معلومة

تفسير نتائج PCR في الوقت الحقيقي

تفسير نتائج PCR في الوقت الحقيقي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد أجريت عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وكنت أبحث عن تغييرات طية التعبير لجينين وكان لدي مجموعتان من العينات ، أحدهما عولج والآخر لم يعالج (لكل جين). تكمن المشكلة في أن جين التدبير المنزلي (UBQ 30) قد تغير في العلاج. إذن ما هو التفسير الصحيح ومعالجة البيانات؟

أعني ، هل من الصحيح استخدام كل عنصر تحكم وعلاج حصلت عليه لقيم UBQ CT لتطبيع الجينين الأخريين المطابقين للتصوير المقطعي المحوسب ، حيث من المتوقع ألا تتغير جينات التدبير المنزلي "بحكم التعريف"؟ (وهذا هو سبب استخدامهم للتطبيع بالفعل)

أو هل يجب أن أقوم بعمل متوسط ​​لـ UBQ CT-s بالكامل وتطبيع جميع قيم التصوير المقطعي المحوسب للجينات الأخرى بهذا الوسيلة؟


يجب أن تجرب جينًا آخر للتدبير المنزلي مثل GAPDH لأن تعريف هذه الجينات هو أنها لا ينبغي تغير مع علاجك


كما أشار آخرون ، يجب ألا يغير الجين المرجعي تعبيره بين عينات التحكم وعينات الاختبار. لا يلزم أن يكون الجين المرجعي أحد الجينات التدبيرية ؛ تستخدم جينات التدبير المنزلي بشكل عام لأنها موجودة في جميع الخلايا ولا تخضع لأي تنظيم محدد. ومع ذلك ، فإن التغيرات العالمية في الخلية ، مثل الإجهاد أو التطور ، يمكن أن تؤثر على جينات التدبير المنزلي.

عندما لا تكون متأكدًا من الجين الذي تختاره كمرجع ، يمكنك استخدام ملف ارتفاع في مراقبة.

قد يكون التغيير في تجربتك نتيجة خطأ بشري. يجب عليك تكرار التجربة لمعرفة ما إذا كان الاتجاه لا يزال كما هو. إذا أظهر الجين الخاص بك اتجاهًا ثابتًا في جميع التكرارات ، فمن غير المحتمل أن يكون التغيير بسبب خطأ بشري.

بشكل عام ، يجب عليك اختيار الجين المرجعي بناءً على معرفتك السابقة بالحالة التي تختبرها. على سبيل المثال ، إذا كنت أدرس هجرة الخلايا ، فلن أستخدم الأكتين كعنصر تحكم. إذا كنت تدرس العمليات التي قد تؤثر على معدل الأيض ، فربما لا يجب عليك استخدام GAPDH كعنصر تحكم.

الجين (الجينات) المرجعية الجيدة الأخرى التي تكون أيضًا هي المكونة للبروتين الريباسي.

ألقِ نظرة أيضًا على هذا المنشور للتحليل الإحصائي لبيانات RTPCR.


سأرمي كرة منحنى هنا. :) أعتقد أن مفهوم "التدبير المنزلي" أو "الجين المرجعي" معيب بشكل أساسي ، لأنه يقوم على منطق دائري. من أجل التحقق من أن جين "التدبير المنزلي" X ثابت عبر عيناتك ، يجب أن تفترض أن قيم $ C_t $ نفسها هي في الواقع مقياس صالح ، بحيث يمكنك تقييم مستوى التعبير X مباشرة. ولكن إذا افترضنا أن قيم $ C_t $ صحيحة ، فلن تحتاج إلى جين التدبير المنزلي في المقام الأول! هذا الإجراء يفترض ما الذي تنوي إثباته ؛ لذلك فهي دائرية.

مشكلة التطبيع ليست قابلة للحل دون افتراضات إضافية. يعمل التحكم المفاجئ إذا كنت قلقًا بشأن الاختلاف التقني ، لكنه لا يعالج التباين البيولوجي. أعتقد أن الافتراض المعقول هو أن مجموع الرنا المرسال ثابت ؛ هذا هو الأساس لمعظم طرق التطبيع المستخدمة في تحليل ميكروأري أو تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي. بالنسبة لـ RT-PCR ، يمكن اختبار هذا الافتراض باستخدام أصباغ cDNA ، كما في هذه الورقة. (الحمض النووي الريبي مفيد وليس الحمض النووي الريبي المعزول ، لأن خطوة النسخ العكسي مشهورة بالضجيج ويجب التحكم فيها.)

في رأيي ، جينات التدبير المنزلي مفيدة فقط إذا كنت تعرفها حقًا مقدما أنهم يجب كن ثابتًا ، ولا تحتاج إلى التحقق من هذا الافتراض ؛ ثم لا يكون المنطق دائريًا. في هذه الحالة ، إذا لاحظت تغيير قيم $ C_t $ لجين التدبير المنزلي ، فيجب أن تستنتج أن التجربة سارت بشكل خاطئ بطريقة ما ، ويجب التخلص من البيانات. لكنني أعتقد أن هذا نادرًا ما يحدث في الممارسة العملية.

