في تقديم اختبار الحمض النووي في المنزل. العديد من & # 8220 النتائج & # 8221 التي تم العثور عليها من خلال هذه الاختبارات هي مجرد ارتباطات موجودة بين المتغير الجيني وحالة معينة. ومع ذلك ، فقد سمحت التكنولوجيا أيضًا للعلماء باختبار الحمض النووي للعديد من الكائنات الحية لفهم العلاقات التطورية بشكل أفضل.


التوليف الجيني: الطرق والتطبيقات

أصبحت تقنيات وتقنيات تخليق الحمض النووي بسرعة حجر الزاوية في البيولوجيا الجزيئية الحديثة وتلعب دورًا محوريًا في مجال البيولوجيا التركيبية. لم تعد القدرة على تخليق جينات كاملة ، ومسارات جينية جديدة ، وحتى جينومات كاملة هي الحلم الذي كانت عليه قبل 30 عامًا. باستخدام ما يزيد قليلاً عن جهاز التدوير الحراري ، وقليل النوكليوتيدات المُصنَّع تجاريًا ، وبوليمرات الحمض النووي ، يمكن لمختبر البيولوجيا الجزيئية القياسي تصنيع عدة أزواج كيلوبيز من الحمض النووي الاصطناعي في أسبوع باستخدام التقنيات الحالية. هنا ، نقوم بمراجعة التقنيات المستخدمة في توليد الحمض النووي الاصطناعي ، من التخليق الكيميائي للقليل النيوكليوتيدات إلى تجميعها في تسلسلات طويلة ومخصصة. يتم استكشاف البرامج والمواقع الإلكترونية لتسهيل تنفيذ هذه الأساليب ، وتناقش تطبيقات تقنيات تخليق الحمض النووي للتعبير الجيني والبيولوجيا التركيبية. أخيرًا ، يتم تقديم مثال على التوليف الآلي للجينات من مختبرنا الخاص.


الهندسة الوراثية: تطبيقات تقنية الحمض النووي

استخدام الحمض النووي معاد التركيب أصبحت التكنولوجيا شائعة حيث أصبحت المنتجات الجديدة من النباتات والحيوانات والميكروبات المعدلة وراثيًا متاحة للاستخدام البشري. في عام 1997 ، تصدرت دوللي عناوين الصحف كأول نجاح مستنسخ الثدييات الكبيرة (الأغنام). منذ ذلك الحين ، كان هناك العديد من التطورات المماثلة في الطب ، مثل علاجات السرطان ، العديد من التطورات في الزراعة ، مثل المحاصيل المقاومة للحشرات المعدلة وراثيًا والعديد من التطورات في تربية الحيوانات ، مثل هرمونات النمو و المعدلة وراثيا الحيوانات (حيوان تلقى الحمض النووي المؤتلف).

يتصور معظم علماء التكنولوجيا الحيوية التطبيقات التكنولوجية للحمض النووي كواحدة من آفاق جديدة في العلوم مع إمكانات هائلة للنمو والاكتشاف.

طب

نتج عن الهندسة الوراثية سلسلة من المنتجات الطبية. كان أول منتجين محضرين تجاريًا من تقنية الحمض النووي المؤتلف هما الأنسولين وهرمون النمو البشري ، وكلاهما تمت تربيتهما في بكتيريا الإشريكية القولونية. منذ ذلك الحين ظهرت مجموعة كبيرة من المنتجات في السوق ، بما في ذلك القائمة المختصرة التالية ، وجميعها مصنوعة من الإشريكية القولونية:

بيونوت

أ مصل عادة ما تكون نسخة غير ضارة من بكتيريا أو فيروس يتم حقنها في كائن حي لتنشيط جهاز المناعة لمهاجمة وتدمير مواد مماثلة في المستقبل.

  • عامل نخر الورم. علاج بعض الخلايا السرطانية
  • انترلوكين 2 (IL-2). علاج السرطان ونقص المناعة وعلاج عدوى فيروس نقص المناعة البشرية
  • بروكيناز. علاج النوبات القلبية
  • تاكسول. علاج سرطان المبيض
  • الانترفيرون. علاج السرطان والالتهابات الفيروسية

بالإضافة إلى ذلك ، هناك عدد من اللقاحات يتم تحضيرها الآن تجاريًا من العوائل المؤتلفة. في وقت ما ، تم صنع اللقاحات عن طريق تغيير طبيعة المرض ثم حقنه في البشر على أمل أن ينشط جهاز المناعة لديهم لمحاربة التدخلات المستقبلية من قبل ذلك الغازي. لسوء الحظ ، كان المريض لا يزال يعاني من المرض في بعض الأحيان.

باستخدام تقنية الحمض النووي ، لا يلزم سوى القشرة الخارجية التي يمكن تحديدها للكائن الدقيق ، ونسخها ، وحقنها في مضيف غير ضار لإنتاج اللقاح. من المحتمل أن تكون هذه الطريقة أكثر أمانًا لأن الميكروب الفعلي المسبب للمرض لا ينتقل إلى المضيف. يتم تنشيط الجهاز المناعي بواسطة بروتينات محددة على سطح الكائن الدقيق-هـ. تأخذ تقنية الحمض النووي ذلك في الاعتبار وتستخدم فقط تحديد السمات السطحية للقاح. يتم حاليًا تطوير لقاحات فيروس التهاب الكبد B وفيروسات الهربس من النوع 2 والملاريا للاستخدام التجريبي في المستقبل القريب.

الزراعة

كانت نباتات المحاصيل ولا تزال محور التكنولوجيا الحيوية حيث تُبذل الجهود لتحسين الغلة والربحية من خلال تحسين مقاومة المحاصيل للحشرات وبعض مبيدات الأعشاب وتأخير النضج (لتحسين النقل ومقاومة التلف). ثبت أن إنشاء نبات معدّل وراثيًا ، والذي تلقى جينات من كائن حي آخر ، أكثر صعوبة من الحيوانات. على عكس الحيوانات ، كان من الصعب العثور على ناقل للنباتات حتى عزل تي بلازميد، التي يتم حصادها من البكتيريا المسببة للورم (Ti) الموجودة في التربة. البلازميد هو "النار"؟ في خلية ، حيث يلتصق البلازميد بسهولة بالحمض النووي للنبات. على الرغم من نجاحه في الفواكه والخضروات ، إلا أن Ti plasmid حقق نجاحًا محدودًا في محاصيل الحبوب.

أثبت إنتاج محصول مقاوم لمبيدات أعشاب معينة نجاحه لأن مبيد الأعشاب قضى على منافسة الحشائش من نبات المحصول. اكتشف الباحثون بكتيريا مقاومة لمبيدات الأعشاب ، وعزلوا الجينات المسؤولة عن هذه الحالة ، وأطلقوا النار؟ إلى نبات محصول ، والذي ثبت بعد ذلك أنه مقاوم لمبيدات الأعشاب. وبالمثل ، أصبحت النباتات المقاومة للحشرات متاحة حيث اكتشف الباحثون الإنزيمات البكتيرية التي تدمر أو تشل حركة الحيوانات العاشبة غير المرغوب فيها ، وأنزيمات أخرى تزيد من تثبيت النيتروجين في التربة لتستخدمه النباتات.

علماء الوراثة على وشك تحقيق اختراق زراعي كبير. تحتاج جميع النباتات إلى النيتروجين لتنمو. في الواقع ، يعتبر النيتروجين أحد أهم ثلاثة مغذيات يحتاجها النبات. على الرغم من أن الغلاف الجوي يحتوي على ما يقرب من 78 في المائة من النيتروجين ، إلا أنه في شكل لا يمكن للنباتات استخدامه. ومع ذلك ، يحدث بشكل طبيعي ريزوبيوم تم العثور على البكتيريا في التربة وتحويل النيتروجين في الغلاف الجوي إلى شكل يمكن استخدامه من قبل النباتات. توجد هذه البكتيريا المثبتة للنيتروجين بشكل طبيعي في البقوليات لبعض النباتات مثل فول الصويا والفول السوداني. نظرًا لاحتوائها على هذه البكتيريا غير المعتادة ، يمكن أن تنمو في التربة التي تفتقر إلى النيتروجين والتي تمنع نمو نباتات المحاصيل الأخرى. يأمل الباحثون أنه من خلال عزل هذه البكتيريا ، يمكنهم تحديد جزء الحمض النووي الذي يرمز لتثبيت النيتروجين ، وإزالة القطعة ، وإدخالها في الحمض النووي لمحصول نقدي مربح! عند القيام بذلك ، يمكن أن تعيش نباتات المحاصيل المعدلة وراثيًا في مناطق هامشية جديدة ، وهي مناطق غير مناسبة عادةً لنموها ، وتنمو في المواقع الحالية دون إضافة الأسمدة باهظة الثمن!

تربية الحيوان

لا يمكن لاستخدام لقاحات الحيوانات أو إضافة هرمونات نمو الأبقار إلى الأبقار لزيادة إنتاج الحليب بشكل كبير أن يضاهي الإثارة الحقيقية في تربية الحيوانات: الحيوانات المحورة وراثيًا والمستنسخات.

الحيوانات المعدلة وراثيا نموذج التقدم في تكنولوجيا الحمض النووي في تطورها. يمكن وصف آلية إنشاء واحدة في ثلاث خطوات:

  1. تتم إزالة خلايا البويضات السليمة من أنثى الحيوان المضيف وتخصيبها في المختبر.
  2. يتم تحديد الجين المطلوب من نوع آخر وعزله واستنساخه.
  3. يتم حقن الجينات المستنسخة مباشرة في البويضات ، ثم يتم زرعها جراحيًا في الأنثى المضيفة ، حيث يخضع الجنين لعملية نمو طبيعية.

من المأمول أن توفر هذه العملية وسيلة رخيصة وسريعة لتوليد الإنزيمات المرغوبة ، والبروتينات الأخرى ، وزيادة إنتاج اللحوم والصوف والمنتجات الحيوانية الأخرى من خلال وظائف طبيعية مشتركة.

منذ عام 1997 عندما تم استنساخ دوللي ، استمرت الأبحاث والتجريب لاستنساخ الماشية المفيدة دون توقف. جاذبية الاستنساخ هي معرفة أن النسل سيكون متطابقًا وراثيًا مع الوالد كما هو الحال في التكاثر اللاجنسي. أربع خطوات تصف العملية العامة:


ختاما

بصرف النظر عن طرق التسلسل المذكورة أعلاه ، يتوفر العديد مع تعديلات معينة في البروتوكولات ولكن نفس المبادئ الأساسية. مع التطبيقات الممكنة في كل مجال من مجالات علوم الحياة ، فإن تسلسل الجينوم له حقًا تأثير هائل على التكنولوجيا الحيوية الحديثة. أصبحت تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية على وجه الخصوص مفيدة للغاية في مجالات الدراسات البيولوجية الجزيئية. مع ظهور أساليب الجيل التالي ، أصبح التسلسل غير معقد من حيث العملية والبيانات والوقت والاقتصاد.


ربط الحمض النووي

يعد ربط الحمض النووي خطوة حاسمة في العديد من عمليات سير عمل البيولوجيا الجزيئية الحديثة. يتم تحفيز إنزيمات إغلاق النكات بين المخلفات المتجاورة لكسر أحادي الخيط على ركيزة مزدوجة الخيط وربط فواصل الخيط المزدوج. يتم تكوين رابطة فسفودايستر بين 3 'هيدروكسيل و 5' فوسفات من بقايا الحمض النووي المجاورة في ثلاث خطوات: في البداية ، يكون الليجاز متحدًا ذاتيًا عن طريق التفاعل مع ATP الحر. بعد ذلك ، يتم نقل مجموعة adenyl إلى الطرف 5'-phosphorylated من حبلا "المانح". أخيرًا ، يستمر تكوين رابطة phosphodiester بعد تفاعل الطرف المتبرع الغني مع متقبل الهيدروكسيل 3 المجاور وإطلاق AMP. في الكائنات الحية ، ligases DNA هي إنزيمات أساسية لها أدوار حاسمة في تكرار الحمض النووي وإصلاحه. في المختبر ، يتم إجراء ربط الحمض النووي لتطبيقات الاستنساخ وتطبيقات غير الاستنساخ.

