معلومة

التربسين وزراعة الخلايا

التربسين وزراعة الخلايا


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بتجربة حيث عالجت الخلايا بدواء وقمت بحساب عددها. أود أن أعرف ما إذا كان من السيئ محاولة تجريب الخلايا في أيام متتالية ، أي مرتين في غضون 48 ساعة. كم من الوقت تحتاج الخلايا لتعلق مرة أخرى على سطح القارورة؟ أريد أن أعرف ما إذا كان بإمكاني علاجهم بالمخدرات في نفس اليوم الذي أضيف فيه التربسين للعد.

شكرا.


سيكون من المجهد أن يتم تجريب الخلايا بعد 24 ساعة من البذر. بعد طلاء الخلايا ، هناك وقت متأخر لبدء النمو. ربما ، خلال فترة التأخر ، استقرت الحالة الفسيولوجية للخلايا. يجب عليهم التعبير عن البروتينات المهضومة عن طريق التربسين وعرضها على السطح وما إلى ذلك. ثم يمكنك أن تزعج الحالة مرة أخرى عن طريق محاولة إعادة الخلايا مرة أخرى إذا قمت بإعادة الخلايا بعد 24 ساعة. لن أنكر أن بعض الخلايا لا تتأثر بالتريبسين كثيرًا ، لكن يجب أن تكون حريصًا.

إذا كان بإمكاني علاجهم بالعقاقير في نفس اليوم ، فأضيف التربسين للعد.

ليس من الأفضل ، ولكن في بعض الحالات ، يتم اتخاذ مثل هذه الطريقة بالفعل. إذا استطعت ، فقد ترغب في تزويدنا بمزيد من المعلومات حول الخلايا والأدوية التي ستستخدمها.

ملاحظة

إذا حاولت تجريب الخلايا للعد ولم تستبدلها ، فلا داعي للقلق بشأن حالة الخلية ، كما يقول WYSIWYG.


لا يُنصح بتجربة الخلايا كثيرًا عندما يتعين عليك الحفاظ عليها. ومع ذلك ، في حالتك الوضع مختلف.

يعتمد الوقت المطلوب للإرفاق على نوع الخلية. في أي حال أثناء إجراء تجربة ، لا ينبغي أن تكون خلاياك بالفعل تحت الضغط. لذلك يجب أن تزرع القوارير / أطباق المزرعة بتركيز أقل من الخلايا بحيث تصل إلى حوالي 60٪ التقاء في غضون 24 ساعة. تعتبر 24 ساعة بشكل عام كافية حتى تتعافى الخلايا من الإجهاد بسبب التريبسين. (يمكنك إلقاء نظرة على هذا المنشور لمضاعفة أوقات بعض خطوط الخلايا).

بعد إجراء العلاج ، يمكنك عد الخلايا كلما كنت تعتقد أنه جيد ؛ هذا يعتمد في الواقع على تجربتك ويمكنك علاج الخلايا للوقت الذي يناسب حركية الدواء. إن عملية التريبسينج جيدة الآن لأنك لن تستخدم هذه الخلايا مرة أخرى.

ومع ذلك ، هناك طرق لحساب أرقام الخلايا دون محاولة. بافتراض أن القارورة الخاصة بك متجانسة ، يمكنك اختيار قسم منها وحساب أرقام الخلايا يدويًا باستخدام المجهر. يمكنك أيضًا استخدام برامج مثل ImageJ لتسهيل المهمة. ستجعل الخلايا التي تعبر عن GFP أيضًا المهمة أسهل.


يمكن اعتباره "لا يجيب على السؤال" ولكن:

الخيار 1: اعتمادًا على نوع الخلايا التي تستخدمها ، يمكنك استخدام طرق أكثر اعتدالًا لفصل الخلايا. يتضمن المثال Versene وهو أساسًا PBS + EDTA. الأكثر اعتدالًا هو مجرد استخدام PBS الذي لا يحتوي على Mg أو Ca (بدون إزالة معدن ثقيل).

الخيار 2: قم بتكرار الإعداد الخاص بك - بدلاً من طبقين - أحدهما يحتوي على دواء والآخر بدونه ، فأنت تقوم بإعداد 4 أطباق (يتم الاستغناء عنها من مصدر مشترك - على سبيل المثال ، إذا كان الطبق الخاص بك عبارة عن طبق بحجم 6 سم مع وسائط 3 مل ، فإنك تصنع 4.5 × 3 مل من الخلايا في التخفيف النهائي لك تريد) تحصل كل لوحة على 3 مللي من نفس المصدر حتى تعرف أن لديهم نفس عدد الخلايا. طبقين تضيفهما مخدرات ، اثنان لا تضيفهما. في اليوم الذي تريد العد فيه ، تأخذ اللوحات المكررة وتحسبها. بهذه الطريقة ، تحصل على العدد دون لمس الأطباق النهائية على الإطلاق.

كتجربة جانبية ، إذا أعدت تلك الخلايا التي تم تجريبها إلى طبقين (واستبدلت وسائط الدواء في التكرار المعالج بالعقار) ، وقمت بعد كل اللوحات في اليوم الأخير من تجربتك ، بشرط ألا تكون الخلايا عند التقاء 100٪ ، يمكن اعتبار أي اختلاف تراه من trypsinized مقابل untrypsinized خطأ محتملًا كنت ستحدثه إذا كنت قد انتهيت من منهجيتك الأصلية.