ليس هذا هو الرأي الأكثر شيوعًا حول هذه المسألة التي غالبًا ما تكون موضع نقاش ، لكنني أعتقد أنه الرأي الصحيح. :)


تفسير نتائج RT-PCR في الوقت الحقيقي مع ضمان الجودة ومراقبة الجودة

تقدم الجلسة الثالثة من "سلسلة ندوات الوكالة الدولية للطاقة الذرية و WPRO لدعم مختبرات اختبار COVID-19 في منطقة آسيا والمحيط الهادئ" معلومات عن مبادئ ضمان الجودة ومراقبة الجودة أثناء إجراءات الاختبار في مختبرات التشخيص الجزيئي. سيناقش الجزء الثاني من الندوة عبر الإنترنت تفسير نتائج الاختبارات ، بالإضافة إلى السياق الوبائي للنتائج التي تم الحصول عليها.

  • ضمان الجودة ومراقبة الجودة لاختبار COVID-19 باستخدام RT-PCR في الوقت الفعلي
  • تفسير نتائج التضخيم: التفسير الفني لنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتفسير الوبائي.

2. هل يمكن أن يؤدي اختبار SARS-CoV-2 المستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى نتائج إيجابية خاطئة؟

في حين أن قضية السلبيات الكاذبة قد تم تناولها على نطاق واسع في الأدبيات العلمية ، فإن البيانات حول إمكانية الإيجابيات الكاذبة نادرة للغاية. ومع ذلك ، فقد سلطت دراسة ألمانية الضوء على الإيجابيات الخاطئة المرتبطة بالكواشف التجارية المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (المسابير أو قليل النوكليوتيدات) ، مع شدة تتراوح من منخفضة إلى عالية [2]. وقعت حوادث مماثلة في العديد من المختبرات الأوروبية [3]. بالمقارنة مع اختبار PCR الداخلي المرجعي ، فإن الاستنتاج التالي لتقييم اختبار PCR الأسترالي التجاري هو أن الإيجابيات الكاذبة كانت ممكنة بالفعل [4]. على الرغم من أن الاحتمالية الإجمالية تبدو منخفضة ، إلا أن عددًا كبيرًا من الاختبارات خلال فترة حدوث منخفضة نسبيًا يمكن أن يؤدي إلى موقف يكون فيه نصف الاختبارات إيجابيات خاطئة ، لا سيما في حالة وجود خلل في ضوابط الجودة الداخلية والخارجية [2] ، مثل تم توضيحه مؤخرًا من خلال تصاعد الإيجابيات الكاذبة في القسم الفرنسي (Meurthe et Moselle) التي ارتبطت بتلوث أحد الكواشف بواسطة SARS-CoV-2 RNA [5].

عرض

في حين لا يمكن استبعاد احتمال وجود إيجابية خاطئة تمامًا ، لا توجد طريقة بيولوجية قابلة للتطبيق بشكل روتيني قادرة حاليًا على فرز الأمور بشكل عملي في مواجهة نتائج اختبار SARS-CoV-2 الإيجابية المستندة إلى PCR. هذا هو السبب في أنه يجب إدارة أي وكل نتيجة إيجابية لاختبار SARS-CoV-2 المستندة إلى PCR لأنها كانت إيجابية حقيقية ومثبتة.


القياس الكمي المقارن

يتناقض نهج ΔΔCt مع تأثيرات العينة التجريبية مع جهاز المعايرة (على سبيل المثال ، عينة غير معالجة أو عينة من النوع البري) ومعاير (على سبيل المثال ، عينة من النوع البري أو غير المعالجة) (على سبيل المثال ، جين التدبير المنزلي). يتم الآن تعديل قيم Ct للجين المعني (GOI) في عينة (عينات) الاختبار وعينة المعاير فيما يتعلق بجين (عادي) Ct من نفس العينتين باستخدام هذه العملية. يتم حساب فرق الطية في التعبير باستخدام القيمة الناتجة ΔΔCt.

يتطلب نهج ΔΔCt أن يكون للجين المستهدف والجين العادي كفاءات متساوية. بالطبع ، السؤال الواضح هو: ما هو الطيف المعقول للانحراف؟ لمعرفة ذلك ، استخدم نفس العينات لبناء منحنى منتظم لكل من الجين العادي والجين المستهدف. لكل تخفيف ، يمكن حساب متوسط ​​Ct بين الجين العادي والجين المستهدف. ما يهم هو استمرارية القيمة من خلال كل تخفيف ، وليس القيمة نفسها.

يتم استخدام تناقض Ct بين الجين المستهدف في الاختبار وعينات المعايرة في نظام المنحنى التقليدي للقياس الكمي المقارن ، والذي يتم تطبيعه لقيم الجين المرجعي Ct ويتم تصحيحه للاختلافات الدقيقة في جودة التضخيم. يتطلب هذا النهج منحنى قياسيًا لحساب كفاءة التضخيم لكل من المقيِّم والجين المعني ، لكنه يتجنب الافتراضات التي قدمتها التقنيات السابقة. يجب أن يكون جين التطبيع هو نفسه لجميع العينات في الدراسة حتى يعمل هذا النهج.


تفسير نتائج qRTPCR النسبية - الرجاء المساعدة (يوليو / 30/2008)

تحية للجميع
لقد كنت أفعل Sybr Green في الوقت الحقيقي. أستخدم طريقة deltadeltaCt لحساب الاختلافات بين عينات العلاج الخاصة بي والتحكم بعد التطبيع باستخدام جين التدبير المنزلي. مشكلتي في تفسير النتائج.

عندما أستخدم برنامج excel للتحكم الخاص بي والجين المستهدف ، فإنني آخذ قيمتين للعامل 2 ^ - & # 916 & # 916Ct.
سيطرتي هو 1،021012126
وهدفي هو 0.615572207

هذا يعني أنه إذا كانت السيطرة 100٪ فإن الهدف هو

60%.
هل هذا يعني أن الجين المستهدف الخاص بي خاضع للتنظيم

نعم ، يمنحك 2 ^ -deltadeltaCt RQ وهي الكمية النسبية للتسلسل المستهدف الحالي.