إخلاص DNA Ligase: متى يهم؟

البوليمرات عالية الدقة موجودة في كل مكان و [مدش] ولكن لماذا تحتاج إلى لايجاز عالي الدقة؟ وماذا نعني حتى بـ & ldquofidelity & rdquo عندما نتحدث عن الربط؟ في هذه الندوة عبر الويب ، يناقش عالم NEB وخبير ligase Greg Lohman ربط عدم التطابق بواسطة ligases DNA وتطبيقات التشخيص الجزيئي التي تعتمد على استخدام ligases DNA عالية الدقة مثل NEB و rsquos HiFi طق DNA Ligase لاكتشاف الاختلافات الأساسية الفردية في الحمض النووي.

ربط الحمض النووي

تتم عملية الربط ، وهي عملية ضم أجزاء الحمض النووي مع ليجاس DNA ، في ثلاث خطوات. تعرف على المزيد حول وظيفة الربط من خلال الرسوم المتحركة التعليمية السريعة.

ما هي النسب المولية التي يجب أن أستخدمها لربط الحمض النووي؟

نسبة المادة المتفاعلة المثلى تتوقف على تطبيق المصب.

لماذا أحتاج إلى إضافة PEG إلى ربط الحمض النووي الخاص بي؟

يعد البولي إيثيلين جلايكول (PEG) كاشفًا مهمًا في تفاعلات الربط ، اكتشف السبب.

ما هي أفضل الشروط لربط الحمض النووي؟

اكتشف كيف يحدد تطبيق المصب أفضل شروط رد الفعل للربط.

هل بعض عمليات الربط أصعب من غيرها؟

يتطلب ربط النهايات غير الحادة والأطراف المتراكمة أحادية القاعدة ظروف تفاعل محسّنة.


تقنية الحمض النووي

أحدثت تكنولوجيا الحمض النووي ثورة في العلوم الحديثة. حمض الديوكسي ريبونوكلييك (DNA)، أو المواد الجينية للكائن الحي و mdashin الموروثة من جيل إلى آخر و [مدش] العديد من القرائن التي كشفت عن بعض الألغاز وراء الإنسان سلوك, مرض, تطوروالشيخوخة. نظرًا لأن التطورات التكنولوجية تؤدي إلى فهم أفضل للحمض النووي ، ستظهر تقنيات جديدة قائمة على الحمض النووي. التطورات الحديثة في تكنولوجيا الحمض النووي بما في ذلك الاستنساخ ، PCR, الحمض النووي معاد التركيب تقنية، بصمة الحمض النووي, العلاج الجينيوقد بدأت بالفعل تقنية ميكروأري للحمض النووي وتوصيف الحمض النووي في تشكيل الطب وعلوم الطب الشرعي والعلوم البيئية والأمن القومي.

في عام 1956 ، تم توضيح بنية وتكوين الحمض النووي وتأكيد الدراسات السابقة التي أجريت قبل أكثر من عقد من الزمان ، مما يدل على أن الحمض النووي هو المادة الجينية التي تنتقل من جيل إلى آخر. تم تطوير أداة جديدة تسمى PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل) بعد فترة وجيزة من كشف الحمض النووي. يمثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أحد أهم الاكتشافات أو الاختراعات في مجال تقنية الحمض النووي ، وقد أدى إلى الحصول على جائزة نوبل عام 1993 لصالح كاري موليس الأمريكي المولد (1949 & ndash).

PCR هو تضخيم تسلسل معين من الحمض النووي بحيث يمكن تحليله من قبل العلماء. التضخيم مهم ، لا سيما عندما يكون من الضروري تحليل تسلسل صغير من الحمض النووي بكميات كبيرة بما يكفي لإجراء تحليلات جزيئية أخرى مثل الحمض النووي التسلسل. لم يمض وقت طويل على تطوير تقنية PCR ، الهندسة الوراثية من الحمض النووي من خلال تقنية الحمض النووي المؤتلف سرعان ما أصبح ممكنًا. الحمض النووي المؤتلف هو DNA تم تغييره باستخدام إنزيمات مشتقة من البكتيريا تسمى نوكليازات تقييدية تعمل كمقص لقطع الحمض النووي. يمكن مطابقة النمط المقطوع مع نمط مقطوع بواسطة نفس الإنزيمات من تسلسل DNA مختلف. ترتبط الأطراف اللاصقة التي يتم إنشاؤها ببعضها البعض وبالتالي يمكن إدخال تسلسل DNA في تسلسل DNA آخر.

نوكليازات التقييد مهمة أيضًا في البصمات الوراثية. في هذه الحالة ، يمكن للإنزيمات التي تتعرف على تسلسلات معينة من الحمض النووي أن تنتج شظايا من الحمض النووي عن طريق قطع أجزاء مختلفة من خيط طويل من الحمض النووي. إذا كانت هناك اختلافات في التسلسل بسبب الاختلاف الموروث و mdash مما يعني أن هناك DNA إضافي أو تسلسل محدد تم تغييره بحيث لا تتعرف إنزيمات التقييد على الموقع ، فيمكن إنتاج أنماط متغيرة. إذا تم استخدام هذه الأنماط لمقارنة شخصين مختلفين ، فسيكون لهما نمط تجزيئي مختلف أو بصمة إصبع مختلفة. يمكن استخدام البصمات الجينية لاختبار الأبوة. في الطب الشرعي ، يمكن استخدام البصمات الجينية للتعرف على المجرمين بناءً على ما إذا كان تسلسل الحمض النووي الفريد الخاص بهم يتطابق مع الحمض النووي المستخرج من مسرح الجريمة. يمكن أن تسمح هذه التقنية أيضًا للباحثين بإنتاج خرائط جينية للكروموسومات بناءً على هذه القيود إنزيم بصمات الأصابع. نظرًا لوجود العديد من الإنزيمات المختلفة ، يمكن التحقق من بصمات الأصابع المختلفة.

يمكن أيضًا تطبيق تقنية الحمض النووي المؤتلف لتقسيم الجينات إلى أجهزة جزيئية يمكنها نقل هذه الجينات إلى وجهات خلوية مختلفة. هذه التقنية تسمى أيضًا الجين العلاج ، لتوصيل الجينات المصححة للأفراد الذين لديهم جينات معيبة تسبب المرض. انفصال جيني تم تطبيقه أيضًا على البيئة أيضًا. متنوع بكتيريا تم تعديلها وراثيا لإنتاج البروتينات التي تحلل الملوثات الكيميائية الضارة مثل دي دي تي. حاليًا ، يبحث العلماء في تطبيق هذه التقنية لإنتاج نباتات معدلة وراثيًا و المحاصيل يمكن أن تنتج مواد قاتلة الحشرات. بصورة مماثلة، الفاكهة يمكن هندستها للحصول على جينات تنتج البروتينات التي تبطئ عملية النضج في محاولة لإطالة عمرها الافتراضي.

تقنية DNA microarray ، المعروفة أيضًا باسم رقاقة DNA ، هي الأحدث في تكنولوجيا النانو التي تتيح للباحثين القدرة على دراسة الجينوم بطريقة إنتاجية عالية. يمكن استخدامه لتوصيف التعبير الجيني الذي يعطي العلماء نظرة ثاقبة حول الجينات التي يتم تنظيمها أو خفضها. يمكن تحديد الملامح الجينية المختلفة من أجل التقدير سرطان خطر أو لتحديد العلامات التي قد تترافق مع المرض. لديه القدرة فقط على اكتشاف التغييرات في التعبير الجيني التي تكون كبيرة بما يكفي لاكتشافها فوق مستوى خط الأساس. لذلك ، لا يكتشف التغييرات الطفيفة في التعبير الجيني التي قد تسبب المرض أو تلعب دورًا في تطور المرض. يمكن استخدامه أيضًا في التنميط الجيني ، على الرغم من أن التنميط الجيني للتشخيص السريري باستخدام تقنية ميكروأري لا يزال قيد التحقيق.

جينات أخرى محيط يمكن أيضًا استخدامها لإضافة سمات جديدة إلى معين الكائن الحي. على سبيل المثال ، البكتيريا ، الفئران، والنباتات جميعها ذات إضاءة مضيئة (ضوء متوهجة) من أسماك الهلام المضافة إلى جينوماتها. سبب آخر لإضافة الجينات إلى كائن غريب هو تصنيع منتجات غذائية أو صيدلانية مختلفة. تم تعديل بعض الأبقار حتى تتمكن من إنتاج الإنسان الأنسولين أو الفيتامينات الموجودة في الحليب بكميات كبيرة. الخنازير تم تعديلها للتغلب على عدد من مشاكل الزرع بحيث يمكن إجراء بعض عمليات زرع الأعضاء المحدودة من الخنازير إلى البشر ، وتسمى أيضًا نقل الأعضاء.

تعد تقنية الحمض النووي مجالًا جديدًا نسبيًا للبحث فيه جدل هائل. من المرجح أن يستمر في أن يكون جزءًا كبيرًا من النقاش العام ويكون له تأثير على كل جانب من جوانب التشخيص الطبي والعلاجات والطب الشرعي والتنميط الجيني.


2) العلاج الجيني

إذا ولد الطفل بعيب جيني ، فهل هناك طريقة لتصحيح هذا العيب؟ نعم ، هناك علاج جيني! العلاج الجيني هو تطبيق للتكنولوجيا الحيوية يتضمن مجموعة من الطرق التي يمكن أن تصحح عيبًا جينيًا في طفل أو جنين. يتضمن إدخال جين طبيعي في خلايا أو أنسجة الشخص للتعويض عن الجين غير الوظيفي. دعونا نفهم كيف يعمل هذا.

في عام 1990 ، تم تطبيق أول علاج جيني سريري لعلاج فتاة تبلغ من العمر 4 سنوات تعاني من نقص في إنزيم الأدينوزين ديميناز (ADA). يرجع هذا الاضطراب إلى نقص جين ADA ، وهو إنزيم مهم لوظيفة الجهاز المناعي. تساعد زراعة النخاع العظمي في علاج هذا الاضطراب في بعض الحالات. العلاج ببدائل الإنزيم ، والذي يتضمن حقن المريض بـ ADA الوظيفي ، يكون فعالًا أيضًا في بعض الحالات. ومع ذلك ، فإن كلا الإجراءين ليسا علاجيين تمامًا.

في العلاج الجيني ، تزرع الخلايا الليمفاوية في دم المريض في ثقافة خارج الجسم. في وقت لاحق ، يتم دمج ADA (كدنا) وظيفي في هذه الخلايا الليمفاوية وإعادة إدخالها في المريض. هذا يخفف من أعراض الاضطراب. ومع ذلك ، يحتاج المريض إلى دفعات دورية من هذه الخلايا الليمفاوية المعدلة وراثيًا ، لأن هذه الخلايا ليست خالدة. قد يكون العلاج الدائم لهذا هو إدخال الجين المنتج لـ ADA من خلايا نخاع العظم إلى الخلايا في المراحل الجنينية المبكرة من الحياة.


تطبيق علم الأحياء الجزيئي

تتمتع طرق البيولوجيا الجزيئية بقيمة هائلة ليس فقط في التحقيق في الأسئلة العلمية الأساسية ، ولكن أيضًا في التطبيق على مجموعة متنوعة من المشكلات التي تؤثر على الحالة البشرية العامة. إن الوقاية من الأمراض وعلاجها ، وتوليد منتجات بروتينية جديدة ، والتلاعب بالنباتات والحيوانات للحصول على الصفات المظهرية المرغوبة ، كلها تطبيقات يتم تناولها بشكل روتيني من خلال تطبيق طرق البيولوجيا الجزيئية. نظرًا لقابلية تطبيق هذه الأساليب على نطاق واسع ، فإنها تتحول بسرعة إلى جانب منتشر - قد يجادل البعض - في مجتمعنا القائم على التكنولوجيا. يجب معالجة الاهتمامات العامة التي تتناول تطبيق هذه الأساليب من خلال مناقشة عامة ونقاش مستنير. في حين أن العلماء قد ينتقدون بشدة جودة النتائج التجريبية وتفسيرها وأهميتها ، فإن لديهم ميلًا ملحوظًا إلى عدم إصدار الأحكام على المزايا الاجتماعية النسبية للعديد من تطبيقات البحث العلمي. تظل مسؤولية عامة أن تكون على دراية كافية لإجراء تقييم نقدي لمزايا أبحاث العلوم التطبيقية والمشاركة في عملية صنع القرار المجتمعية فيما يتعلق بمدى السماح للتكنولوجيا الجديدة بالتأثير على المجتمع.


استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين: الماضي والحاضر

يعد استخراج الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين الطريقة الأساسية المستخدمة في علم الأحياء الجزيئي. يمكن عزل هذه الجزيئات الحيوية عن أي مادة بيولوجية لعمليات لاحقة أو تحليلية أو تحضيرية. في الماضي ، كانت عملية استخراج الأحماض النووية وتنقيتها معقدة وتستغرق وقتًا طويلاً وتتطلب جهدًا كثيفًا ومحدودة من حيث الإنتاجية الإجمالية. يوجد حاليًا العديد من الطرق المتخصصة التي يمكن استخدامها لاستخراج الجزيئات الحيوية النقية ، مثل البروتوكولات القائمة على الحلول والبروتوكولات القائمة على الأعمدة. لقد قطعت الطريقة اليدوية شوطًا طويلاً بمرور الوقت مع العديد من العروض التجارية التي تضمنت مجموعات كاملة تحتوي على معظم المكونات اللازمة لعزل الحمض النووي ، ولكن معظمها يتطلب خطوات طرد مركزي متكررة ، تليها إزالة المواد الطافية اعتمادًا على نوع العينة و معالجة ميكانيكية إضافية. تزايد الطلب على الأنظمة الآلية المصممة للمختبرات المتوسطة والكبيرة خلال السنوات الأخيرة. إنه بديل للطرق اليدوية كثيفة العمالة. يجب أن تسمح التكنولوجيا بإنتاجية عالية للعينات ، يجب أن يكون إنتاج الجزيئات الحيوية ونقاوتها وإمكانية استنساخها وقابليتها للتوسع بالإضافة إلى سرعة ودقة وموثوقية الفحص إلى أقصى حد ، مع تقليل مخاطر التلوث المتبادل.

1. إدخال استخراج الجزيئات الحيوية

يعتبر استخلاص الجزيئات الحيوية والحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين من أهم الطرق المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية [1]. إنها نقطة البداية للعمليات النهائية وتطوير المنتجات بما في ذلك مجموعات التشخيص. يمكن عزل DNA و RNA والبروتين من أي مادة بيولوجية مثل الأنسجة الحية أو المحفوظة أو الخلايا أو جزيئات الفيروس أو عينات أخرى لأغراض التحليل أو التحضير [1].

تتضمن فئتان تشاركان في تنقية الحمض النووي عزل تراكيب الحمض النووي المؤتلف مثل البلازميدات أو العاثية وعزل الحمض النووي الصبغي أو الجينومي من الكائنات بدائية النواة أو حقيقية النواة [2]. بشكل عام ، تطلبت عملية تنقية الحمض النووي الناجحة أربع خطوات مهمة: التعطيل الفعال للخلايا أو تمسخ الأنسجة لمجمعات البروتين النووي تعطيل النوكلياز ، على سبيل المثال ، RNase لاستخراج الحمض النووي الريبي و DNase لاستخراج الحمض النووي بعيدًا عن التلوث [2]. يجب أن يكون الحمض النووي المستهدف خاليًا من الملوثات بما في ذلك البروتين أو الكربوهيدرات أو الدهون أو أي حمض نووي آخر ، مثل الحمض النووي الخالي من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي الخالي من الحمض النووي [3]. ستؤثر جودة وسلامة الحمض النووي المعزول بشكل مباشر على نتائج جميع الأبحاث العلمية الناجحة [4].

من ناحية أخرى ، فإن الحمض النووي الريبي هو جزيء غير مستقر وله نصف عمر قصير جدًا بمجرد استخلاصه من الخلية أو الأنسجة [5]. هناك عدة أنواع من RNA التي تحدث بشكل طبيعي بما في ذلك RNA الريبوسومي (rRNA) (80٪ -90٪) ، رسول RNA (مرنا) (2.5٪ -5٪) ونقل الحمض النووي الريبي (tRNA) [3]. مطلوب رعاية واحتياطات خاصة لعزل الحمض النووي الريبي لأنه عرضة للتدهور [3 ، 6]. الحمض النووي الريبي غير مستقر بشكل خاص بسبب الوجود في كل مكان لـ RNases وهي إنزيمات موجودة في الدم وجميع الأنسجة ، وكذلك معظم البكتيريا والفطريات في البيئة [3 ، 5]. لطالما استُخدمت المُمْكِنات القوية في عزل الحمض النووي الريبي السليم لتثبيط RNases الذاتية [2]. يعتمد استخراج الحمض النووي الريبي على تقنية معملية جيدة وتقنية خالية من الحمض النووي الريبي. RNAse مستقر للحرارة ويعاد تشكيله بعد تمسخ الحرارة. يصعب تعطيلها لأنها لا تتطلب عوامل مساعدة [2]. يمكن تقسيم طرق العزل الأكثر شيوعًا إلى فئتين: استخدام 4 M guanidinium thiocyanate واستخدام الفينول و SDS [2].

يعد تنقية البروتين أحد أهم الأجزاء في أبحاث البروتين لفهم وظيفتها ، حيث يمكن أن يشاركوا جزئيًا أو كليًا في أي نشاط لتخليق الحمض النووي. تنقية البروتين مطلوب لتحديد خصائصه الفريدة ، بما في ذلك الحجم والشحن والشكل والوظيفة [7]. الاستخراج المستند إلى الخلية هو الخطوة الأولى لتنقية البروتين بالكامل تقريبًا. يمكن استخلاص البروتين بعدة طرق مثل تحلل المنظفات ، وقوة القص ، والعلاج بملح أيوني منخفض (التمليح) ، والتغيرات السريعة في الضغط ، والتي تهدف إلى إضعاف وكسر الأغشية المحيطة بالخلية للسماح للبروتينات بالخروج. ]. يجب مراعاة بعض العوامل عند التعامل مع البروتينات. عادة ، يتم إجراء استخلاص البروتين في درجة حرارة منخفضة جدًا (

) حيث يتم تغيير طبيعة البروتينات بسهولة بمجرد إطلاقها من الخلايا. حالة العازلة هي أحد العوامل الرئيسية التي يجب أخذها في الاعتبار. يوصى بالحفاظ على ظروف عازلة محددة بسبب حساسية البروتينات تجاه التغيرات البيئية في درجة الحموضة [4]. سيؤثر نقاء الماء على محصول المنتجات النهائية حيث تحتوي المياه غير النقية على الكثير من الكائنات الحية الدقيقة أو البروتياز التي ستؤدي إلى تدهور البروتين [4]. مثبط البروتين ، الذي قد يوجد في المحلول أو المخازن المؤقتة ، يسبب تحلل البروتينات. المنظف ، عامل مهم آخر لا يمكن إهماله في تنقية البروتين ، يتكون من جزء كاره للماء من "ذيل" هيدروكربوني خطي أو متفرع و "رأس" محب للماء [4]. تقوم بإذابة بروتين الغشاء وهي جزيئات برمائية تشكل مذيلات مع رأس البروتينات المحبة للماء [4]. سيتم إضافة عوامل الاختزال إلى المحلول أو المخزن المؤقت لاستخراج البروتين وتنقيته لتجنب فقد نشاط البروتينات أو الإنزيمات التي تسببها الأكسدة. تخزين البروتينات مهم لأن نصف عمر البروتين يعتمد بشكل عام على درجة حرارة التخزين [4].

تتطلب تنقية البروتين مقايسة محددة. يجب أن تكون طريقة الفحص السريعة والسهلة معروفة لتنقية البروتين بحيث يمكن اكتشاف الوزن الجزيئي المعروف ، أو التقارب المحدد ، أو الانجذاب المناعي للبروتين غير الأنزيمي ذي الأهمية باستخدام الطريقة المناسبة [7]. هناك عدة طرق شائعة في تنقية البروتين. وهي كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وترشيح الهلام ، وكروماتوغرافيا التقارب ، والرحلان الكهربائي للهلام [4].

2. التاريخ

2.1. استخراج الحمض النووي

تم إجراء أول عزل للحمض النووي بواسطة الطبيب السويسري فريدريش ميشر في عام 1869 [8]. كان يأمل في حل المبادئ الأساسية للحياة ، لتحديد التركيب الكيميائي للخلايا. حاول عزل الخلايا من العقد الليمفاوية من أجل تجربته ولكن نقاء الخلايا الليمفاوية كان صعبًا ومن المستحيل الحصول عليها بكميات كافية. لذلك ، تحول إلى كريات الدم البيضاء ، حيث حصل عليها من القيح على الضمادات الجراحية التي تم جمعها.

في البداية ، ركز ميشر على الأنواع المختلفة من البروتين التي تتكون منها الكريات البيض وأظهر أن البروتينات هي المكونات الرئيسية للسيتوبلازم في الخلية. خلال اختباراته ، لاحظ أن مادة تترسب من المحلول عند إضافة الحمض وتذويبه مرة أخرى عند إضافة القلويات. كان هذا ، ولأول مرة يحصل على راسب خام من الحمض النووي.

لفصل الحمض النووي عن البروتينات في مستخلصات خليته ، طور ميشر بروتوكولًا جديدًا لفصل نوى الخلايا عن السيتوبلازم ثم عزل الحمض النووي. ومع ذلك ، فشل بروتوكوله الأول في إنتاج ما يكفي من المواد لمواصلة التحليل الإضافي. كان عليه أن يطور بروتوكولًا ثانيًا للحصول على كميات أكبر من النوكلين المنقى ، والذي تم تسميته لاحقًا باسم "الحمض النووي" من قبل تلميذه ريتشارد التمان [8].

2.2. استخراج البروتين

في القرن الثامن عشر ، عرف أنطوان فوركروي وآخرون البروتينات كفئة مميزة من الجزيئات البيولوجية. ميزوا هذا الجزيء من خلال قدرته على التخثر تحت المعالجة بالحرارة أو الحمض. ومع ذلك ، تم إجراء الوصف الأول للبروتين بواسطة الكيميائي الهولندي غيرهاردوس يوهانس مولدر في عام 1893 [9]. أظهرت دراساته حول تركيبة المواد الحيوانية ، وخاصة الفيبرين ، والألبومين ، والجيلاتين ، وجود الكربون ، والهيدروجين ، والأكسجين ، والنيتروجين [9]. علاوة على ذلك ، أدرك أن الكبريت والفوسفور كانا موجودين في بعض الأحيان في المواد الحيوانية التي تتكون من عدد كبير من الذرات وأثبت أن هذه "المواد" كانت جزيئات كبيرة [9].

ركزت معظم الدراسات المبكرة على البروتينات التي يمكن تنقيتها بكميات كبيرة. على سبيل المثال ، الدم ، بياض البيض والسموم المختلفة. يصعب تنقية معظم البروتينات بكميات تزيد عن ملليغرام حتى مع الأساليب المتقدمة للغاية اليوم. تم تطوير غالبية تقنيات تنقية البروتين في مشروع بقيادة إدوين جوزيف كوهن ، عالم البروتين ، خلال الحرب العالمية الثانية. كان مسؤولاً عن تنقية الدم ووضع تقنيات لعزل جزء الزلال من بلازما الدم ، وهو أمر مهم في الحفاظ على الضغط الاسموزي في الأوعية الدموية ، مما يساعد على بقاء الجندي على قيد الحياة [10].

3. الاتجاه الحالي

بعد الحدث المصيري حيث تمكنت ميشر من الحصول على الحمض النووي من الخلية ، اتبعت العديد من الآخرين حذوها مما أدى إلى مزيد من التقدم في بروتوكول عزل وتنقية الحمض النووي. تم تطوير الإجراءات المخبرية الروتينية الأولية لاستخراج الحمض النووي من استراتيجيات الطرد المركزي المتدرج الكثافة. استخدم ميسلسون وستال هذه الطريقة في عام 1958 لإثبات تكرار شبه محافظ للحمض النووي [3]. استفادت الإجراءات اللاحقة من الاختلافات في قابلية ذوبان الحمض النووي الصبغي الكبير والبلازميدات والبروتينات في المخزن القلوي [3].

يوجد حاليًا العديد من الطرق المتخصصة لاستخراج الحمض النووي النقي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين. بشكل عام ، يتم تقسيمها إلى بروتوكولات قائمة على الحلول أو بروتوكولات قائمة على الأعمدة. تم تطوير معظم هذه البروتوكولات إلى مجموعات تجارية تسهل عمليات استخراج الجزيئات الحيوية.