تأثير التربسين على حجم الخلية والكتلة

تتوقف الخلايا الطبيعية عن النمو في المزرعة عندما تصل إلى كثافة تشبع معينة 1-4 (تثبيط التلامس للنمو). تم القبض على الخلايا في G1 مرحلة من دورة الخلية ، يتم خلالها قمع تخليق الحمض النووي ولا يحدث الانقسام 5،6. في حين أن الخلايا السرطانية إما أقل حساسية أو غير حساسة لتثبيط التلامس للنمو 4 ، يمكن إنقاذ الخلايا الطبيعية من هذا التثبيط. يؤدي العلاج بمصل 1،7 ، والعوامل المشتقة من الخلايا 8 ، وتركيزات منخفضة من الإنزيمات المحللة للبروتين 8،9 وعدد من العوامل الأخرى 10 ، بعد فترة زمنية معينة ، إلى استئناف تخليق الحمض النووي والانقسام. في الظروف المواتية لتخليق وانقسام الحمض النووي ، يزداد حجم الخلية - سواء كانت طبيعية أو محولة - بشكل كبير 11 ، لكن الخلايا السرطانية فقط تشكل مستعمرات 12. نبلغ الآن أن الخلايا الطبيعية والمتحولة تزيد على الفور من حجمها ووزنها الجاف (الكتلة) عند تعرضها لجرعة منخفضة من التربسين. يحدث هذا عندما يتم تثبيط تخليق الحمض النووي ، ولا يتطلب نسخًا جديدًا ، وبالتالي فإن التربسين يؤثر بشكل مباشر على سطح الخلية.


أسئلة تقسيم ثقافة الخلية - لماذا تقوم بالطرد المركزي للخلايا بعد تحييد التربسين؟ ووجود مشكلات مع تقنيات المختبر الجديدة. هل لي فقط؟

مرحبًا r / علم الأحياء ، أنا & # x27m جديد هنا. لقد بدأت للتو منصب مساعد باحث في معمل علوم أساسية على الخلايا ، وبالطبع ، من الصعب الشعور بعدم الجدوى في البداية ب / ج ، ينشغل جميع الباحثين وتقنيي تقنية المعلومات إما بتعلم تقنيات جديدة (البقع ، PCRs ، إلخ) أو مشغول مع مشاريعهم الخاصة.

على الرغم من ذلك ، فإن سؤالي الأكبر هو في تقسيم الخلية - لماذا تقوم بالطرد المركزي بعد الخلايا التربسينية؟ لقد تعلمت دائمًا في موقعي السابق في المعمل ، أنه بعد تجريب الخلايا ، وتحييد tryspin w / media ، يجب عليك الطرد المركزي لمدة 4 دقائق أو نحو ذلك. ثم تتخلص من المادة الطافية ، وتعيد خلط الحبيبات في 10 مل جديد من الوسائط ثم توزعها على ألواح. المعمل هنا لا يحتوي على أجهزة طرد مركزي ، يقومون فقط بالماصة لأعلى ولأسفل لمدة 5 دقائق ثم يطلقون المزيج في اللوحات.

بالنسبة لي ، في السابق ، عملت لمدة عامين في مختبر الخلايا الجذعية للعلوم الأساسية منذ 3 سنوات ، وكان الشيء الوحيد الذي قمت به جيدًا هو تقسيم / طلاء / الحفاظ على مزارع الخلايا. كان مشرفي القديم شرجًا للغاية بشأن كونه عقيمًا ونظيفًا ومسحًا لكل شيء مع الكحول ، وارتداء القفازات دائمًا ، والتخلص دائمًا من الأشياء بشكل صحيح ، سواء كنت تستخدم وسائط ماصة أو شيئًا خطيرًا بيولوجيًا. خاصة في تقنيات زراعة الخلايا.

في مختبري الجديد ، إلى جانب الشعور بعدم الجدوى ، لاحظت وجود اختلافات كبيرة في كيفية إجراء التجارب. على سبيل المثال ، عندما يقومون بالمص في الغطاء ، فإنهم يتخلصون من الرؤوس بشكل عشوائي في بعض أركان الغطاء بدلاً من حوالي 50 مل أنبوب (كما تعلمت) أو جرة نصائح. أو عندما يزيلون الوسائط القديمة من الطبق ، فإنهم لا يستخدمون مكنسة كهربائية + ماصة باستور (تُحرق لتكون معقمة) ، بل تستخدم الماصة بدلاً من ذلك. إنهم لا يرشون الماصات الدقيقة الخاصة بهم مع EtOH كثيرًا عندما يقومون بنقل الأشياء داخل وخارج الغطاء. & # x27m لست متأكدًا مما إذا كنت & # x27m فقط أعاني من مشاكل تعديل أو في وقت ما ..

إنه & # x27s محبط لأنني & # x27m أدنى شخص في المختبر ، ليس لدي أي مهارات تتجاوز زراعة الخلايا ولكني لا أريد أن أكون مسؤولاً عن خلايا أشخاص آخرين حتى الآن. وهم (فهم) لا يصدقونني عندما قلت إنني اعتدت على خلايا الطرد المركزي. هناك & # x27s المزيد من الأشياء ولكني أشعر أنه في كل مرة أسأل مثل هذه الأشياء ، يكون الأمر مزعجًا لهم بعض الشيء. أعجبني & quotoh جيدًا ، هذا هو الاختصار & quot ، وقد اعتدت على القيام بذلك بطريقة معينة من قبل مدير المختبر السابق الخاص بي قبل 2.5 عام والذي كان ماهرًا للغاية.


التربسين وزراعة الخلايا - علم الأحياء

زراعة الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC)

1. محلول الملح المتوازن من هانك بدون Ca ++ و Mg ++ (HBSS) ، من Biowhittaker ، الكتالوج رقم 10-543.

2. خليط التربسين - فيرسين (0.5٪ التربسين - 0.02٪ EDTA) ، من جيبكو ، كات. # 610-5300 أو Biowhittaker ، كات. # 17-161. خفف 1: 1 باستخدام HBSS قبل الاستخدام.