تحية للجميع
لقد كنت أفعل Sybr Green في الوقت الحقيقي. أستخدم طريقة deltadeltaCt لحساب الاختلافات بين عينات العلاج الخاصة بي والتحكم بعد التطبيع باستخدام جين التدبير المنزلي. مشكلتي في تفسير النتائج.

عندما أستخدم برنامج excel للتحكم الخاص بي والجين المستهدف ، فإنني آخذ قيمتين للعامل 2 ^ - & # 916 & # 916Ct.
سيطرتي هو 1،021012126
وهدفي هو 0.615572207

هذا يعني أنه إذا كانت السيطرة 100٪ فإن الهدف هو

60%.
هل هذا يعني أن الجين المستهدف الخاص بي خاضع للتنظيم

في الواقع هذا لا يعني أي شيء. لا يمكنك قول أي شيء عن بُعد بالتأكيد عند المقارنة بجين واحد فقط للتدبير المنزلي. قد يعني ذلك أن هذا الجين التدبير المنزلي الخاص تم تنظيمه وفقًا لظروفك ، أو أن الجين المستهدف الخاص بك يتم تقليله جزئيًا وأن الجين المختار للتدبير المنزلي يتم تعديله جزئيًا.
يجب عليك استخدام 3 جينات التدبير المنزلي.

شكرا لكما على الرد & # 33

اسمحوا لي أن أكون أكثر تحديدًا: لدي عينتان. 1 من سيطرة صحية و 1 من مريض. لقد قمت بمعالجتها ثم حصلت على 1 (كدنا) من التحكم الصحي وواحد من المريض ، تم تحضيره من نفس الكمية من الحمض النووي الريبي.
ثم أقوم بعمل pcr في الوقت الفعلي (كل تفاعل يتم تشغيله ثلاث نسخ) وأستخدم أيضًا بعض التخفيفات من (كدنا).
أستخدم GAPDH في التحكم الصحي و GAPDH في المريض كمجموعة تحكم. (2 ردود الفعل).
والجين المستهدف في التحكم الصحي والجين المستهدف في المريض. (2 تفاعلات أخرى).
عندما أضع Ct & # 39s على ملف Excel ، أحصل على الأرقام التي ذكرتها من قبل لعامل 2 ^ DDct.

أعلم أن النتيجة قد لا تكون ذات دلالة إحصائية أو ذات دلالة بيولوجية (حتى الآن)
ولكن هل أفسرها بشكل صحيح عندما أقول إن الجين المستهدف في المريض خاضع للتنظيم بنسبة 40٪ مقارنة بالجين المستهدف في التحكم الصحي؟

نعم ، هذا هو التفسير الصحيح. سيكون المزيد من جينات التدبير المنزلي أمرًا جيدًا ، بالطبع ، ولكن بعد ذلك ، إذا لم تلاحظ تغييرًا في جين التدبير المنزلي الذي تستخدمه الآن بين الظروف التجريبية ، وحصلت على طريقة جيدة لتقدير كمية الحمض النووي الريبي من البداية ، على الأقل أنا تعتقد أنه يمكنك الانتظار باستخدام 3 HKG: s. حظا طيبا وفقك الله.

هل تحققت من تشابه كفاءة التضخيم بين هدفك والمرجع؟


محتويات

تنظم الخلايا في جميع الكائنات الحية التعبير الجيني عن طريق دوران نسخ الجينات (الحمض النووي الريبي المنفرد الذي تقطعت به السبل): يمكن قياس كمية الجين المعبر عنه في الخلية بعدد نسخ نسخة الحمض النووي الريبي لهذا الجين الموجودة في العينة. من أجل الكشف بقوة عن التعبير الجيني وتحديد كمية التعبير الجيني من كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي ، فإن تضخيم نسخة الجين ضروري. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو طريقة شائعة لتضخيم الحمض النووي لـ PCR القائم على RNA ، يتم نسخ عينة RNA أولاً إلى DNA التكميلي (cDNA) مع النسخ العكسي.

من أجل تضخيم كميات صغيرة من الحمض النووي ، يتم استخدام نفس المنهجية كما في PCR التقليدي باستخدام قالب DNA ، زوج واحد على الأقل من البادئات المحددة ، ديوكسي ريبونوكليوتيدات ، محلول عازل مناسب وبوليميراز DNA مستقر حراريًا. تتم إضافة مادة مميزة بفلوروفور إلى هذا الخليط في دورة حرارية تحتوي على مستشعرات لقياس تألق الفلوروفور بعد أن يتم تحفيزها بالطول الموجي المطلوب مما يسمح بقياس معدل التوليد لواحد أو أكثر من المنتجات المحددة. يسمح ذلك بقياس معدل توليد المنتج المضخم في كل دورة PCR. يمكن تحليل البيانات الناتجة عن طريق برامج الكمبيوتر لحسابها التعبير الجيني النسبي (أو رقم نسخة مرنا) في عدة عينات. يمكن أيضًا تطبيق PCR الكمي لاكتشاف وقياس الحمض النووي في العينات لتحديد وجود ووفرة تسلسل DNA معين في هذه العينات. [3] يتم إجراء هذا القياس بعد كل دورة تضخيم ، وهذا هو سبب تسمية هذه الطريقة بـ PCR في الوقت الحقيقي (أي PCR الفوري أو المتزامن). في حالة تقدير الحمض النووي الريبي ، يكون القالب عبارة عن DNA تكميلي (cDNA) ، يتم الحصول عليه عن طريق النسخ العكسي للحمض النووي الريبي (RNA). في هذه الحالة ، تكون التقنية المستخدمة هي RT-PCR الكمي أو Q-RT-PCR.