3.1. نوع استخراج الحمض النووي
3.1.1. المنهج التقليدي

استخراج غوانيدينيوم ثيوسيانات - فينول - كلوروفورم
الملح هو الشوائب الشائعة في عينات الحمض النووي. لقد كان مطلوبًا دائمًا إزالته من عينات الحمض النووي قبل إجراء أي عمليات وتحليلات لاحقة. لذلك ، هناك حاجة إلى خطوات فصل و / أو تنقية مفردة أو متعددة لتحلية العينة المشتملة على الحمض النووي [11]. تشمل الخطوات العامة لتنقية الحمض النووي تحلل الخلية ، الذي يعطل البنية الخلوية لإنشاء محلل ، وتعطيل نوكليازات خلوية مثل DNase و RNase ، وفصل الحمض النووي المطلوب عن حطام الخلية [2]. المذيب العضوي - استخلاص الفينول - الكلوروفورم هو أحد الأمثلة التي تستخدم على نطاق واسع في عزل الحمض النووي.
على الرغم من أن الفينول ، حمض الكربوليك القابل للاشتعال والتآكل والسام يمكن أن يفسد البروتينات بسرعة ، إلا أنه لا يثبط نشاط RNAse تمامًا [12]. يمكن حل هذه المشكلة باستخدام مزيج من الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1). تتم إزالة البروتينات ، والدهون ، والكربوهيدرات ، وحطام الخلايا من خلال استخلاص الطور المائي مع الخليط العضوي للفينول والكلوروفورم [12 ، 13]. يتكون مستحلب ثنائي الطور عند إضافة الفينول والكلوروفورم. بعد ذلك يتم ترسيخ الطبقة الكارهة للماء من المستحلب على القاع والطبقة المحبة للماء فوقها عن طريق الطرد المركزي [3]. يتم جمع الطور العلوي الذي يحتوي على الحمض النووي ويمكن ترسيب الحمض النووي من المادة الطافية عن طريق إضافة الإيثانول أو الأيزوبروبانول بنسب 2: 1 أو 1: 1 وتركيز عالٍ من الملح [3]. يتم جمع رواسب الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي ، ويتم شطف الملح الزائد بنسبة 70٪ من الإيثانول وطرده مركزيًا للتخلص من المادة الطافية للإيثانول. يتم بعد ذلك إذابة حبيبات الحمض النووي باستخدام محلول TE أو ماء مقطر معقم [3].
تم ذكر استخدام غوانيدينيوم أيزوثيوسيانات في استخراج الحمض النووي الريبي لأول مرة بواسطة Ulrich et al. (1977). كانت الطريقة شاقة. لذلك ، تم إزاحته عن طريق تقنية الخطوة الواحدة ، والتي تُعرف باسم استخراج Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ، بواسطة Chomczynski و Sacchi (1987) [12] ، حيث يتم استخلاص المتجانس مع الفينول / الكلوروفورم عند انخفاض درجة الحموضة. Guanidinium thiocyanate هو عامل Chaotropic يستخدم في تحلل البروتين. مبدأ هذه التقنية أحادية الخطوة هو فصل الحمض النووي الريبي عن الحمض النووي بعد الاستخلاص بمحلول حمضي يتكون من ثيوسيانات الغوانيدينيوم وخلات الصوديوم والفينول والكلوروفورم [13]. في الظروف الحمضية ، سيبقى إجمالي الحمض النووي الريبي في الطور المائي العلوي للخليط بأكمله ، بينما يظل الحمض النووي والبروتينات في الطور البيني أو الطور العضوي السفلي. ثم يتم استعادة إجمالي الحمض النووي الريبي عن طريق الترسيب باستخدام الأيزوبروبانول [12].

طريقة استخراج القلوية
تم استخدام التحلل القلوي لعزل البلازميد DNA و بكتريا قولونية [12]. يعمل بشكل جيد مع جميع سلالات بكتريا قولونية وتتراوح أحجام المزارع البكتيرية من 1 مل إلى أكثر من 500 مل في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). يعتمد مبدأ الطريقة على تمسخ قلوي انتقائي للحمض النووي الصبغي ذو الوزن الجزيئي المرتفع بينما يظل الحمض النووي الدائري المغلق تساهميًا مزدوج الشريطة [14]. البروتينات البكتيرية ، جدران الخلايا المكسورة ، والحمض النووي الكروموسومي المشوه متشابك في مجمعات كبيرة مغطاة بكبريتات دوديسيل. يمكن استعادة DNA البلازميد من المادة الطافية بعد إزالة المادة المشوهة بالطرد المركزي.

طريقة استخراج CTAB
بالنسبة لاستخراج النبات ، فإن الخطوة الأولى التي يجب القيام بها هي طحن العينة بعد تجميدها بالنيتروجين السائل. الغرض من القيام بهذه الخطوة هو تحطيم مادة جدار الخلية للعينة والسماح بالوصول إلى الحمض النووي بينما تظل الإنزيمات الخلوية والمواد الكيميائية الضارة معطلة. بعد طحن العينة ، يمكن إعادة تعليقها في مخزن مؤقت مناسب مثل CTAB.
بروميد سيتيل ترايميثيل الأمونيوم (CTAB) هو منظف غير أيوني يمكنه ترسيب الأحماض النووية والسكريات الحمضية من المحاليل منخفضة القوة الأيونية [15]. وفي الوقت نفسه ، تبقى البروتينات والسكريات المحايدة في محلول في ظل هذه الظروف. في المحاليل ذات القوة الأيونية العالية ، لن يترسب CTAB الأحماض النووية ويشكل مجمعات بالبروتينات.لذلك فإن CTAB مفيد في تنقية الحمض النووي من الكائنات الحية التي تنتج كميات كبيرة من السكريات مثل النباتات وبعض البكتيريا سالبة الجرام [15].
تستخدم هذه الطريقة أيضًا المذيبات العضوية وترسيب الكحول في خطوات لاحقة [12]. تتم إزالة الجسيمات غير القابلة للذوبان من خلال الطرد المركزي لتنقية الحمض النووي. يتم فصل البروتينات القابلة للذوبان والمواد الأخرى عن طريق الخلط مع الكلوروفورم والطرد المركزي. يجب ترسيب الحمض النووي بعد ذلك من المادة الطافية وغسلها جيدًا لإزالة الأملاح الملوثة. ثم يعاد تعليق الحمض النووي المنقى وتخزينه في محلول TE أو ماء مقطر معقم.

) التدرج الطرد المركزي
يعتبر الطرد المركزي المتدرج طريقة معقدة ومكلفة وتستغرق وقتًا طويلاً مقارنة ببروتوكولات التنقية الأخرى. يتطلب ثقافة بكتيرية واسعة النطاق. لذلك ، فهي غير مناسبة للإعداد المصغر للبلازميد DNA [4]. يمكن تركيز الأحماض النووية بالطرد المركزي في

التدرج بعد ترسيب الكحول وإعادة التعليق. الإقحام يغير كثافة السباحة للجزيء في الضرس العالي

سوف تتراكم الجزيئات الدائرية المغلقة تساهميًا عند كثافات منخفضة في التدرج لأنها تتضمن أقل لكل زوج أساسي مقارنة بالجزيئات الخطية. يتم بعد ذلك إزالة المادة الكارهة للماء بمذيبات مسعور مناسبة بعد الاستخلاص. سيتم إعادة ترسيب الحمض النووي المنقى بالكحول [1].

الحمض النووي الريبي بواسطة Oligp (dT) - كروماتوغرافيا السليلوز
بولي RNA هو قالب لترجمة البروتين وتحمل معظم جزيئات الرنا المرسال حقيقية النواة أجزاء منه في نهاياتها الثلاثة [4 ، 15]. يشكل 1 إلى 2 ٪ من إجمالي الحمض النووي الريبي ويمكن فصله عن طريق كروماتوغرافيا التقارب على السليلوز oligo (dT). تشكل ذيول Poly (A) هجينة RNA-DNA مستقرة مع سلاسل قصيرة من oligo (dT) التي ترتبط بمصفوفات الدعم المختلفة [4 ، 15]. يجب إضافة نسبة عالية من الملح إلى المخزن المؤقت للكروماتوغرافيا لتثبيت أزواج الحمض النووي المزدوجة حيث يتم تشكيل عدد قليل فقط من أزواج قاعدة dT-A. يتم استخدام عازلة منخفضة الملح بعد غسل RNAs nonpolyadenylated من المصفوفة. يساعد هذا المخزن المؤقت على زعزعة استقرار الهياكل المزدوجة الجديلة وإزالة الحمض النووي الريبي المتعدد من الراتينج [15].
هناك طريقتان تستخدمان بشكل شائع في اختيار Poly RNA - كروماتوغرافيا العمود على أعمدة oligo (dT) والكروماتوغرافيا الدفعية. يستخدم كروماتوغرافيا العمود عادة لتنقية الكميات الكبيرة (& gt25

ز) بولي غير مشع (A) + RNA معزول من خلايا الثدييات. اللوني الدفعي هو الطريقة المفضلة عند العمل بكميات صغيرة (& lt50 جم) من إجمالي الحمض النووي الريبي للثدييات. يمكن استخدامه عند معالجة العديد من عينات الحمض النووي الريبي ، سواء كانت مشعة أم لا. يتم إجراء الفصل الكروماتوغرافي الدفعي بدرجة جيدة من السليلوز الأوليجو (dT) في درجات الحرارة المثلى للربط والشطف [15].

3.1.2. استخراج الأحماض النووية ذات المرحلة الصلبة

يمكن العثور على تنقية الحمض النووي في المرحلة الصلبة في معظم مجموعات الاستخراج التجارية المتوفرة في السوق. يسمح بتنقية سريعة وفعالة مقارنة بالطرق التقليدية [16]. يمكن منع العديد من المشكلات المرتبطة باستخراج السائل عن السائل مثل فصل الطور غير المكتمل. سوف يمتص نظام المرحلة الصلبة الحمض النووي في عملية الاستخراج اعتمادًا على درجة الحموضة ومحتوى الملح في المخزن المؤقت. تعتمد عملية الامتصاص على المبادئ التالية: التفاعل المرتبط بالهيدروجين مع مصفوفة محبة للماء تحت ظروف تشوتروبيك ، والتبادل الأيوني في ظل الظروف المائية عن طريق مبادل الأنيون ، وآليات استبعاد التقارب والحجم.

عادة ما يتم إجراء تنقية الطور الصلب باستخدام عمود دوران ، يعمل تحت قوة الطرد المركزي [17]. يمكن لهذه الطريقة تنقية الحمض النووي بسرعة مقارنة بالطرق التقليدية. تعتبر مصفوفات السيليكا ، والجسيمات الزجاجية ، والتراب الدياتومي ، وناقلات تبادل الأنيون من الأمثلة التي تم استخدامها في طريقة استخلاص الطور الصلب كدعم صلب. أربع خطوات رئيسية متضمنة في استخلاص المرحلة الصلبة هي تحلل الخلايا ، وامتصاص الأحماض النووية ، والغسيل ، والشطف [6].

تتمثل الخطوة الأولى في عملية استخراج المرحلة الصلبة في تهيئة العمود لامتصاص العينة. يمكن إجراء تكييف العمود باستخدام عازلة عند درجة حموضة معينة لتحويل السطح أو المجموعات الوظيفية على المادة الصلبة إلى شكل كيميائي معين. [17]. بعد ذلك ، يتم تطبيق العينة التي تدهورت باستخدام المخزن المؤقت للتحلل على العمود. سوف يمتص الحمض النووي المطلوب إلى العمود بمساعدة درجة الحموضة العالية وتركيز الملح لمحلول الربط [17]. قد يكون للمركبات الأخرى ، مثل البروتين ، روابط محددة قوية مع سطح العمود أيضًا. يمكن إزالة هذه الملوثات في خطوة الغسيل باستخدام محلول غسيل يحتوي على عامل منافس [17]. لخطوة الشطف ، يتم إدخال محلول TE أو الماء لتحرير الحمض النووي المطلوب من العمود ، بحيث يمكن جمعه في حالة تنقية [17]. عادةً ما يكون الطرد المركزي السريع أو الترشيح الفراغي أو فصل العمود مطلوبًا أثناء خطوات الغسيل والشطف لعملية التنقية.

تم الكشف عن استخلاص الحمض النووي ذو الطبقة الصلبة المختلطة واستخدامه في عزل الحمض النووي [18]. الأطوار الصلبة ذات الطبقة المختلطة لهذا الاختراع هي مخاليط من طورين صلبين مختلفين على الأقل ، يمكن أن تكون صلبة أو شبه صلبة ، مسامية أو غير مسامية. يمكن أن ترتبط كل مرحلة صلبة بالحمض النووي المستهدف تحت ظروف محلول مختلفة وتحرر الحمض النووي في ظل ظروف شطف مماثلة [18].