3. مغذيات متوسطة ، تتكون من 20٪ مصل عجل الجنين من جيبكو ، كات. # 200-6140 ، 80٪ متوسط ​​199 (M199) تم تخزينه مؤقتًا باستخدام 25mM HEPES من Biowhittaker ، Cat. # 12-118 ، وتستكمل بـ 2 ملي مولار من الجلوتامين L-Glutamine الطازج (التركيز النهائي) من Biowhittaker ، كات. # 17-605E ، ومع 100 U / ml K-Penicillin G مع 100 ميكروغرام / مل من كبريتات الستربتومايسين من Biowhittaker ، Cat. # 17-719R أو جيبكو ، كات. # 600-5140. في يوم الاستخدام ، أضف 50 ميكروغرام / مل من مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS) من Biomedical Technologies ، Inc. ، Cat. # BT-203 ، (انظر البروتوكول رقم 2) ، و 100 ميكروغرام / مل هيبارين من Sigma Chem. شركة كات. # H-3933 (انظر البروتوكول رقم 3).

4. 0.1٪ جيلاتين ، من ديفكو ، كات. # 0143-02 ، مذاب في ماء خالٍ من البيروجين ، ومستخلص من الأنسجة ومُعقم.

1. قم بتغطية قوارير زراعة الأنسجة الفارغة (كورنينج أو ما يعادله) بالجيلاتين ، وتصريف وإزالة الفائض. اترك القوارير تجف (في درجة حرارة الغرفة بغطاء تدفق رقائقي).

2. نضح الوسيط من دورق من HUVEC الأساسي (معزول من واحد أو أكثر من الحبال السرية) عند التقاء أو بالقرب منه (انظر المراجع 1 و 2 أمبير).

3. اغسل الطبقة الأحادية بـ 5 مل من HBSS (تُعطى الأحجام لقارورة مقاس 75 سم 2 ، استخدم 1/2 بقدر 25 سم 2 قوارير).

5. بسرعة كبيرة ، اشطف الطبقة الأحادية بـ 2 مل من التربسين - فيرين المخفف ، مما يسمح للسطح بالبقاء مغطى لمدة 10-30 ثانية.

7. أضف 2 مل أخرى من التربسين - فيرسين إلى القارورة.

8. قم بتغطية القارورة وحركها لفترة وجيزة.

9. افحص القارورة تحت المجهر لتحديد أن الخلايا قد انفصلت ، يحدث هذا عادة في غضون 1-3 دقائق (ملحوظة: راقب بعناية في هذه المرحلة لتجنب التعرض المفرط للتربسين).

10. أضف وسط المغذيات مباشرة إلى القارورة. سيعمل مكون المصل على إخماد نشاط التربسين. يتم تحديد الحجم المضاف وفقًا للمقياس التالي.
قسّم 1 دورق إلى 3 قوارير (لتكون متجمعة في

5-6 أيام)
(ملحوظة: نسبة 1: 6 هي الأكثر كفاءة من حيث كمية الخلايا المنتجة لكل عدد من الرضعات المطلوبة.)

11. وزع معلق الخلية المخفف في قوارير الجيلاتين المطلية مسبقًا.

12. اجعل الحجم النهائي في كل دورق يصل إلى 10-12 مل بوسط المغذيات.

13. احضن القوارير عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 + 95٪ هواء وأعد إطعامها كل 2-3 أيام.

  1. يسمح هذا الإجراء بالتضخيم الفعال لعدد الخلايا البطانية من الثقافات الأولية للوريد السري البشري ومصادر الأوعية الدموية البشرية الأخرى بعدد مرور منخفض نسبيًا. سيؤدي استمرار المرور في النهاية إلى تغييرات شائخة وفقدان إمكانات التكرار المفيدة.
  2. هذا الإجراء هو الطريقة القياسية المستخدمة حاليًا في المختبر الأساسي لثقافة الخلايا في قسم أبحاث الأوعية الدموية ، قسم علم الأمراض ، مستشفى بريغهام والنساء ، بوسطن ، ماساتشوستس.

1. Gimbrone MA Jr. و Shefton EJ و Cruise SA: العزلة والثقافة الأولية للخلايا البطانية من الأوعية السرية البشرية. دليل جمعية زراعة الأنسجة 1978 4 (2): 813-818.

2. جيمبروني MA الابن: ثقافة البطانة الوعائية. الفصل 1 في: سبايت ت. (محرر) التقدم في الإرقاء والتخثر ، المجلد. III، Grune & amp Stratton، Inc.، 1976 pp.1-28.

3. Maciag T و Hover GA و Stemerman MB و Weinstein: التكاثر التسلسلي للخلايا البطانية البشرية في المختبر. J Cell Biol 1981 91: 420-428.

4. Thornton SC و Mueller SW و Levine EM: الخلايا البطانية البشرية: استخدام الهيبارين في الاستنساخ والزراعة التسلسلية طويلة المدى. Science 1983222: 623-625.


ك. جيمبروني
7/1985 (5/19/00)
قسم بحوث الأوعية الدموية
قسم علم الأمراض
مستشفى بريغهام & أمبير للمرأة
بوسطن ، ماساتشوستس

تحضير محلول مكمل نمو الخلايا البطانية (5 مجم / مل)

1. مخفف الخلايا البطانية (المعروف أيضًا باسم ECGS) ، تم الحصول عليه من Biomedical Technologies، Inc.، Stoughton، MA، Cat. # BT-203

2. محلول الملح المتوازن Hank (HBSS) ، Cat. # 10-543 من Biowhittaker

3. 1 حقنة بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها (على سبيل المثال ، 20 مل) مع أو بدون إبرة كبيرة التجويف (يفضل بدونها لأسباب تتعلق بالسلامة)

4. وحدات تصفية حقنة معقمة Millex 0.22 ميكرون (Millipore ، Cat. # SLGS02505 أو # SLGP033RB)

5. عدد 2 من أنابيب الاستزراع المعقمة (بلاستيك ، يمكن التخلص منها)

1. استخدم 50.0 مجم من مخطط كهربية القلب ECGS لكل لتر من المتوسط ​​الذي تخطط لاستخدامه في غضون أسبوع واحد (راجع الخطوتين 9 و 10). استمر في الإجراء بغطاء معقم.