PCR الكمي و ميكروأري الحمض النووي هي منهجيات حديثة لدراسة التعبير الجيني. تم استخدام الطرق القديمة لقياس وفرة الرنا المرسال: العرض التفاضلي ، مقايسة حماية RNase واللطخة الشمالية. غالبًا ما يستخدم النشاف الشمالي لتقدير مستوى التعبير عن الجين من خلال تصور وفرة نسخة mRNA الخاصة به في عينة. في هذه الطريقة ، يتم فصل الحمض النووي الريبي المنقى عن طريق الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز ، ونقله إلى مصفوفة صلبة (مثل غشاء نايلون) ، وفحصه باستخدام مسبار DNA أو RNA محدد مكمل للجين المعني. على الرغم من أن هذه التقنية لا تزال تستخدم لتقييم التعبير الجيني ، إلا أنها تتطلب كميات كبيرة نسبيًا من الحمض النووي الريبي وتوفر فقط معلومات نوعية أو شبه كمية لمستويات الرنا المرسال. [4] يمكن أن تكون أخطاء التقدير الناتجة عن الاختلافات في طريقة القياس الكمي نتيجة لسلامة الحمض النووي وكفاءة الإنزيم والعديد من العوامل الأخرى. لهذا السبب تم تطوير عدد من أنظمة التقييس (تسمى غالبًا طرق التطبيع). تم تطوير بعضها لقياس التعبير الجيني الكلي ، ولكن الأكثر شيوعًا يهدف إلى تحديد الجين المحدد الذي تتم دراسته فيما يتعلق بجين آخر يسمى الجين الطبيعي ، والذي يتم اختياره لمستوى تعبيره الثابت تقريبًا. غالبًا ما يتم اختيار هذه الجينات من جينات التدبير المنزلي لأن وظائفها المتعلقة بالبقاء الخلوي الأساسي تتضمن عادةً التعبير الجيني التأسيسي. [5] [6] يتيح ذلك للباحثين الإبلاغ عن نسبة للتعبير عن الجينات محل الاهتمام مقسومة على تعبير المقياس المحدد ، مما يسمح بمقارنة الأول دون معرفة المستوى المطلق للتعبير.

أكثر جينات التطبيع شيوعًا هي تلك التي ترمز للجزيئات التالية: التوبولين ، نازع هيدروجين الغليسيرالديهيد -3 فوسفات ، الألبومين ، السيكلوفيلين ، والحمض النووي الريبي الريبوسومي. [4]

يتم تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي في جهاز تدوير حراري مع القدرة على إضاءة كل عينة بحزمة من الضوء بطول موجي واحد محدد على الأقل واكتشاف التألق المنبعث من الفلوروفور المثير. كما أن جهاز التدوير الحراري قادر على تسخين العينات وتبريدها بسرعة ، وبالتالي الاستفادة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية للأحماض النووية وبوليميراز الحمض النووي.

تتكون عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل عام من سلسلة من التغيرات في درجات الحرارة تتكرر 25-50 مرة. تتكون هذه الدورات عادةً من ثلاث مراحل: الأولى ، عند حوالي 95 درجة مئوية ، تسمح بفصل السلسلة المزدوجة للحمض النووي ، والثانية ، عند درجة حرارة حوالي 50-60 درجة مئوية ، تسمح بربط المواد الأولية بقالب الحمض النووي [7] والثالث ، عند درجة حرارة تتراوح بين 68-72 درجة مئوية ، يسهل البلمرة التي يتم إجراؤها بواسطة بوليميراز الحمض النووي. نظرًا لصغر حجم الأجزاء ، يتم عادةً حذف الخطوة الأخيرة في هذا النوع من تفاعل البوليميراز المتسلسل لأن الإنزيم قادر على تكرار أمبليكون الحمض النووي أثناء التغيير بين مرحلة المحاذاة ومرحلة تغيير الطبيعة. بالإضافة إلى ذلك ، في أربع خطوات PCR ، يتم قياس التألق خلال مراحل درجة الحرارة القصيرة التي لا تدوم سوى بضع ثوانٍ في كل دورة ، مع درجة حرارة ، على سبيل المثال ، 80 درجة مئوية ، من أجل تقليل الإشارة الناتجة عن وجود ثنائيات التمهيدي عند استخدام صبغة غير محددة. [8] درجات الحرارة والتوقيتات المستخدمة لكل دورة تعتمد على مجموعة متنوعة من المعلمات ، مثل: الإنزيم المستخدم لتخليق الحمض النووي ، وتركيز الأيونات ثنائية التكافؤ و deoxyribonucleotides (dNTPs) في التفاعل ودرجة حرارة الترابط في الاشعال. [9]

يمكن تصنيف تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي من خلال الكيمياء المستخدمة لاكتشاف منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو الفلوروكروميات المحددة أو غير المحددة.

الكشف غير المحدد: تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي مع أصباغ ربط الحمض النووي مزدوجة الشريطة أثناء تحرير المراسلين

ترتبط الصبغة المرتبطة بالحمض النووي بكل DNA مزدوج الشريطة (ds) في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، مما يزيد من عائد الكم الفلوري للصبغة. وبالتالي تؤدي الزيادة في منتج الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى زيادة شدة التألق المقاسة في كل دورة. ومع ذلك ، فإن أصباغ dsDNA مثل SYBR Green سوف ترتبط بجميع منتجات dsDNA PCR ، بما في ذلك منتجات PCR غير المحددة (مثل Primer dimer). يمكن أن يتداخل هذا مع المراقبة الدقيقة لتسلسل الهدف المقصود أو يمنعه.