مصفوفات السيليكا
أساس معظم المنتجات المتعلقة بتنقية الحمض النووي هو الخصائص الفريدة لمصفوفات السيليكا لربط الحمض النووي الانتقائي. أنواع مواد السيليكا بما في ذلك جزيئات الزجاج ، مثل مسحوق الزجاج وجزيئات السيليكا والألياف الزجاجية الدقيقة المحضرة بطحن أوراق الترشيح المصنوعة من الألياف الزجاجية ، بما في ذلك التراب الدياتومي [19]. تم إدخال مصفوفة السيليكا المائية ، التي تم تحضيرها عن طريق إعادة تدفق ثاني أكسيد السيليكون في هيدروكسيد الصوديوم أو هيدروكسيد البوتاسيوم بنسبة مولارية تبلغ حوالي 2: 1 إلى 10: 1 لمدة 48 ساعة على الأقل ، في تنقية الحمض النووي. يرتبط الحمض النووي بالمصفوفة غير العضوية ويتم إطلاقه في الماء الساخن [20].
يعتمد مبدأ تنقية مصفوفات السيليكا على التقارب العالي للعمود الفقري للحمض النووي المشحون سالبًا تجاه جسيمات السيليكا موجبة الشحنة [21]. يلعب الصوديوم دورًا كجسر الكاتيون الذي يجذب الأكسجين سالب الشحنة في العمود الفقري للفوسفات في الحمض النووي [22]. تكسر كاتيونات الصوديوم الروابط الهيدروجينية بين الهيدروجين في الماء وأيونات الأكسجين سالبة الشحنة في السيليكا تحت ظروف الملح العالية (درجة الحموضة ≤7) [22]. الحمض النووي مرتبط بإحكام ، والغسيل الشامل يزيل كل التلوث. يمكن التخلص من جزيئات الحمض النووي المنقى تحت قوة أيونية منخفضة (pH 7) لاحقًا باستخدام محلول TE أو الماء المقطر [21].
إلى جانب مصفوفات السيليكا ، من المعروف أيضًا أن أغشية النيتروسليلوز والبولي أميد مثل مصفوفات النايلون ترتبط بالأحماض النووية ، ولكن بخصوصية أقل. غالبًا ما تستخدم هذه المواد كمصفوفات نقل وتهجين للحمض النووي في المرحلة الصلبة [23]. تعتبر مصفوفات البولي أميد أكثر متانة من النيتروسليلوز ومن المعروف أنها تربط الأحماض النووية بشكل لا رجعة فيه. يمكن تجميد الأحماض النووية على مصفوفات البولي أميد في عازلة منخفضة القوة الأيونية [23].

جسيمات الزجاج
جزيئات الزجاج والمسحوق والخرز مفيدة لتنقية الحمض النووي. على سبيل المثال ، تضمن عزل الحمض النووي من المواد الهلامية agarose استخدام أملاح Chaotropic لتسهيل ربط الحمض النووي بزجاج السيليكات المشترك وزجاج الصوان وزجاج البورسليكات (مرشح الألياف الزجاجية). يحدث امتزاز الحمض النووي على الركيزة الزجاجية على الأرجح بناءً على الآلية والمبدأ الذي يشبه كروماتوغرافيا الامتزاز [24]. يمكن أيضًا إجراء تنقية الحمض النووي على هلام السيليكا ومزيج الزجاج [19]. اكتشف هذا الاختراع أنه يمكن استخدام خليط من هلام السيليكا وجزيئات الزجاج لفصل الحمض النووي عن المواد الأخرى في وجود محلول أملاح تشوتروبيك.

الأرض دياتومي
يحتوي التراب الدياتومي ، المعروف أيضًا باسم kieselguhr أو diatomite ، على نسبة عالية من السيليكا تصل إلى 94٪ [25]. لقد تم استخدامه للترشيح وفي الفصل اللوني وهو مفيد لتنقية البلازميد والحمض النووي الآخر عن طريق تثبيت الحمض النووي على جزيئاته في وجود عامل شوتروبي. يتم بعد ذلك غسل الحمض النووي الدياتومي الناتج عن الأرض باستخدام محلول عازل يحتوي على الكحول. ثم يتم التخلص من المخزن الذي يحتوي على الكحول ويتم التخلص من الحمض النووي في محلول قليل الملح أو في الماء المقطر [25].

تنقية الحمض النووي على أساس حبة مغناطيسية
الفصل المغناطيسي هو طريقة بسيطة وفعالة تستخدم في تنقية الحمض النووي في الوقت الحاضر. العديد من الحاملات المغناطيسية متاحة الآن تجارياً. يمكن إزالة الجسيمات التي تحتوي على شحنة مغناطيسية باستخدام مغناطيس دائم في تطبيق مجال مغناطيسي. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام ناقلات مغناطيسية مع روابط تقارب ثابتة أو محضرة من البوليمر الحيوي الذي يظهر تقاربًا مع الحمض النووي المستهدف لعملية العزل. على سبيل المثال ، الجسيمات المغناطيسية التي يتم إنتاجها من بوليمرات اصطناعية مختلفة أو بوليمرات حيوية أو زجاج مسامي أو جسيمات مغناطيسية تعتمد على مواد مغناطيسية غير عضوية مثل أكسيد الحديد المعدل على السطح. يفضل استخدام المواد ذات المساحة السطحية الكبيرة في ربط الأحماض النووية. يُفضل أن تكون المواد الجسيمية المغناطيسية مثل الخرز داعمًا في عملية العزل نظرًا لقدرتها الكبيرة على الارتباط. قد يتم مساعدة عملية ربط الحمض النووي عن طريق "التفاف" الحمض النووي حول الدعامة. يمكن وضع مغناطيس على جانب الوعاء الذي يحتوي على خليط العينة لتجميع الجزيئات بالقرب من جدار الوعاء وسكب باقي العينة بعيدًا [26].
يتم استخدام الجسيمات ذات الخصائص المغناطيسية أو البارامغناطيسية في اختراع حيث يتم تغليفها في بوليمر مثل السليلوز الممغنط [27]. في وجود تركيزات معينة من الملح والبولي ألكلين جلايكول ، يمكن أن يرتبط السليلوز الممغنط بالأحماض النووية. يتطلب الحمض النووي الصغير تركيزات ملح أعلى للارتباط القوي بجزيئات السليلوز الممغنطة. لذلك ، يمكن معالجة تركيز الملح بشكل انتقائي لإطلاق الحمض النووي المرتبط بالسليلوز الممغنط على أساس الحجم. سيتم غسل السليلوز الممغنط المرتبط بالحمض النووي باستخدام محلول غسيل مناسب قبل أن يتم ملامسته مع محلول شطف مناسب لفصل الحمض النووي المطلوب مع السليلوز. يمكن فصل السليلوز الممغنط عن المادة الطافية خلال جميع خطوات التنقية عن طريق تطبيق مجال مغناطيسي لسحبها أو سحبها إلى جانب الوعاء [27]. يحتوي السليلوز الممغنط المستخدم في هذا الاختراع على محتوى من أكسيد الحديد يصل إلى حوالي 90٪ بالوزن من إجمالي كتلة السليلوز. يمكن أيضًا استبدال المكون المغناطيسي للسليلوز بمركبات مغناطيسية أخرى مثل أكسيد الحديدوز أو أكسيد النيكل [27].
تتوفر مجموعة استخراج تعتمد على مبدأ تنقية الحمض النووي باستخدام حبة مغناطيسية متاحة تجارياً في السوق [28]. الجزء الخاص من هذه المجموعة هو أن الكواشف المتوفرة مخصصة للاستخدام مع الأدوات المغناطيسية. يوصى باستخدام هذه الأداة المغناطيسية في حالة العمل بتنسيق أنبوب دقيق. إنه جهاز عملي لإجراء عمليات الفصل بناءً على تقنية الجسيمات المغناطيسية. لا تتطلب المجموعة أي مذيبات عضوية وتلغي الحاجة إلى الطرد المركزي المتكرر أو الترشيح بالفراغ أو فصل العمود. يعتمد البروتوكول على إجراء تحلل قلوي معدل متبوعًا بربط الحمض النووي بالجسيمات المغناطيسية. تُستخدم الأداة المغناطيسية لالتقاط الجسيمات المغناطيسية بالحمض النووي المرتبط وتتم إزالة الملوثات عن طريق الغسل باستخدام محلول الغسيل المزود. ثم يُستخرج الحمض النووي من الجسيمات المغناطيسية باستخدام محلول الشطف [28].
مجموعة استخراج أخرى لها نفس مبدأ الاستخراج الموصوف أعلاه ، والذي يستخدم تقنية الجسيمات المغناطيسية لتنقية الحمض النووي [29]. فهو يجمع بين سرعة وكفاءة تنقية الحمض النووي القائم على السيليكا والتعامل المريح مع الجسيمات المغناطيسية. يتم استخدام قضيب مغناطيسي محمي بغطاء قضيب لالتقاط الجسيمات المغناطيسية. يدخل إلى وعاء يحتوي على العينات ويجذب الجسيمات المغناطيسية. بعد ذلك ، يتم وضع غطاء القضيب المغناطيسي فوق وعاء آخر ويتم إطلاق الجسيمات المغناطيسية [29].
تنقية الحمض النووي باستخدام حبة الزركونيا هو نوع آخر من التنقية القائمة على الخرزة المغناطيسية. هذه الحبيبات المغنطيسية المجهرية لها سطح ربط كبير متاح ويمكن تشتيتها في المحلول. سمحت هذه الخاصية بربط الحمض النووي وغسله وشطفه. تستخدم مجموعة عزل الحمض النووي الكلي ، التي تستخدم هذه التقنية لتنقية الحمض النووي ، التعطيل الميكانيكي للعينات مع حبيبات الزركونيا في محلول يعتمد على ثيوسيانات الغوانيدينيوم الذي لا يطلق الحمض النووي فحسب ، بل يعطل أيضًا نوكلياز في مصفوفة العينة [ 30]. بعد خطوة التحلل ، يتم تخفيف العينات باستخدام الأيزوبروبانول. تضاف الحبيبات الباراماجينية إلى العينات لغرض ربط الحمض النووي. يتم تجميد خليط الحبيبات والحمض النووي على مغناطيس وغسله لإزالة البروتين والملوثات. تتم إزالة محلول الربط المتبقي بمحلول غسيل ثانٍ وأخيراً يتم التخلص من الحمض النووي في محلول منخفض الملح [30].
تم استخدام تقنية الحبيبات الباراماجينية القابلة للانعكاس في المرحلة الصلبة لنظام تنقية PCR لتقديم DNA عالي الجودة. يتطلب بروتوكول بسيط بدون الطرد المركزي والترشيح. ترتبط أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالجسيمات الباراماجينية التي تسحبها من المحلول ، مما يسمح بشطف الملوثات مثل dNTPs والبادئات والأملاح [31].
حبة القلة المغناطيسية (dT) هي بديل لمصفوفات oligo (dT) الأخرى لتنقية بولي RNA من إجمالي عينة الحمض النووي الريبي [4]. يمكن استخلاص بولي RNA عن طريق إدخال حبات مغناطيسية مطلية بالقليل (dT). الحمض النووي الريبي مع ذيل بولي- A يعلق على القلة (dT). سيتم بعد ذلك سحب الخرزات إلى قاع الأنبوب الذي يزيل الرنا المرسال مباشرةً من إجمالي الحمض النووي الريبي. الحبيبات المغناطيسية التي تمت معالجتها بشكل خاص تقلل من الارتباط غير المحدد للأحماض النووية الأخرى وتضمن نقاء الرنا المرسال [32].