2. لكل لتر من الوسط المطلوب صنعه ، ضع 5 مل من HBSS عند 37 درجة مئوية في الزجاجة المعقمة لمخطط كهربية القلب.

3. قم بغطاء الزجاجة وتحريكها برفق ، وتجنب الفقاعات.

4. نقل السائل إلى أحد الأنابيب المعقمة.

5. اشطف الزجاجة بحجم 5 مل إضافي من HBSS وأضفها إلى السائل في الأنبوب.

6. ضع المحلول في حقنة.

7. في حالة استخدامها ، استبدل الإبرة بفلتر معقم Millex 0.22 ميكرون ، وقم بترشيح المحلول في الأنبوب المعقم الثاني.

8. قم بتغيير المرشح بعد كل 20 مل لمنع الحمل الزائد للفلتر.

9. قم بتخزين محلول المخزون هذا عند 4 درجة مئوية. (لا تجمد). لاحظ أيضًا أن نشاط مخطط كهربية القلب ينخفض ​​بعد أن يظل في محلول لمدة 7 - 10 أيام.

10. لإطعام الخلايا البطانية للوريد السري البشري المستنبتة ، قم بتخفيف 5 مجم / مل من محلول ECGS بنسبة 1: 100 في 20 ٪ من مصل عجل الجنين في M199 مع 100 ميكروغرام / مل من الهيبارين (انظر البروتوكول رقم 3) في HBSS في يوم التغذية . (يتدهور نشاط مخطط كهربية القلب في وسط المغذيات بعد 48 ساعة تقريبًا.) لا تقم بتخزين الوسيط المكمّل بـ ECGS والهيبارين لأكثر من يومين.

ك. جيمبروني
7/1985 (5/19/00)

تحضير محلول مخزون من الهيبارين (10 مجم / مل).

1. ملح الصوديوم الهيبارين المجفف (الدرجة 1 ، من الغشاء المخاطي لأمعاء الخنازير) ، سيجما ، كات. # H-3393.

2. محلول الملح المتوازن Hank (HBSS) من Biowhittaker ، كات. # 10-543.

3. 1 محقنة بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها (على سبيل المثال 20 سم مكعب) مع أو بدون إبرة ذات تجويف كبير (يفضل بدونها لأسباب تتعلق بالسلامة).

4. وحدات تصفية حقنة معقمة Millex 0.22 ميكرون (Millipore ، Cat. # SLGS02505 أو # SLGP033RB).

5. عدد 2 أنبوب زراعة بلاستيك معقم مع أغطية (على سبيل المثال 50 مل).

1. قم بوزن 100 مجم من الهيبارين لكل لتر من وسط المغذيات لاستخدامها خلال الأيام السبعة القادمة.

2. في غطاء معقم ، أضف الهيبارين إلى HBSS عند 37 درجة مئوية (10 مل من HBSS لكل لتر من الوسط الذي سيتم تصنيعه) في غطاء أنبوب معقم ودوامة.

3. إذا كان الهيبارين بطيئًا في الوصول إلى المحلول ، قم بتدويره لفترة وجيزة ، ثم اتركه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

4. سحب الهيبارين معقم بواسطة حقنة وإبرة.

5. استبدل الإبرة ، في حالة استخدامها ، بفلتر 0.22 ميكرون واجمع المرشح في أنبوب معقم آخر.

6. انظر الطرق: الخطوتين 9 و 10 في البروتوكول رقم 2. قد لا يخضع الهيبارين لنفس انخفاض النشاط بمرور الوقت في المحلول ، ولكن يتم التعامل معه بشكل روتيني بنفس طريقة مخطط كهربية القلب.

7. خفف محلول الهيبارين 1: 100 في 20٪ مصل عجل الجنين في M199 مع 50 ميكروغرام لكل مل من مخطط كهربية القلب ECGS في HBSS لاستخدامه في تغذية HUVEC المستنبت.

بشكل عام ، من الأسهل تكوين أحجام أكبر من 20٪ FCS في M199 باستخدام 2 ملي مولار من الجلوتامين ، بالإضافة إلى 100 وحدة / مل من K-Penicillin G و 100 مجم / مل من كبريتات الستربتومايسين مسبقًا ، حيث يمكن تخزينها من أجل 10 أيام أو أكثر عند 4 درجة مئوية ، ثم قم ببساطة بتخفيف محاليل ECGS و Heparin 1: 100 في حجم الوسط الذي سيتم استخدامه في يوم معين.