في الوقت الحقيقي PCR مع أصباغ dsDNA ، يتم تحضير التفاعل كالمعتاد ، مع إضافة صبغة dsDNA الفلورية. ثم يتم تشغيل التفاعل في أداة PCR في الوقت الفعلي ، وبعد كل دورة ، يتم قياس شدة التألق باستخدام كاشف ، تتألق الصبغة فقط عند ربطها بـ dsDNA (أي منتج PCR). تتميز هذه الطريقة بأنها تحتاج فقط إلى زوج من البادئات لإجراء التضخيم ، مما يحافظ على انخفاض التكاليف ، ويمكن مراقبة تسلسلات متعددة الهدف في أنبوب باستخدام أنواع مختلفة من الأصباغ.

كشف محدد: تحرير طريقة التحقيق مراسل الفلورسنت

تكتشف مجسات المراسل الفلوريسنت فقط الحمض النووي الذي يحتوي على التسلسل المكمل للمسبار ، وبالتالي فإن استخدام مسبار المراسل يزيد الخصوصية بشكل كبير ، ويمكن من أداء التقنية حتى في وجود dsDNA أخرى. باستخدام الملصقات ذات الألوان المختلفة ، يمكن استخدام مجسات الفلورسنت في فحوصات تعدد الإرسال لرصد عدة تسلسلات مستهدفة في نفس الأنبوب. تمنع خصوصية تحقيقات مراسل الفلورسنت أيضًا تداخل القياسات التي تسببها ثنائيات التمهيدي ، وهي منتجات ثانوية محتملة غير مرغوب فيها في تفاعل البوليميراز المتسلسل. ومع ذلك ، لا تمنع تحقيقات مراسل الفلورسنت التأثير المثبط لثنائيات التمهيدي ، مما قد يقلل من تراكم المنتجات المرغوبة في التفاعل.

تعتمد الطريقة على مسبار قائم على الحمض النووي مع مراسل الفلورسنت في أحد طرفيه ومخمد الفلورة في الطرف الآخر من المسبار. إن القرب الوثيق للمراسل من المخمد يمنع الكشف عن الانهيار الفلوري للمسبار بواسطة نشاط نوكلياز خارجي 5 'إلى 3' من Taq polymerase يكسر القرب المراسل ، وبالتالي يسمح بانبعاث الفلورة غير المروي ، والذي يمكن اكتشافه بعد الإثارة بالليزر. تؤدي الزيادة في المنتج الذي يستهدفه مسبار المراسل في كل دورة PCR إلى زيادة متناسبة في التألق بسبب انهيار المسبار وإطلاق المراسل.

  1. يتم تحضير PCR كالمعتاد (انظر PCR) ، ويتم إضافة مسبار المراسل.
  2. عندما يبدأ التفاعل ، خلال مرحلة التلدين من PCR ، يصلب كل من المسبار والبرايمر إلى هدف الحمض النووي.
  3. تبدأ بلمرة خيط DNA جديد من البادئات ، وبمجرد وصول البوليميراز إلى المسبار ، فإن نوكلياز 5'-3'-exonuclease الخاص به يحط من المسبار ، ويفصل فعليًا مراسل الفلورسنت عن المبرد ، مما يؤدي إلى زيادة التألق.
  4. يتم الكشف عن الإسفار وقياسه في آلة PCR في الوقت الفعلي ، ويتم استخدام الزيادة الهندسية المقابلة للزيادة الأسية للمنتج لتحديد دورة القياس الكمي (Cف) في كل رد فعل.

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي بتحديد أجزاء محددة ومضخمة من الحمض النووي باستخدام تحليل درجة حرارة انصهارها (تسمى أيضًا تيم القيمة ، من مإلتنج رإمبيراتور). الطريقة المستخدمة هي عادة تفاعل البوليميراز المتسلسل مع أصباغ ربط الحمض النووي مزدوجة الشريطة كمراسلين ، وعادة ما تكون الصبغة المستخدمة هي SYBR Green. درجة حرارة انصهار الحمض النووي خاصة بالجزء المتضخم. يتم الحصول على نتائج هذه التقنية من خلال مقارنة منحنيات التفكك لعينات الحمض النووي التي تم تحليلها. [11]

على عكس PCR التقليدي ، تتجنب هذه الطريقة الاستخدام السابق لتقنيات الرحلان الكهربائي لإظهار نتائج جميع العينات. هذا لأنه ، على الرغم من كونه تقنية حركية ، يتم تقييم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي عادةً عند نقطة نهاية مميزة. لذلك فإن هذه التقنية تقدم نتائج أسرع و / أو تستخدم مواد تفاعلية أقل من الرحلان الكهربي. إذا كان الرحلان الكهربي اللاحق مطلوبًا ، فمن الضروري فقط اختبار تلك العينات التي أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أنه مشكوك فيه و / أو التصديق على نتائج العينات التي تم اختبارها إيجابية لعامل محدد.