أنيون تبادل المواد
راتنج التبادل الأنيون هو أحد الأمثلة الشائعة التي استخدمت مبدأ تبادل الأنيون [33]. يعتمد على التفاعل بين مجموعات ثنائي إيثيل أمين إيثيل السليلوز موجب الشحنة (DEAE) على سطح الراتنج والفوسفات سالب الشحنة في العمود الفقري للحمض النووي. يتكون راتينج تبادل الأنيون من حبيبات سيليكا محددة ذات حجم مسام كبير ، وطلاء سطح محب للماء وله كثافة شحنة عالية [34]. تسمح مساحة السطح الكبيرة للراتنج بالاقتران الكثيف لمجموعات DEAE. يعمل الراتينج على نطاق واسع من ظروف الأس الهيدروجيني (الأس الهيدروجيني 6-9) و / أو تركيز الملح (0.1-1.6 م) والذي يمكن أن يحسن فصل الحمض النووي عن الحمض النووي الريبي والشوائب الأخرى [34]. لذلك ، فإن تركيز الملح وظروف الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة هي أحد العوامل الرئيسية التي تحدد ما إذا كان الحمض النووي مرتبطًا أو مزالً من العمود. يمكن أن يرتبط الحمض النووي بمجموعة DEAE على مدى واسع من تركيز الملح. يتم غسل الشوائب مثل البروتين والحمض النووي الريبي من الراتينج باستخدام مخازن متوسطة الملح ، بينما يظل الحمض النووي مرتبطًا حتى يتم التخلص منه بمحلول عازل عالي الملح [34].
تم الكشف عن طريقة استخدام مواد تبادل الأنيون لعزل الحمض النووي في الاختراع [35] ، حيث تم استخدام مواد مبادل الأنيون القوية أو الضعيفة الشحنة الموجبة المتوفرة تجارياً مع محاليل مختارة ذات قوة أيونية معروفة للامتصاص والشطف. يمكن غسل معظم المكونات القابلة للذوبان في الماء مثل البروتين من خلال العمود عن طريق استخدام محلول ذو قوة أيونية معروفة لربط الأحماض النووية بمواد عمود التبادل الأنيوني. يتم إنشاء القوة الأيونية للشطف باستخدام تركيز الملح المعروف ، والذي يتم مزجه مع محلول منظم للتحكم في قوة الأس الهيدروجيني ، وهو ما يتوافق بشكل مثالي مع أدنى قوة أيونية يتم فيها التخلص من الأحماض النووية تمامًا [35].

3.2 نوع طريقة استخلاص البروتين

الخطوة الأولى في تنقية البروتين هي تحلل الخلايا. من أجل تنقية البروتين وتحليله بكفاءة ، يجب أولاً إطلاقه من الخلية المضيفة في شكل قابل للذوبان. من السهل تعطيل الغشاء البلازمي لخلايا الثدييات المكون من الدهون الفسفورية والبروتينات [36]. بالمقارنة ، يبدو استخراج البروتين من الفطريات والبكتيريا أكثر صعوبة بسبب جدار الخلية المستقر الأقوى من غشاء البلازما.

تحتوي الأنسجة النباتية على مجموعة واسعة من البروتينات التي تختلف في خصائصها. يجب أن تؤخذ بعض العوامل المحددة في الاعتبار عند تطوير بروتوكول استخراج البروتين للنبات [37]. على سبيل المثال ، يجب قص وجود جدار خلية سليلوز صلب من أجل تحرير محتويات الخلية. قد تؤدي المركبات الملوثة المحددة مثل الفينولات ومجموعة من البروتينات إلى تدهور البروتين أو تعديله. لذلك ، هناك حاجة لشروط محددة لاستخراج البروتين وتنقيته من النبات [38].

تُستخدم تقنيات التعطيل الميكانيكي ، مثل الصحافة الفرنسية أو الخرز الزجاجي لإزالة جدار الخلية ، متبوعًا باستخلاص البروتين الكلي باستخدام المنظفات [39].

3.2.1. كروماتوغرافيا التبادل الأيوني

تفصل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني البروتينات بناءً على شحنتها الأيونية السطحية باستخدام الراتنج الذي تم تعديله إما بمجموعات كيميائية موجبة الشحنة أو سالبة الشحنة [4 ، 7]. تحتوي معظم البروتينات على شحنة موجبة أو سالبة إجمالية اعتمادًا على نقطة تساوي الكهرباء (pI) عند درجة حموضة معينة ، مما يجعلها ممكنة للتفاعل مع مصفوفة كروماتوغرافية مشحونة معاكسة [7]. إذا كانت الشحنة الصافية للبروتين موجبة عند درجة حموضة أقل من قيمة pI ، سيرتبط البروتين بمبادل كاتيون عند درجة حموضة أعلى من قيمة pI ، فإن صافي شحنة البروتين سالب وسيرتبط البروتين بمبادل الأنيون [38 ].

البروتينات التي تتفاعل بشكل ضعيف مع الراتنجات ، على سبيل المثال بروتين ضعيف موجب الشحنة يمر فوق الراتنج المعدل بمجموعة سالبة الشحنة ، يتم التخلص منها في مخزن مؤقت منخفض الملح. من ناحية أخرى ، فإن البروتينات التي تتفاعل بقوة تتطلب مزيدًا من الملح ليتم التخلص منها. يمكن فصل البروتينات ذات خصائص الشحن المتشابهة جدًا إلى أجزاء مختلفة حيث يتم استخلاصها من العمود عن طريق زيادة تركيز الملح في محلول الشطف [7].

عمود التبادل الأيوني هو أحد التقنيات التي استخدمت مبدأ كروماتوغرافيا التبادل الأيوني [33]. يستخدم تقنية امتصاص الغشاء كمصفوفة كروماتوغرافية لفصل البروتينات.المواد الماصة للأغشية الموجودة في الأعمدة هي مادة سليلوز مستقرة ذات هيكل مسامي للغاية يوفر وصول البروتينات إلى السطح المشحون بسهولة. حدثت التفاعلات بين الجزيئات والمواقع النشطة على الغشاء في الحمل الحراري عبر المسام. لذلك ، فإن الأغشية الممتصة لديها القدرة على الحفاظ على كفاءة عالية عند تنقية الجزيئات الحيوية الكبيرة مع انتشار منخفض [33].

3.2.2. كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي

كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، والتي تسمى أيضًا كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو كروماتوغرافيا الهلام ، تفصل البروتينات وفقًا للأحجام الجزيئية والشكل ولا ترتبط الجزيئات بالوسط الكروماتوغرافي [39]. إنها عملية تمر فيها الجزيئات الكبيرة عبر العمود بشكل أسرع من الجزيئات الصغيرة. يمكن للجزيئات الصغيرة أن تدخل جميع الثقوب الصغيرة للمصفوفة وتصل إلى المزيد من العمود. ستمر البروتينات صغيرة الحجم عبر تلك الثقوب وتستغرق وقتًا أطول لتنفد من العمود مقارنة بالبروتينات كبيرة الحجم التي لا يمكنها الوصول إلى تلك الثقوب ولكنها تنفد مباشرةً من العمود عبر الفراغ في العمود [4 ، 7].

يطبق طقم الكروماتوغرافيا بالترشيح الهلامي مبدأ كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي [40]. يتم تطبيق العينة المستهدفة أعلى العمود الذي يحتوي على خرز مسامي ، مثال على مصفوفة في العمود. تنفصل الجزيئات عندما تمر الجزيئات عبر عمود الخرز المسامي. يمكن تقسيم فصل الجزيئات إلى ثلاثة أنواع رئيسية: الاستبعاد الكلي ، والتغلغل الانتقائي ، وحد التخلل الكلي. الاستبعاد التام هو الجزء الذي لا تستطيع الجزيئات الكبيرة دخول المسام والتخلص منه بسرعة. بالنسبة لمنطقة التخلل الانتقائي ، قد تدخل الجزيئات الوسيطة المسام وقد يكون لها متوسط ​​وقت مكوث في الجسيمات اعتمادًا على حجمها وشكلها. بالنسبة لحد التخلل الكلي ، تتمتع الجزيئات الصغيرة بأطول مدة بقاء بمجرد دخولها المسام في العمود [40]. من مزايا الكروماتوغرافيا المعتمدة على ترشيح الهلام أنها مناسبة للجزيئات الحيوية التي قد تكون حساسة لتغيرات الأس الهيدروجيني وتركيز أيونات المعادن والظروف البيئية القاسية [39].

3.2.3. اللوني تقارب

يعتمد كروماتوغرافيا التقارب على تفاعل محدد بين البروتين والمرحلة الصلبة للتأثير على الانفصال عن الملوثات. وهو يتألف من نفس خطوات كروماتوغرافيا التبادل الأيوني [38]. تمكن من تنقية البروتين على أساس وظيفته البيولوجية أو التركيب الكيميائي الفردي [41]. البروتينات التي لها صلة كبيرة بمجموعات كيميائية معينة مثل الروابط سوف تلتصق تساهميًا وترتبط بمصفوفة العمود بينما تمر البروتينات الأخرى عبر العمود [38]. التفاعلات الكهروستاتيكية أو الكارهة للماء وقوى فان دير فال والرابط الهيدروجينى هي التفاعلات البيولوجية بين الروابط والبروتينات المستهدفة [41]. سيتم التخلص من البروتينات المرتبطة من العمود بواسطة محلول يحتوي على تركيز عالٍ من الشكل القابل للذوبان من الليجند [36].

يُعد الرابط الترابطي المحدد حيويًا والذي يمكن أن يرتبط بمصفوفة كروماتوغرافيا تساهميًا أحد متطلبات تنقية التقارب الناجحة. يجب أن يكون الارتباط بين الليجند وجزيئات البروتين المستهدفة قابلاً للانعكاس للسماح بإزالة البروتينات في شكل نشط [41]. بعد غسل الملوثات ، يجب أن يحتفظ الترابط المقترن بألفة ارتباط محددة للبروتينات المستهدفة. بعض الأمثلة على التفاعلات البيولوجية التي تستخدم عادة في كروماتوغرافيا التقارب مذكورة في الجدول 1 (انظر [41]).

يعتبر الفصل الكروماتوغرافي عن طريق التقارب التفاضلي مع الروابط المثبتة على راتينج مسامي مطرز أمرًا أساسيًا لأبحاث البروتين [42]. تم تقديم مجموعة كاملة تحتوي على أعمدة راتنج متقارب مخرز على أساس مبدأ كروماتوغرافيا التقارب إلى السوق [42]. يمكن استخدام راتينج التقارب في شكل عمود دوران على شكل دفعات أو جهاز طرد مركزي وفقًا لمقياس ونوع التجربة التي سيتم تنفيذها. علاوة على ذلك ، يمكن تعبئتها في نوع من عمود تدفق الجاذبية الأكبر أيضًا [42].

3.2.4. هلام الكهربائي

الرحلان الكهربائي للهلام هو طريقة لفصل البروتين وفقًا لحجمه وخصائص شحنته. يمكن تنقية البروتين المنقى جزئيًا من الفصل الكروماتوجرافي بشكل إضافي باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد غير المشبع (PAGE) ، أو الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي [4]. في PAGE ، يتم تحريك البروتينات بواسطة تيار مطبق من خلال مصفوفة هلامية [43]. تعتمد حركة البروتين عبر هذا الهلام على كثافة الشحنة (الشحنة لكل وحدة كتلة) للجزيئات. تهاجر الجزيئات ذات الشحنة عالية الكثافة بسرعة. حجم وشكل البروتين عاملان مهمان آخران يؤثران على تجزئة الصفحة [43]. يلعب حجم مسام الأكريلاميد دورًا كمنخل جزيئي لفصل أحجام مختلفة من البروتينات [4]. كلما زاد حجم البروتين ، كلما كان هجرته أبطأ حيث يصبح أكثر تشابكًا في الهلام [43]. الشكل هو أيضًا أحد العوامل لأن البروتينات الكروية المدمجة تتحرك أسرع من البروتينات الليفية الممدودة ذات الكتلة الجزيئية المماثلة [43].

يتم تنفيذ PAGE عادة في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) [44]. عادةً ما يقضي البروتين المعالج بـ SDS على البنية الثانوية والثالثية والرباعية للبروتين [4 ، 7]. تتكشف البروتينات في شكل مشابه للقضيب بسبب التنافر الكهروستاتيكي بين جزيئات SDS المرتبطة. يتناسب عدد جزيئات SDS التي ترتبط بالبروتين تقريبًا مع الكتلة الجزيئية للبروتين (حوالي 1.4 جم بروتين SDS / جم) [43]. كل نوع من أنواع البروتين له كثافة شحنة مكافئة ويتم دفعه من خلال الهلام بنفس القوة [43]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لـ PAGE تقليل تمسخ البروتينات. لا تزال العديد من البروتينات تحتفظ بأنشطتها البيولوجية بعد تشغيل PAGE [7]. ومع ذلك ، يتم الاحتفاظ بالبروتينات الأكبر بدرجة أكبر من البروتينات الأصغر لأن بولي أكريلاميد شديد الارتباط [43]. وبالتالي ، يتم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE على أساس كتلتها الجزيئية. يمكن استخدام SDS-PAGE لتحديد الكتلة الجزيئية لخليط البروتينات من خلال مقارنة مواضع العصابات بتلك التي تنتجها بروتينات ذات حجم معروف [43]. يستخدم SDS في الرحلان الكهربائي لحل خليط البروتينات وفقًا لطول سلاسل البولي ببتيد الفردية [7].