التنشيط التحلل للبروتين من الإسهال الوبائي للخنازير فيروس كورونا ارتفاع بروتين الاندماج عن طريق التربسين في ثقافة الخلية

يتطلب عزل فيروس كورونا الإسهال الوبائي الخنازير (PEDV) من المواد السريرية في زراعة الخلايا مكملات التربسين. قد يتعلق هذا بحصر العدوى الطبيعية لـ PEDV في الأمعاء الدقيقة الغنية بالبروتياز للخنازير. ركزت دراستنا على دور نشاط الأنزيم البروتيني في العدوى من خلال التحقيق في بروتين سبايك لعزل PEDV (wtPEDV) باستخدام نظام وراثي عكسي يعتمد على سلالة DR13 المتوافقة مع ثقافة الخلية المستقلة عن التربسين (caPEDV). نوضح أن التربسين يعمل على بروتين ارتفاع wtPEDV بعد ارتباط المستقبلات. قمنا بتعيين المحدد الجيني لدخول الخلية المعتمدة على التربسين إلى المنطقة الطرفية N للوحدة الفرعية الاندماجية لبروتين الانصهار من الفئة الأولى ، وكشفنا عن أرجينين محفوظ في بداية الببتيد الانصهار المفترض كموقع الانقسام المحتمل. في حين تتم معالجة فيروسات كورونا عادةً عن طريق البروتياز الداخلي للمنتج أو الخلية المستهدفة ، فإن تنشيط البروتين PEDV S يتطلب بشكل صارم مكملات من البروتياز ، مما يمكننا من دراسة التفاصيل الميكانيكية للمعالجة المحللة للبروتين. الأهمية: تشكل الأوبئة المتكررة من PEDV تهديدًا خطيرًا على صحة الحيوان وعبئًا اقتصاديًا ، خاصة في آسيا ، ولكن مؤخرًا أيضًا في شبه القارة الأمريكية الشمالية. إن فهم بيولوجيا PEDV أمر بالغ الأهمية لمكافحة العدوى. هنا ، نقدم نظرة ثاقبة جديدة على إدخال الخلية المعتمدة على البروتياز لـ PEDV.

حقوق النشر © 2014 ، الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة. كل الحقوق محفوظة.

الأرقام

الإصابة بالنوع البري PEDV ...

العدوى بعزل PEDV من النوع البري ولكن ليس بفوائد PEDV المتوافقة مع ثقافة الخلية ...

يحدد بروتين S التربسين ...

يحدد بروتين S اعتماد التربسين على انتشار PEDV. (أ) تمثيل تخطيطي لـ ...

توصيف تنشيط البروتين S. ...

توصيف تنشيط البروتين S. (أ) تم إجراء فحص الإدخال كما هو موصوف ...

تعيين المحدد الجيني لـ ...

تعيين المحدد الجيني لدخول PEDV المحسن بالتريبسين. (أ) التنظيم المفترض للطبقة ...

استبدال الأرجينين في الموضع ...

يؤدي استبدال الأرجينين في الموضع 890 إلى تقليل قدرة تكوين المخلوط بمقدار ...


معلومات مفصلة عن المنتج

عام

معاجلة البيانات

يستجيب كل نوع من أنواع الخلايا أو الخط الخلوي لـ Trypsin-EDTA للخلايا الأولية بطريقة فريدة. للحصول على أفضل النتائج ، راقب الخلايا باستمرار أثناء عملية التفكك لمنع التلف. للحصول على معلومات خاصة بالخلية ، يرجى الرجوع إلى ورقة المنتج المرفقة مع الخلايا أو خط الخلية.

  1. قم بإحضار DPBS و Trypsin-EDTA للخلايا الأولية ومحلول تحييد التربسين إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. تدفئة وسط النمو الكامل إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها مع الخلايا.
  2. لكل قارورة ، قم بشفط الوسائط المستهلكة بعناية دون إزعاج الطبقة الأحادية. إذا كان وسط ثقافة الخلية يحتوي على مصل ، يجب شطف كل قارورة مع DPBS مرتين قبل إضافة التربسين- EDTA للخلايا الأولية.
  3. باستخدام 1 إلى 2 مل لكل 25 سم 2 ، أضف الحجم المناسب من محلول التربسين-يدتا لكل قارورة (على سبيل المثال ، سيتم فصل كل قارورة T-25 مع 1 إلى 2 مل من التربسين- EDTA).
  4. صخرة كل قارورة برفق لضمان التغطية الكاملة لمحلول التربسين-يدتا فوق الخلايا ، ثم نضح السائل الزائد من الطبقة الأحادية لا يستنشق حتى الجفاف.
  5. مراقبة الخلايا تحت المجهر. عندما تبتعد الخلايا عن بعضها البعض وتقريبًا (عادةً في غضون حوالي 3 إلى 6 دقائق) ، قم بإزالة القارورة من المجهر واضغط برفق على قارورة الثقافة من عدة جوانب لتعزيز انفصال الخلايا عن القارورة. لا تفرط في التربسين لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الخلايا.
    1. قد تستغرق بعض أنواع الخلايا شديدة الالتصاق ، مثل الخلايا الكيراتينية ، وقتًا أطول وقد تتطلب التريبسين عند درجة 37 درجة مئوية.
    2. قد تتطلب بعض أنواع الخلايا نقرًا أكثر نشاطًا.
    1. لا تفرط في استخدام خلايا الطرد المركزي لأن ذلك قد يتسبب في تلف الخلايا.
    2. بعد الطرد المركزي ، يجب أن تشكل الخلايا حبيبات نظيفة وفضفاضة.

    مواصفات مراقبة الجودة

    إخلاء المسؤولية القانونية

    يتم تقديم المنتج "كما هو" ويتم ضمان صلاحية منتجات ATCC & reg لمدة 30 يومًا من تاريخ الشحن ، بشرط أن يكون العميل قد قام بتخزين المنتج والتعامل معه وفقًا للمعلومات الواردة في ورقة معلومات المنتج ، والموقع الإلكتروني ، و شهادة تحليل. بالنسبة للثقافات الحية ، يسرد ATCC تركيبة الوسائط والكواشف التي ثبت أنها فعالة للمنتج. في حين أن الوسائط والكواشف الأخرى غير المحددة قد تؤدي أيضًا إلى نتائج مرضية ، فقد يؤثر التغيير في البروتوكولات الموصى بها من قبل ATCC و / أو المودعين على استعادة المنتج و / أو نموه و / أو وظيفته. إذا تم استخدام تركيبة وسيطة بديلة أو كاشف ، فإن ضمان ATCC للصلاحية لم يعد صالحًا. باستثناء ما هو منصوص عليه صراحة في هذه الوثيقة ، لا يتم تقديم أي ضمانات أخرى من أي نوع ، صريحة أو ضمنية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، أي ضمانات ضمنية خاصة بالتسويق أو الملاءمة لغرض معين أو التصنيع وفقًا لمعايير ممارسات التصنيع الجيدة (cGMP) والنموذجية والسلامة والدقة و / أو عدم الانتهاك.