تحرير النمذجة

على عكس نقطة النهاية PCR (PCR التقليدية) ، يسمح PCR في الوقت الفعلي بمراقبة المنتج المطلوب في أي نقطة في عملية التضخيم عن طريق قياس التألق (في الإطار الزمني الحقيقي ، يتم قياس مستواه على عتبة معينة). تعتمد طريقة شائعة الاستخدام لتقدير الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي على رسم التألق مقابل عدد الدورات على مقياس لوغاريتمي. يتم تعيين عتبة للكشف عن مضان قائم على الحمض النووي 3-5 مرات من الانحراف المعياري لضوضاء الإشارة فوق الخلفية. يسمى عدد الدورات التي يتجاوز فيها التألق العتبة دورة العتبة (Cر) أو وفقًا لإرشادات MIQE ، دورة القياس الكمي (Cف). [12]

خلال مرحلة التضخيم الأسي ، تضاعف كمية قالب الحمض النووي المستهدف (amplicon) كل دورة. على سبيل المثال ، عينة الحمض النووي التي يكون Cف يسبق عينة أخرى بثلاث دورات تحتوي على 2 3 = 8 مرات قالب أكثر. ومع ذلك ، فإن كفاءة التضخيم غالبًا ما تكون متغيرة بين الاشعال والقوالب. لذلك ، يتم تقييم كفاءة مزيج القالب التمهيدي في تجربة معايرة مع التخفيفات التسلسلية لقالب الحمض النووي لإنشاء منحنى قياسي للتغيير في (Cف) مع كل تخفيف. ثم يتم استخدام منحدر الانحدار الخطي لتحديد كفاءة التضخيم ، والتي تكون 100٪ إذا أدى التخفيف بنسبة 1: 2 إلى (C).ف) اختلاف 1. تقوم طريقة عتبة الدورة بعمل افتراضات عديدة لآلية التفاعل وتعتمد على البيانات من المناطق منخفضة الإشارة إلى الضوضاء لملف التضخيم الذي يمكن أن يؤدي إلى تباين كبير أثناء تحليل البيانات. [13]

لتقدير التعبير الجيني ، فإن (Cف) للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من الجين المعني من (جف) من RNA / DNA من جين التدبير المنزلي في نفس العينة للتطبيع للتغير في كمية ونوعية الحمض النووي الريبي بين العينات المختلفة. يُطلق على إجراء التطبيع هذا عادةً اسم Δ جر-طريقة [14] ويسمح بمقارنة التعبير عن الجين محل الاهتمام بين عينات مختلفة. ومع ذلك ، لمثل هذه المقارنة ، يجب أن يكون التعبير عن الجين المرجعي الطبيعي متشابهًا جدًا في جميع العينات. لذلك فإن اختيار جين مرجعي يستوفي هذا المعيار له أهمية كبيرة ، وغالبًا ما يكون صعبًا ، لأن عددًا قليلاً جدًا من الجينات يظهر مستويات متساوية من التعبير عبر مجموعة من الظروف أو الأنسجة المختلفة. [15] [16] على الرغم من دمج تحليل عتبة الدورة مع العديد من أنظمة البرمجيات التجارية ، إلا أن هناك طرقًا أكثر دقة وموثوقية لتحليل بيانات ملف تعريف التضخيم التي يجب أخذها في الاعتبار في الحالات التي تكون فيها إمكانية التكاثر مصدر قلق. [13]

كما تم اقتراح طرق القياس الكمي القائمة على الآلية qPCR ، وتتمتع بميزة أنها لا تتطلب منحنى قياسيًا للتقدير الكمي. تم إثبات أن طرق مثل MAK2 [17] لها أداء كمي مساوٍ أو أفضل لطرق المنحنى القياسية. تستخدم هذه الأساليب القائمة على الآلية المعرفة حول عملية تضخيم البوليميراز لتوليد تقديرات لتركيز العينة الأصلي. يتضمن امتداد هذا النهج نموذجًا دقيقًا لملف تعريف تفاعل PCR بالكامل ، والذي يسمح باستخدام بيانات إشارة إلى ضوضاء عالية والقدرة على التحقق من جودة البيانات قبل التحليل. [13]

وفقًا لبحث Ruijter et al. [18] يفترض MAK2 كفاءة تضخيم ثابتة أثناء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. ومع ذلك ، فقد كشف التحليل النظري لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، الذي اشتُق منه MAK2 ، أن كفاءة التضخيم ليست ثابتة طوال تفاعل البوليميراز المتسلسل. بينما يوفر التقدير الكمي لـ MAK2 تقديرات موثوقة لتركيز الحمض النووي المستهدف في عينة في ظل ظروف qPCR العادية ، فإن MAK2 لا يحدد بشكل موثوق التركيز المستهدف لفحوصات qPCR باستخدام أجهزة قياس المنافسة.

هناك العديد من التطبيقات لتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في المختبر. يتم استخدامه بشكل شائع لكل من الأبحاث التشخيصية والأساسية. تشمل استخدامات هذه التقنية في الصناعة تقدير الحمل الميكروبي في الأطعمة أو المواد النباتية ، واكتشاف الكائنات المعدلة وراثيًا (الكائنات المعدلة وراثيًا) وتحديد الكميات والتنميط الجيني لمسببات الأمراض الفيروسية البشرية.