تم تطوير تقنية تسمى الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد من قبل باتريك أوفاريل في عام 1975. وهي تستخدم لتجزئة خليط معقدة من البروتينات باستخدام طريقتين مختلفتين - التركيز الكهربي المتساوي و SDS-PAGE [43]. أولاً ، يتم فصل البروتينات وفقًا لنقطة تساوي الكهرباء في هلام أنبوبي. بعد هذا الفصل ، تتم إزالة الجل ووضعه فوق لوح من البولي أكريلاميد المشبع بـ SDS. تنتقل البروتينات إلى هلام اللوح ويتم فصلها وفقًا لكتلتها الجزيئية [43]. يعتبر الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد مناسبًا لاكتشاف التغيرات في البروتينات الموجودة في الخلية في ظل ظروف مختلفة ، أو في مراحل مختلفة من التطور أو دورة الخلية ، أو في الكائنات الحية المختلفة [43].

3.2.5. النشاف الجنوبي الغربي (التجلط المناعي)

النشاف الجنوبي الغربي هو طريقة تُستخدم لعزل وتحديد وتوصيف البروتينات المرتبطة بالحمض النووي من خلال قدرتها على الارتباط بمسبار معين قليل النوكليوتيد [44 ، 45]. يجب عزل العديد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي في الخلية بشكل فردي وتمييزها لتحديد وظيفة الجين [44]. يتم تضمين ثلاث خطوات في هذه الطريقة. أولاً ، يتم فصل مستخلصات البروتين النووي عن طريق الرحلان الكهربائي SDS-PAGE. بعد ذلك ، يتم نقل البروتينات المنفصلة إلى مرشح نيتروسليلوز ، بولي فينيلدين ديفلورايد (PVDF) أو غشاء نايلون كاتيوني [12]. ثم يتم تحضين المرشح باستخدام مجسات قليلة النوكليوتيد لتحليل البروتينات الممتصة [44 ، 45]. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تكتنفها مشاكل مثل الكميات الكبيرة من البروتينات النووية (عادة 50-100 مجم) ، وتدهور البروتين أثناء العزل ، ومواجهة صعوبات في تحقيق الفصل الكهربي الفعال ونقل نطاق جزيئي واسع من البروتينات [45] .

3.3 استخراج الجزيئات الحيوية الكل في واحد

بشكل عام ، لا تسمح تقنيات أو مجموعات الاستخراج أو التنقية المتوفرة في السوق إلا باستخراج نوع واحد من الحمض النووي ، إما DNA أو RNA ، أو بروتين من كائن حي مستهدف. عندما تكون المادة الخلوية محدودة ، فمن المستحسن استخراج DNA و RNA والبروتين من نفس المصدر.

هناك تباين في طريقة العزل أحادية الخطوة لـ Chomczynski و Sacchi (1987) ، حيث يتم استخراج متجانسة guanidinium thyicyanate مع الفينول: الكلوروفورم عند درجة الحموضة المنخفضة ، يسمح بتحضير الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي والبروتين من الأنسجة أو الخلايا. تتضمن هذه الطريقة تحلل الخلايا بإيزوثيوسيانات الغوانيدين والفينول في محلول أحادي الطور. تتكون المرحلة الثانية بعد إضافة الكلوروفورم حيث يتم استخلاص الحمض النووي والبروتينات ، تاركًا الحمض النووي الريبي في المادة الطافية المائية. يمكن عزل الحمض النووي والبروتينات من المرحلة العضوية عن طريق الترسيب باستخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول والحمض النووي الريبي المترسب من الطور المائي باستخدام الأيزوبروبانول [15].

تم طرح العديد من مجموعات الاستخراج الكل في واحد في السوق في الوقت الحاضر. على سبيل المثال ، مجموعة الاستخراج القائمة على العمود والتي تم تصميمها لتنقية الحمض النووي الجيني والحمض النووي الريبي الكلي والبروتين الكلي من عينة بيولوجية واحدة في وقت واحد ، دون استخدام المواد السامة مثل الفينول أو الكلوروفورم وترسيب الكحول [46]. إنه متوافق مع كميات صغيرة من مجموعة واسعة من الخلايا المزروعة والأنسجة المحصودة من أصل حيواني وبشري. لا يلزم فصل العينة المستهدفة إلى 3 أجزاء قبل تنقية DNA و RNA والبروتين [46].

تعد مجموعة الاستخراج 3 في 1 القائمة على المحلول والمتوفرة في السوق مثالًا آخر على مجموعة الحلول غير العضوية التي يمكنها استخراج وتنقية الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين ، من كائنات مختلفة بأي أنواع وأحجام [47]. يوفر بروتوكول الخطوات الثلاث البسيطة ، والذي يستغرق حوالي 15 إلى 30 دقيقة ، طريقة سريعة وسهلة لاستخراج الجزيئات الحيوية المختلفة. لذلك ، يمكن توقع عائد أعلى حيث تؤدي خطوات أقل إلى خسارة أقل [47].

3.4. نظام الاستخراج الآلي

ساعد نظام الاستخراج الآلي ، وهو جهاز كبير ومكلف ومعقد مصمم لمعالجة العينات عالية الإنتاجية ، على تبسيط عزل الأحماض النووية [48]. تم تصميم هذا النظام للمختبرات المتوسطة إلى الكبيرة التي نمت في الوجود خلال السنوات الأخيرة [49]. من المحتمل أن تكون أتمتة عملية استخلاص الحمض النووي مفيدة لعدد من الأسباب بما في ذلك تقليل وقت العمل ، وخفض تكاليف العمالة ، وزيادة سلامة العمال وفي الوسط توفر فرصة في زيادة إمكانية التكاثر وجودة النتائج [50]. إلى جانب ذلك ، فهو حل رئيسي لزيادة كفاءة المختبر [48].

في المختبرات السريرية ، سيتم استخدام تنقية الجزيئات الحيوية عالية الجودة مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين من مجموعة متنوعة من المواد الأولية في تطبيقات الاختبار النهائية. من الأهمية بمكان الحصول على عينات منقى بجودة ونقاء كافيين [48]. لذلك ، يجب أن تكون عمليات الاستخراج الآلية أكثر اتساقًا وقابلية للتكرار. يجب أن تكون سرعة ودقة وموثوقية عملية الاستخراج بأكملها قصوى وفي نفس الوقت تقلل من خطر انتقال التلوث [49]. يجب تقديم حل لزيادة كفاءة تحضير العينات دون التضحية بالجودة. يجب تقليل احتمالية انتقال التلوث وأن تكون الأنظمة قابلة لتتبع العينات ذات الرموز الشريطية [51].

يلبي نظام الاستخراج المتوفر في السوق المتطلبات المذكورة أعلاه. وهو يوفر لمختبرات الطب الشرعي معالجة سريعة وموثوقة للعينات إلى جانب تنقية آلية عالية الجودة للحمض النووي [52]. إنه نظام معالجة الجسيمات المغناطيسية لمعالجة العينة وتوفير إنتاجية ونقاء متسقين حيث لا يوجد تلوث متبادل يمكن اكتشافه بين العينات. تستغرق عملية الاستخراج بأكملها حوالي 20 دقيقة من البداية إلى النهاية لأنه لا يلزم سوى ثلاث خطوات بسيطة: إضافة عينات سائلة إلى خرطوشة الكاشف ، ضع خراطيش الكاشف في الماكينة ، اضغط على زر البدء. يتم استخلاص الحمض النووي في المخزن المؤقت في نهاية العملية [52].

تم تقديم مثال آخر للنظام الآلي المرن والفعال لاستخراج الأحماض النووية والبروتينات [53]. يمكن معالجة مواد البدء المختلفة باستخدام هذا النظام ، المصمم لإنتاج العينات الصغيرة والمتوسطة. استخدم جسيمات بارامغناطيسية وظيفية سطحية لامتصاص الحمض النووي المعزول [53]. تسمح مرونة هذا النظام باستخراج الحمض النووي من ما يصل إلى اثني عشر عينة في وقت واحد. تستغرق عملية الاستخراج حوالي 20 إلى 40 دقيقة حسب التطبيق. يمكن للمجموعات التي تم تحسينها لهذا النظام استخراج الحمض النووي الجيني ، والحمض النووي الريبي الخلوي ، والأحماض النووية الفيروسية أو البكتيرية [53].

4. الاتجاه المستقبلي المحتمل

استخلاص الجزيئات الحيوية هو الخطوة الأولى التي يجب إجراؤها من أجل عملية التحليل أو المعالجة التالية. تعد متطلبات معالجة السوائل هي الجانب الأكثر تحديًا. لذلك ، يجب ألا يشتمل أي نظام آلي على معدات أوتوماتيكية لكل خطوة من خطوات الاستخراج فحسب ، بل يجب أن يشتمل أيضًا على معدات لأتمتة نقل السائل بين الآلات. ساعدت الأتمتة في زيادة الإنتاجية وتحسين موثوقية العملية ، ولكن هذه الأنظمة لا تزال مصممة للاستخدام في بيئة معملية فقط. بعض أنظمة استخلاص الحمض النووي المتوفرة في السوق كبيرة وتتطلب مراحل معالجة مسبقة يدويًا بواسطة طاقم المختبر من ذوي الخبرة الفنية [54]. لذلك ، يجب أن تحقق محطات العمل الروبوتية لاستخراج الحمض النووي أتمتة "سريعة" ، مما يعني عملية مؤتمتة بالكامل [49]. يمكن أن يكون مزيج من محلول وطريقة استخلاص الجزيئات الحيوية الكل في واحد مع نظام استخلاص مؤتمت بالكامل اختراعًا مستقبليًا. يمكن إجراء تنقية DNA أو RNA أو البروتين من كائنات مختلفة في وقت واحد باستخدام هذا النوع من نظام الاستخراج بطريقة استخراج واحدة فقط.

غالبًا ما يكون من غير الملائم إرسال عينة من الجزيئات الحيوية المستهدفة من حيوان أو نبات أو حتى عينة سريرية إلى المختبر لاستخراجها وتحليلها [54]. يجب تبريد العينات ، وخاصة العينة السريرية مثل الدم ، ونقلها إلى أقرب مختبر لاستخراجها وتحليلها. ومن ثم ، فإن نظام استخلاص الجزيئات الحيوية المحمولة ، والذي يجلب العديد من المزايا مثل تقليل العمالة وتقليل النفايات وزيادة سرعة عملية الاستخراج ، يمكن أن يكون تطورًا محتملاً في المستقبل [54]. يمكن الجمع بين نظام الاستخراج المحمول مع DNA أو RNA أو محلل البروتين في المستقبل لمساعدة الباحثين في تقليل وقت العمل وزيادة كفاءة العمل.

سيكون التحسين المستمر في التصغير هو الاتجاه المستقبلي للأتمتة الروبوتية في المختبر [28]. تقوم العديد من المختبرات السريرية بإجراء تحليل لسير العمل وتجد أن الأنظمة الأصغر ذات الإنتاجية المنخفضة أكثر اتساقًا مع عبء العمل في المختبرات السريرية. إلى جانب ذلك ، يمكن تنفيذ نظام الأتمتة هذا بتكلفة منخفضة نسبيًا ، مما يحسن أوقات التسليم ويقلل أيضًا من تكاليف العمالة [55].

5. الخلاصة

منذ أن تم إجراء أول عزل للحمض النووي بنجاح بواسطة فريدريش ميشر في عام 1869 وتم تطوير الاستخراج الأولي للحمض النووي من استراتيجيات الطرد المركزي المتدرجة الكثافة بواسطة ميسيلسون وستال في عام 1958 ، تم تطوير العديد من تقنيات تنقية الجزيئات الحيوية. من استخراج غوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-كلوروفورم إلى تقنية العمود المستخدمة على نطاق واسع في استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، وطريقة تنقية الكروماتوجرافيا إلى التكتل المناعي الذي يستخدم لاستخراج البروتينات ، ساعد استخراج الجزيئات الحيوية الباحثين والعلماء في معالجة تحليل البيولوجيا الجزيئية اللاحقة بالترتيب للحصول على فهم أفضل للمواد البيولوجية للأرض.