    هذا المنتج مخصص للاستخدام في الأبحاث المختبرية فقط. غير مخصص لأي استخدام علاجي حيواني أو بشري ، أو أي استهلاك بشري أو حيواني ، أو أي استخدام تشخيصي. يحظر أي استخدام تجاري مقترح بدون ترخيص من ATCC.

    بينما تبذل ATCC جهودًا معقولة لتضمين معلومات دقيقة وحديثة في ورقة المنتج هذه ، لا تقدم ATCC أي ضمانات أو إقرارات فيما يتعلق بدقتها. يتم توفير الاستشهادات من المؤلفات العلمية وبراءات الاختراع لأغراض إعلامية فقط. لا تضمن ATCC تأكيد صحة هذه المعلومات أو اكتمالها ويتحمل العميل وحده مسؤولية تأكيد دقة واكتمال أي من هذه المعلومات.

    يتم إرسال هذا المنتج بشرط أن يكون العميل مسؤولاً ويتحمل جميع المخاطر والمسؤوليات فيما يتعلق باستلام منتج ATCC ومناولته وتخزينه والتخلص منه واستخدامه بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر اتخاذ جميع احتياطات السلامة والتعامل المناسبة لتقليل الصحة أو المخاطر البيئية. كشرط لاستلام المادة ، يوافق العميل على أن أي نشاط يتم إجراؤه مع منتج ATCC وأي ذرية أو تعديلات سيتم إجراؤها وفقًا لجميع القوانين واللوائح والإرشادات المعمول بها. يتم توفير هذا المنتج "كما هو" بدون أي تعهدات أو ضمانات من أي نوع باستثناء ما هو منصوص عليه صراحةً في هذه الوثيقة ولن تتحمل ATCC بأي حال من الأحوال مسؤولية شركة ATCC وأولياء الأمور والشركات التابعة لها والمديرين والمسؤولين والوكلاء والموظفين والمتنازل لهم والخلفاء والشركات التابعة لها بأي حال من الأحوال. الأضرار الخاصة أو العرضية أو التبعية من أي نوع فيما يتعلق أو الناشئة عن استخدام العميل للمنتج. في حين يتم بذل جهد معقول لضمان أصالة وموثوقية المواد المودعة ، فإن ATCC ليست مسؤولة عن الأضرار الناشئة عن الخطأ في تعريف هذه المواد أو تحريفها.


    لماذا تضيف الفينول الأحمر في التربسين؟ - (أبريل / 27/2005)

    يمكن لأي شخص أن يخبرني أنه يجب علينا استخدام الفينول الأحمر الموجود في التربسين - EDTA بنسبة 0.05 ٪ لغرض اختبار خط الخلايا الكيراتينية أحادي الطبقة؟

    لا يتعين عليك استخدام الفينول الأحمر في التربسين ، فهو يساعد فقط على ضمان حصولك على الرقم الهيدروجيني الصحيح ، لأن درجة الحموضة المرتفعة جدًا أو المنخفضة جدًا ستلحق المزيد من الضرر بالخلايا عندما تكون في حالة هشاشة ، مثل متى يتم تجريبهم.

    س ، أرى .. أحمر الفينول كمؤشر للأس الهيدروجيني كما ذكرته ش. وبالتالي ، فإنه يعطي اللون الأحمر لـ trypsin-EDTA. أتساءل لأعرف لماذا أضافوا الفينول الأحمر في التربسين ؟؟ هو أن مجرد إعطاء اللون الأحمر. ولضبط درجة الحموضة التربسين- EDTA.

    أميل إلى طلب trypsin-EDTA من Gibco ، لكنه يحتوي على الفينول الأحمر. هل ستؤدي إلى مشكلة كبيرة لخط الخلية أحادي الطبقة الملتصق.

    أهلا
    وفقًا لحقيقة أن معظم الوسائط المستخدمة في زراعة الخلايا تحتوي على الفينول الأحمر أيضًا ، لا أعتقد أن ذلك سيؤدي إلى تسمم خلاياك.

    أنت على حق. هذه معلومات لك أيضًا كما قال بوب.

    فريد ، قصدت أن الأمر مهم إذا كان لدينا الفينول الأحمر الموجود في التربسين EDTA. ؟؟

    لا يزال ، يتساءل لماذا بعض الشركات المصنعة تضع الفينول الأحمر في المتوسط ​​و EDTA التربسين لأنها يمكن أن تهمل الإضافة فقط. حق. لماذا هذا؟؟

    أتفق مع حقيقة أنه لا يهم إذا كان هناك الفينول في التربسين EDTA.
    لكني لا أتفق مع حقيقة أن أحمر الفينول (أو غيره من مؤشرات الرقم الهيدروجيني) لا يكاد يذكر في الوسط. في معظم الأحيان ، لا يستحق الأمر شيئًا خاصًا باستثناء الإشارة إلى الرقم الهيدروجيني ، لكن بالنسبة لي ، أستخدمه للكشف عن استنساخ الخلايا في لوحة 96 بئر أيضًا وللتحقق من جزء من صحة الخلايا.
    راجع للشغل ، أعتقد أن مؤشر الرقم الهيدروجيني هو معلومات أساسية للغاية في زراعة الخلايا.