تم تطوير نظام استخلاص الحمض النووي الآلي نتيجة لتأثير النمو السريع لتكنولوجيا الأتمتة في الوقت الحاضر. من المحتمل أن تكون أتمتة عملية استخراج الحمض النووي مفيدة لعدد من الأسباب بما في ذلك تقليل وقت العمل ، وخفض تكاليف العمالة ، وزيادة سلامة العمال ، وفي نفس الوقت توفر فرصة لزيادة إمكانية التكاثر وجودة النتائج. ومع ذلك ، يجب إجراء تحسين في نقاط الضعف لبعض الأدوات طوال الوقت. في غضون ذلك ، يمكن أن يصبح نظام استخراج الجزيئات الحيوية الكل في واحد ، أو اختراع نظام الاستخراج المصغر والمحمول تطورًا مستقبليًا.

مراجع

  1. إم. وينك ، مقدمة في التكنولوجيا الحيوية الجزيئية: الأساسيات الجزيئية وطرقها وتطبيقها في التكنولوجيا الحيوية الحديثة، Wiley-VCH، Weinheim، ألمانيا، 2006.
  2. K. دويل ، مصدر الاكتشاف: دليل البروتوكولات والتطبيقات، PROMEGA ، ماديسون ، ويس ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 1996.
  3. باكنغهام و إم إل فلوز ، التشخيص الجزيئي: الأساسيات والطرق والتطبيقات السريرية، FA Davis ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2007.
  4. L.J Cseke ، و P.B. Kaufman ، و G. K. Podila ، و C.-J. تساي ، كتيب الطرق الجزيئية والخلوية في علم الأحياء والطب، مطبعة سي آر سي ، بوكا راتون ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الطبعة الثانية ، 2004.
  5. بروكس ، التكنولوجيا الحيوية في الرعاية الصحية: مقدمة في المستحضرات الصيدلانية الحيوية، مطبعة أدوية ، لندن ، المملكة المتحدة ، 1998.
  6. كوجيما وس. أوزاوا ، "طريقة لعزل وتنقية الأحماض النووية ،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 2002/0192667 A1 ، ديسمبر 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  7. جيه دي واتسون ، تي إيه بيكر ، إس بي بيل ، إيه جان ، إم ليسين ، آر لوسيك ، البيولوجيا الجزيئية للجين، بنجامين كامينغز ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الطبعة الخامسة ، 2004.
  8. ر. دهم ، فريدريش ميشر واكتشاف الحمض النووي، إلسفير ، أمستردام ، هولندا ، 2004.
  9. د. ويتفورد ، البروتينات: التركيب والوظيفة، John Wiley & # x26 Sons ، لندن ، المملكة المتحدة ، 2005.
  10. جي تي إدسال ، "إدوين جوزيف كوهن (1892 & # x20131953) ،" في مذكرات السيرة الذاتية، المجلد. 35، pp. 47–83، National Academy of Sciences، Washington، DC، USA، 1961. View at: Google Scholar
  11. S. V. Smarason and A. V. Smith، "Method for desalting nucleic acids،" United Stateحه براءة اختراع US 2003/0186247 A1، deCODE genetics ehf.، October 2003.عرض على: الباحث العلمي من Google
  12. سامبروك ود. راسل ، الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل، المجلد. 3 ، مطبعة كولد سبرينغ هاربور ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الطبعة الثالثة ، 2001.
  13. P. Chomczynski و N. Sacchi ، "الطريقة أحادية الخطوة لعزل الحمض النووي الريبي عن طريق استخراج حمض الغوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-كلوروفورم: عشرون عامًا بعد ذلك ،" بروتوكولات الطبيعة، المجلد. 1 ، لا. 2 ، ص 581-585 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  14. H.C.Birnboim and J. Doly ، "إجراء استخراج قلوي سريع لفحص DNA البلازميد المؤتلف ،" بحوث الأحماض النووية، المجلد. 7 ، لا. 6، pp. 1513–1523، 1979. View at: Google Scholar
  15. سامبروك ود. راسل ، الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل، المجلد. 1 ، مطبعة كولد سبرينغ هاربور ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الطبعة الثالثة ، 2001.
  16. K.-H. إيسر ، دبليو إتش ماركس ، وتي ليسوسكي ، "مصفوفة خالية من الحمض النووي: تجديد أعمدة ربط الحمض النووي ،" التقنيات الحيوية، المجلد. 39 ، لا. 2، pp.270–271، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  17. دي تي جيرس ، إل هوانج ، دي هورنبي ، تنقية وتحليل الحمض النووي الريبي (RNA): تحضير العينة ، الاستخراج ، اللوني، Wiley-VCH ، Weinheim ، ألمانيا ، الطبعة الأولى ، 2009.
  18. CE Smith و DL Holmes و DJ Simpson و J. Kayzhendler و RH Bitner و JC Groseh ، "المرحلة الصلبة ذات الطبقة المختلطة واستخدامها في عزل الأحماض النووية" ، براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 2002/0001812 A1 ، شركة Promega ، يناير 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  19. في. في بادي ، سي يورك ، وأ. بوركيفيز ، "تنقية الحمض النووي على هلام السيليكا ومزيج الزجاج" ، براءة اختراع الولايات المتحدة 5658548 ، شركة Promega ، أغسطس 1997. عرض على: الباحث العلمي من Google
  20. D. L. Woodard ، A. J. Howard ، and J. A. Down ، "عملية تنقية الحمض النووي على السيليكا المائية ،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 5342931 ، بيكتون ، ديكنسون وشركاه ، آب (أغسطس) 1994. عرض على: الباحث العلمي من Google
  21. K.-H. Esser و W. H. Marx و T. Lisowsky ، "MaxXbond: أول نظام تجديد لمصفوفات السيليكا الملزمة للحمض النووي ،" طرق الطبيعة، المجلد. 3 ، لا. 1، pp.1–2، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  22. قسم الأحياء ، كلية ديفيدسون ، "Geneclean & # xAE ،" http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring99/lauren/geneclean.html. عرض على: الباحث العلمي من Google
  23. T. E. Arnold، M. T.Meyering، and R. S. Chesterson، "Nucleic acid bond matrix،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 6869532 B2، CUNO Incorporated ، مارس 2005. عرض على: الباحث العلمي من Google
  24. D. A. Dederich ، G. Okwuonu ، T. Garner et al. ، "تنقية الحبيبات الزجاجية لقالب البلازميد DNA من أجل التسلسل عالي الإنتاجية لجينومات الثدييات ،" بحوث الأحماض النووية، المجلد. 30 ، لا. 7 ، مقالة e32 ، 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  25. إم سي ليتل ، "عملية تنقية الحمض النووي على التراب الدياتومي ،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 5075430 ، شركة مختبرات Bio-Rad ، ديسمبر 1991. عرض على: الباحث العلمي من Google
  26. S. Berensmeier ، "الجسيمات المغناطيسية لفصل الأحماض النووية وتنقيتها ،" علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والتكنولوجيا الحيوية، المجلد. 73 ، لا. 3، pp.495–504، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  27. R. D. Nargessi ، "العزل المغناطيسي وتنقية الأحماض النووية" ، براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 6855499 B1 ، Cortex Biochem، Inc. ، فبراير 2005. عرض على: الباحث العلمي من Google
  28. بيو نوبيل أوي ، QuickPick TM DNA البلازميد، بيو نوبيل أوي ، توركو ، فيندلاند ، 2003.
  29. شركة QIAGEN Inc. ، Q Asymphony & # xAE كتيب الحمض النووي، QIAGEN ، ألاميدا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2008.
  30. النظم الحيوية التطبيقية ، طقم عزل الحمض النووي الكلي MagMAX TM، أبلايد بيوسيستمز ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2008.
  31. بيكمان كولتر ، إنك ، أجينكورت & # xAE امبيور & # xAE النظام: نظام تنقية PCR، بيكمان كولتر ، شاسكا ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2009.
  32. BIOMOL GmbH ، دليل مستخدم ArrayGrade mRNA Purification Kit، BIOMOL GmbH ، هامبورغ ، ألمانيا ، 2004.
  33. شركة Thermo Scientific Inc. بيرس أعمدة تبادل الأيونات القوية، Thermo Scientific، New Hampshire، NH، USA، 2007.
  34. شركة QIAGEN Inc. ، QIAGEN دليل DNA الجينومي، QIAGEN ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2001.
  35. D. B. Selingson and E.J Shrawder ، "طريقة عزل وتنقية الأحماض النووية من العينات البيولوجية ،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 4935342 ، Syngene Inc. ، يونيو 1990. عرض على: الباحث العلمي من Google
  36. شركة QIAGEN Inc. ، كتيب Qproteome TM Mammalian Protein، QIAGEN ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2006.
  37. R.J.Fido و E.N Mills و N.M Rigby و P.R Shewry ، "استخراج البروتين من الأنسجة النباتية ،" طرق في علم الأحياء الجزيئي، المجلد. 244، pp.21–27، 2004. View at: Google Scholar
  38. إس إم ويلرايت ، تنقية البروتين: تصميم وتوسيع نطاق المعالجة النهائية، كارل هانسر ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 1991.
  39. مختبر أبحاث الجينات ، مجموعة عازلة الترشيح الهلامي، مختبر أبحاث الجينات ، تايبيه ، تايوان ، 2007.
  40. بنغالور جيني ، دليل مجموعة أدوات التدريس اللوني لترشيح الجل من GeNei TM، بنغالور جيني ، بنغالور ، الهند ، 2007.
  41. أميرشام للعلوم البيولوجية ، مبادئ وطرق كروماتوغرافيا التقارب، أميرشام للعلوم البيولوجية ، أوبسالا ، السويد ، 2002.
  42. شركة Thermo Scientific Inc. حزمة راتنج تقارب مطرز في أعمدة، Thermo Scientific ، نيو هامبشاير ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2008.
  43. كارب ، البيولوجيا الخلوية والجزيئية: المفاهيم والمعدات، John Wiley & # x26 Sons ، لندن ، المملكة المتحدة ، الطبعة الخامسة ، 2008.
  44. B. Bowen ، J. Steinberg ، U.K Laemmli ، و H. Weintraub ، "الكشف عن البروتينات المرتبطة بالحمض النووي عن طريق النشاف البروتين" ، بحوث الأحماض النووية، المجلد. 8 ، لا. 1، pp. 1–20، 1980. View at: Google Scholar
  45. J. S. Handen and H. F. Rosenberg ، "طريقة محسنة للنشاف الجنوبي الغربي ،" Frountiers في العلوم البيولوجية، المجلد. 2 ، الصفحات 9-11 ، 1997. عرض على: الباحث العلمي من Google
  46. شركة QIAGEN Inc. ، الكل & # xAE كتيب DNA / RNA / Protein Mini، QIAGEN ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2007.
  47. "DeRiPRO، DNA، RNA and Proteins Extract Technology،" PCT / MY2008 / 000059 ، http://terra-ju.com/TLS.htm. عرض على: الباحث العلمي من Google
  48. شركة Promega ، TM Personal Automation لتحسين سير العمل في المختبر السريري [كتيب]، بروميغا ، سان لويس أوبيسبو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2008.
  49. J. Loeffler و K. D. Schmidt و H. Hebart و H. Einsele، "Automated nucleic extraction،" موسوعة علم الجينوم والبروتيوميات، الصفحات 93-96 ، 2004. عرض على: الباحث العلمي من Google
  50. جيه بويد ، "أتمتة المختبرات الروبوتية ،" علم، المجلد. 295 ، لا. 5554 ، ص 517-518 ، 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  51. واتكينز ، "الاستخراج الآلي للحمض النووي ،" http://www.ngrl.org.uk/Wessex/extraction.htm. عرض على: الباحث العلمي من Google
  52. شركة Promega ، ماكسويل & # xAE 16: الأتمتة الشخصية TM من Promega، بروميغا ، سان لويس أوبيسبو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2006.
  53. أناليتيك جينا إيه جي ، نظام استخراج InnuPure C12، Analytik Jena AG، Jena، Germany، 2007.
  54. سادارانجاني ، ب. ماكدونالد ، إيه جي رودريجو ، ود. سول ، "تحليل الحمض النووي باستخدام أداة روبوتية محمولة ،" dsbmards.pdf. عرض على: الباحث العلمي من Google
  55. أ. Thomsin ، "Insights into lab automation & # x27s future،" IVD Technology، January 2007. View at: Google Scholar

حقوق النشر

حقوق النشر & # xa9 2009 سيون تشي تان وبيو تشين ياب. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح.


شاهد الفيديو: الحمض النووي RNA وتصنع البروتين (كانون الثاني 2023).