    يستخدم Pheol red في trypsin-EDTA والوسيط كمؤشر pH فقط (على الأقل بقدر ما أعرف) ، إنه مفيد حقًا للتحقق البصري السريع من الرقم الهيدروجيني للحلول ، إذا كانت أرجوانية ، يكون الرقم الهيدروجيني أيضًا مرتفع ، وأصفر إذا كان الرقم الهيدروجيني منخفضًا جدًا ويجب التخلص منه في كلتا الحالتين.

    لا تحتوي كل الوسط التجاري على الفينول الأحمر ، يمكنك حتى شراء DMEM بدونه. الفينول الأحمر هو نظير للإستروجين ، يمكنه (ويفعل) محاكاة عمل إضافة الإستروجين إلى خط الخلية. إذا كنت تقوم بعمل يتضمن علاج الإستروجين ، فاستخدم الوسائط وتريبسين بدون أحمر الفينول.

    إذا كنت قلقًا حقًا بشأن ذلك ، يمكنك شراء مسحوق التربسين وإعداد الحل بنفسك.

    شكرًا فريد وبوب ، أعتقد أنه يجب أن يكون مفيدًا جدًا بشكل أساسي للمراقبة البصرية لظروف الخلايا ، على الأقل يرفع اللون.

    يجب أن يكون أحمر الفينول الموجود في الوسط أو التربسين أقل بما يكفي حتى لا يؤثر على نمو الخلايا. لذلك ، هنا يمكن أن نستنتج أنه لا توجد مشكلة كبيرة باستخدام الفينول الأحمر بكميات صغيرة سواء في المتوسط ​​أو التربسين لأنه يعمل كمؤشر ، ولا يضر نمو الخلايا بشكل رئيسي.

    هل التربسين / EDTA منظف ؟؟

    التربسين هو إنزيم يقضم بعيدًا في الخلية الموجودة في البروتين الموجود في اللوحة. EDTA مخلّب أيونات Mg ، مما يؤدي إلى تقريب الخلية. كلاهما في الحفلة يتسببان في انفصال الخلية عن اللوحة.


    لماذا 10٪ مصل لزراعة الخلايا؟ - (يونيو / 19/2008)

    لماذا نستخدم مصل 10٪ في وسائل الإعلام. ما يحدث هو أننا نزيد أو نخفض نسبة التربسين.

    ٪ من المصل متوسط ​​يعتمد على نوع الخلية التي قمت بزراعتها ، وأحيانًا أستخدم 5٪ ، 20٪ للخلايا المختلفة.
    لا ينبغي أن يؤدي تغيير تركيز التربسين إلى أي شيء أكثر من اللازم في رأيي ، ولكن إذا قمت بتغييره ، فأنت بحاجة إلى تغيير وقت الحضانة لفصل الخلية حتى لا تهضم خليتك.

    سيعرض التربسين بطريقة أو بأخرى مزيدًا من الضغط على الخلايا. هذا هو السبب في أننا بحاجة إلى إلغاء تنشيطه عن طريق إضافة وسائط المصل.

    تم العثور على 10 ٪ فقط على أنها الحد الأدنى المطلوب ليكون جيدًا لمعظم خطوط الخلايا (المصل باهظ الثمن - وقاسٍ أيضًا & # 33). لكن العديد من خطوط الخلايا تتطلب مصلًا أعلى ، والعديد منها يعمل بشكل جيد مع أقل. يمكنك حتى الابتعاد بدون مصل مع بعض خطوط الخلايا السرطانية باستخدام بعض المكونات الاصطناعية المضافة إلى الوسط.

    يستخدم المصل فقط كقوة ساخنة لعوامل البقاء التي لم نحددها بعد ، ولكنها مطلوبة لنمو الخلايا وبقائها على قيد الحياة.

    يتسبب التربسين في إتلاف الغشاء السيتوبلازمي ، لذلك تريد أن تبقيه عند الحد الأدنى من حيث التركيز / الحضانة ، وإخراجه على الفور بالمصل بمجرد تحقيق الغرض الخاص بك.

    10٪ سيروم. ماذا يعني هذا في الواقع؟

    من فضلك رتب الأمصال التالية بالترتيب من حيث الجودة؟

    البريطانية ، الأوروبية ، نيوزيلندا ، الأسترالية ، أمريكا الشمالية ، أمريكا الجنوبية؟

    وجهة نظري هي أن 10 ٪ من المصل من بلد المنشأ يستحق على الأرجح 70-100 ٪ من بلد آخر. هذا مرتبط أيضًا بالسعر: -

    25 جنيهًا إسترلينيًا ، 45 جنيهًا إسترلينيًا - 50 جنيهًا إسترلينيًا ، 250 جنيهًا إسترلينيًا ، 180 جنيهًا إسترلينيًا ، 120 جنيهًا إسترلينيًا ، 100 جنيه إسترليني. يرجى ملاءمة السعر لبلد المنشأ أعلاه؟

    10٪ سيروم. ماذا يعني هذا في الواقع؟

    من فضلك رتب الأمصال التالية بالترتيب من حيث الجودة؟

    البريطانية ، الأوروبية ، نيوزيلندا ، الأسترالية ، أمريكا الشمالية ، أمريكا الجنوبية؟

    وجهة نظري هي أن 10 ٪ من المصل من بلد المنشأ يستحق على الأرجح 70-100 ٪ من بلد آخر. هذا مرتبط أيضًا بالسعر: -

    25 جنيهًا إسترلينيًا ، 45 جنيهًا إسترلينيًا - 50 جنيهًا إسترلينيًا ، 250 جنيهًا إسترلينيًا ، 180 جنيهًا إسترلينيًا ، 120 جنيهًا إسترلينيًا ، 100 جنيه إسترليني. يرجى ملاءمة السعر لبلد المنشأ أعلاه؟

    أعتقد أن التسعير له علاقة بالغياب المضمون لمرض معين في بلد ما لفترة معينة من الوقت. 10٪ تعني عادة جزء FCS مضافًا إلى 9 أجزاء متوسطة. فيما يتعلق بمعايير الجودة: في رأيي ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك إمدادات ثابتة من FCS مع اختلاف بسيط في الجودة / المكونات / المصدر.

    10٪ سيروم. ماذا يعني هذا في الواقع؟

    من فضلك رتب الأمصال التالية بالترتيب من حيث الجودة؟

    البريطانية ، الأوروبية ، نيوزيلندا ، الأسترالية ، أمريكا الشمالية ، أمريكا الجنوبية؟

    وجهة نظري هي أن 10 ٪ من المصل من بلد المنشأ يستحق على الأرجح 70-100 ٪ من بلد آخر. هذا مرتبط أيضًا بالسعر: -

    25 جنيهًا إسترلينيًا ، 45 جنيهًا إسترلينيًا - 50 جنيهًا إسترلينيًا ، 250 جنيهًا إسترلينيًا ، 180 جنيهًا إسترلينيًا ، 120 جنيهًا إسترلينيًا ، 100 جنيه إسترليني. يرجى ملاءمة السعر لبلد المنشأ أعلاه؟

    أعتقد أن التسعير له علاقة بالغياب المضمون لمرض معين في بلد ما لفترة معينة من الوقت. 10٪ تعني عادة جزء FCS مضافًا إلى 9 أجزاء متوسطة. فيما يتعلق بمعايير الجودة: في رأيي ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك إمدادات ثابتة من FCS مع اختلاف بسيط في الجودة / المكونات / المصدر.

    للعلم فقط: أنت محق في أن نيوزيلندا هي الدولة الوحيدة الخالية من جنون البقر في العالم

    جودة مصل NZ هي الأفضل في العالم. نجري الاختبارات التالية:

    بقاء
    نمو
    تحريض إنزيم iNOS
    استهلاك الأوكسجين
    محتوى cGMP من RASMC
    تركيز السيتوكروم C داخل J744 و Jurkats
    حالات الأكسدة / الاختزال لمجمعات إنزيم الميتوكوندريا
    تعبير قناة الصوديوم في خلايا HEK المنقولة

    في جميع مصل NZ أعلاه متفوق على جميع أنواع السيرم الأخرى.

    أي تم التعبير عن عدد أكبر من القنوات ، وتحريض أكبر بنسبة 80٪ لـ iNOS ، واستهلاك أكبر للأكسجين ، إلخ ، إلخ.

    حتى أن هناك اختلافات بين دفعات نيوزيلندا. وبالتالي فإننا نقوم باختبار دفعي للتأكد من أن النتائج التي نحصل عليها متوافقة مع تلك التي حصلنا عليها منذ 5/10/15 عامًا.


    كواشف التربسين وتفكك الخلايا

    تُستخدم محاليل التربسين وتفكك الخلايا من الصناعات البيولوجية على نطاق واسع لإزالة الخلايا الملتصقة من سطح المزرعة. يعتمد اختيار كاشف التفكك الصحيح وتركيزه على نوع الخلية وكذلك عمر الخلايا في المزرعة. يوفر BI مجموعة متنوعة من حلول التربسين ، والتي يتم تحضيرها من مواد اختبار فيروس بارفو الخنازير واختبار المايكوبلازما ، بالإضافة إلى البدائل المحددة كيميائيًا.

    هل تبحث عن بديل خالٍ من الحيوانات؟ Recombinant Trypsin Solutions - أفضل بديل للتربسين.

    حلول التربسين المؤتلفة من BI هي عبارة عن إنزيمات محددة لتفكك الخلايا خالية من المكونات الحيوانية والتي تحل محل التربسين الخنازير وتتجنب التباين والتلوث المرتبط بالحيوان. تعتبر حلول التربسين المؤتلفة مثالية لفصل الخلايا المعتمدة على التعلق في كل من الحالات التي تحتوي على مصل وخالية من المصل ويمكن استبدالها مباشرة بالتريبسين دون تغييرات البروتوكول. تم تحسين هذه الحلول أيضًا لأنواع الخلايا الحساسة ، وهي خاصية مهمة في منع التأثيرات القاسية للمعالجة النهائية.


    بروتوكول لعزل وثقافة الخلايا الجذعية اللحمية من نخاع عظم الفأر

    نشرح بروتوكولًا للعزل المباشر وثقافة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) من نخاع عظم الفأر (BM) لتزويد الباحثين بطريقة يمكن تطبيقها في بيولوجيا الخلية وهندسة الأنسجة مع الحد الأدنى من المتطلبات. يعتمد بروتوكولنا بشكل أساسي على التغيير المتوسط ​​المتكرر في الثقافة الأولية وتقليل وقت التربسين. يتم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة للفأر بشكل عام من نضح من BM الذي يتم حصاده من مقصورات القصبة ونخاع الفخذ ، ثم يتم زراعتها في وسط باستخدام وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ومصل بقري الجنين (FBS) لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية- حاضنة 5٪ CO (2). تتم إزالة الخلايا غير المتماسكة بعناية بعد 3 ساعات ويتم استبدال الوسط الجديد. عندما تصبح الثقافات الأولية متكدسة تقريبًا ، تتم معالجة المزرعة بـ 0.5 مل من 0.25٪ تريبسين يحتوي على 0.02٪ حمض إيثيلين ديامينيتتراسيتيك لمدة دقيقتين عند درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). يمكن الحصول على مجموعة نقية من MSCs بعد 3 أسابيع من بدء الثقافة.


    شاهد الفيديو: Tissue culture migration basic (ديسمبر 2022).