التحديد الكمي للتعبير الجيني تحرير

لا يمكن الاعتماد على القياس الكمي للتعبير الجيني عن طريق طرق اكتشاف الحمض النووي التقليدية. لا يسمح الكشف عن الرنا المرسال على لطخة شمالية أو منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على مادة هلامية أو لطخة جنوبية بالقياس الكمي الدقيق. [19] على سبيل المثال ، على مدى 20-40 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل النموذجي ، تصل كمية منتج الحمض النووي إلى هضبة لا ترتبط ارتباطًا مباشرًا بكمية الحمض النووي الهدف في تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي. [20]

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لتقدير الأحماض النووية بطريقتين شائعتين: القياس الكمي النسبي والتقدير الكمي المطلق. [21] يعطي التقدير الكمي المطلق العدد الدقيق لجزيئات الحمض النووي المستهدفة بالمقارنة مع معايير الحمض النووي باستخدام منحنى المعايرة. لذلك من الضروري أن يكون PCR للعينة والمعيار لهما نفس كفاءة التضخيم. [22] يعتمد التقدير الكمي النسبي على جينات مرجعية داخلية لتحديد اختلافات أضعاف في التعبير عن الجين المستهدف. يتم التعبير عن التقدير الكمي على أنه التغيير في مستويات التعبير عن الرنا المرسال يتم تفسيره على أنه الحمض النووي التكميلي (كدنا ، الناتج عن النسخ العكسي لمنا الرنا المرسال). من الأسهل إجراء القياس الكمي النسبي لأنه لا يتطلب منحنى معايرة حيث تتم مقارنة كمية الجين المدروس بكمية الجين المرجعي الضبط.

نظرًا لأن الوحدات المستخدمة للتعبير عن نتائج القياس الكمي النسبي غير مهمة ، يمكن مقارنة النتائج عبر عدد من RTqPCR المختلفة. السبب في استخدام واحد أو أكثر من جينات التدبير المنزلي هو تصحيح التباين غير المحدد ، مثل الاختلافات في كمية ونوعية الحمض النووي الريبي المستخدم ، والتي يمكن أن تؤثر على كفاءة النسخ العكسي وبالتالي كفاءة عملية PCR بأكملها. ومع ذلك ، فإن الجانب الأكثر أهمية في العملية هو أن الجين المرجعي يجب أن يكون مستقرًا. [23]

تم اختيار هذه الجينات المرجعية تقليديًا في البيولوجيا الجزيئية باستخدام الدراسات النوعية أو شبه الكمية مثل الفحص البصري للمواد الهلامية RNA أو قياس كثافة البقعة الشمالية أو PCR شبه الكمي (تقليد PCR). الآن ، في عصر الجينوم ، من الممكن إجراء تقدير أكثر تفصيلاً للعديد من الكائنات الحية باستخدام تقنيات النسخ. [24] ومع ذلك ، فقد أظهر البحث أن تضخيم غالبية الجينات المرجعية المستخدمة في قياس التعبير عن الرنا المرسال يختلف باختلاف الظروف التجريبية. [25] [26] [27] لذلك من الضروري إجراء دراسة منهجية أولية سليمة إحصائيًا من أجل اختيار الجين المرجعي الأنسب.

تم تطوير عدد من الخوارزميات الإحصائية التي يمكنها اكتشاف الجين أو الجينات الأكثر ملاءمة للاستخدام في ظل ظروف معينة. يمكن لمن هم مثل geNORM أو BestKeeper مقارنة الأزواج أو الوسائل الهندسية لمصفوفة من الجينات والأنسجة المرجعية المختلفة. [28] [29]

يستخدم التشخيص تحرير

يتم تطبيق PCR النوعي التشخيصي للكشف السريع عن الأحماض النووية التي يتم تشخيصها ، على سبيل المثال ، الأمراض المعدية والسرطان والتشوهات الجينية. أدى إدخال مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) النوعية إلى مختبر الأحياء الدقيقة السريرية إلى تحسين تشخيص الأمراض المعدية بشكل كبير ، [30] وتم نشره كأداة للكشف عن الأمراض الناشئة حديثًا ، مثل سلالات جديدة من الأنفلونزا وفيروس كورونا ، [31] في الاختبارات التشخيصية . [32] [33]

الاستخدامات الميكروبيولوجية

يستخدم PCR الكمي أيضًا من قبل علماء الأحياء الدقيقة العاملين في مجالات سلامة الأغذية وتلف الأغذية والتخمير ولتقييم المخاطر الميكروبية لجودة المياه (مياه الشرب والاستجمام) وفي حماية الصحة العامة. [34]

يمكن أيضًا استخدام qPCR لتضخيم العلامات التصنيفية أو الوظيفية للجينات في الحمض النووي المأخوذة من العينات البيئية. [35] يتم تمثيل العلامات بواسطة الأجزاء الجينية من الحمض النووي أو الحمض النووي التكميلي. [35] من خلال تضخيم عنصر لطيف معين ، يمكن تحديد كمية العنصر في العينة قبل التضخيم. [35] يمكن أن يساعد استخدام الواسمات التصنيفية (الجينات الريبوزومية) و qPCR في تحديد كمية الكائنات الحية الدقيقة في العينة ، ويمكنها تحديد العائلات أو الأجناس أو الأنواع المختلفة بناءً على خصوصية العلامة. [35] يمكن أن يُظهر استخدام الواسمات الوظيفية (جينات ترميز البروتين) التعبير الجيني داخل المجتمع ، مما قد يكشف عن معلومات حول البيئة. [35]

الكشف عن مسببات الأمراض النباتية تحرير

تسعى الصناعة الزراعية باستمرار إلى إنتاج بذور نباتية أو شتلات خالية من مسببات الأمراض من أجل منع الخسائر الاقتصادية والحفاظ على الصحة. تم تطوير أنظمة تسمح باكتشاف كميات صغيرة من الحمض النووي لـ فيتوفثورا راموروم، وهو نوع من الفطريات يقتل البلوط والأنواع الأخرى ، ويختلط مع الحمض النووي للنبات المضيف. يعتمد التمييز بين الحمض النووي للعامل الممرض والنبات على تضخيم متواليات أنظمة النقل الذكية ، الفواصل الموجودة في منطقة ترميز الجين الريبوزومي RNA ، والتي تعتبر مميزة لكل تصنيف. [36] كما تم تطوير إصدارات ميدانية من هذه التقنية لتحديد نفس العامل الممرض. [37]

الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا تحرير

يمكن استخدام qPCR باستخدام النسخ العكسي (RT-qPCR) للكشف عن الكائنات المعدلة وراثيًا نظرًا لحساسيتها ونطاقها الديناميكي في اكتشاف الحمض النووي. عادة ما تكون البدائل مثل تحليل الحمض النووي أو البروتين أقل حساسية. يتم استخدام مواد أولية محددة لا تضخم الجين المحور ولكن المحفز أو المنهي أو حتى المتواليات الوسيطة المستخدمة أثناء عملية هندسة المتجه. نظرًا لأن عملية إنشاء نبات معدّل وراثيًا يؤدي عادةً إلى إدخال أكثر من نسخة واحدة من الجين المحول ، يتم أيضًا تقييم كميته بشكل شائع. يتم تنفيذ ذلك غالبًا عن طريق القياس الكمي النسبي باستخدام جين تحكم من الأنواع المعالجة والذي يوجد فقط كنسخة واحدة. [38] [39]

الكمي السريري وتحرير التنميط الجيني

يمكن أن توجد الفيروسات في البشر بسبب العدوى المباشرة أو العدوى المشتركة مما يجعل التشخيص صعبًا باستخدام التقنيات التقليدية ويمكن أن يؤدي إلى تشخيص وعلاج غير صحيحين. يسمح استخدام qPCR بكل من القياس الكمي والتنميط الجيني (توصيف السلالة ، التي يتم إجراؤها باستخدام منحنيات الانصهار) لفيروس مثل فيروس التهاب الكبد B. [40] درجة العدوى ، التي يتم قياسها كنسخ من الجينوم الفيروسي لكل وحدة من أنسجة المريض ، ذات صلة في كثير من الحالات ، على سبيل المثال ، يرتبط احتمال إعادة تنشيط فيروس الهربس البسيط من النوع 1 بعدد الخلايا العصبية المصابة في العقد. [41] يتم إجراء هذا القياس الكمي إما بالنسخ العكسي أو بدونه ، كما يحدث إذا أصبح الفيروس مندمجًا في الجينوم البشري في أي مرحلة من دورته ، كما يحدث في حالة فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) (فيروس الورم الحليمي البشري) ، حيث ترتبط أشكاله المختلفة بظهور سرطان عنق الرحم. [42] Real-time PCR has also brought the quantization of human cytomegalovirus (CMV) which is seen in patients who are immunosuppressed following solid organ or bone marrow transplantation. [43]


Tools for Real-Time RT-PCR

Ambion’s MessageSensor™ RT Kit includes an RNase H+ MMLV RT that clearly outperforms MMLV RT enzymes that have abolished RNase H activity in real-time RT-PCR experiments. Unlike many other qRT-PCR kits, MessageSensor includes a total RNA control, a control human GAPDH primer set, RNase inhibitor, and nucleotides, as well as a buffer additive that enables detection with SYBR® Green dye.

The Cells-to-cDNA™ II Kit produces cDNA from cultured mammalian cells in less than 2 hours. No RNA isolation is required. This kit is ideal for those who want to perform reverse transcription reactions on small numbers of cells, numerous cell samples, or for scientists who are unfamiliar with RNA isolation. Ambion's Cells-to-cDNA II Kit contains a novel Cell Lysis Buffer that inactivates endogenous RNases without compromising downstream enzymatic reactions. After inactivation of RNases, the cell lysate can be directly added to a cDNA synthesis reaction. Cells-to-cDNA II is compatible with both one-step and two-step real-time RT-PCR protocols.

Genomic DNA contamination can lead to false positive RT-PCR results. Ambion offers a variety of tools for eliminating genomic DNA contamination from RNA samples prior to RT-PCR. Ambion’s DNA-free™ DNase Treatment and Removal Reagents are designed for removing contaminating DNA from RNA samples and for the removal of DNase after treatment without Proteinase K treatment and organic extraction. In addition, Ambion has also developed TURBO™ DNase, a hyperactive enzyme engineered from wild-type bovine DNase. The proficiency of TURBO DNase in binding very low concentrations of DNA means that the enzyme is particularly effective in removing trace quantities of DNA contamination.

Ambion now also offers an economical alternative to the high cost of PCR reagents for the ABI 7700 and other 0.2 ml tube-based real-time instruments. SuperTaq™ Real-Time performs as well or better than the more expensive alternatives, and includes dNTPs and a Reaction Buffer optimized for SYBR Green, TaqMan, and Molecular Beacon chemistries.


Este mismo principio de amplificación de PCR se emplea en PCR en tiempo real. Pero en lugar de mirar las bandas en un gel al final de la reacción, el proceso se monitorea en “tiempo real”. La reacción se coloca en una máquina de PCR en tiempo real que observa cómo ocurre la reacción con una cámara o detector.

Aunque se utilizan muchas técnicas diferentes para controlar el progreso de una reacción de PCR, todas tienen una cosa en común. Todos ellos vinculan la amplificación del ADN con la generación de fluorescencia que puede detectarse simplemente con una cámara durante cada ciclo de PCR. Por lo tanto, a medida que aumenta el número de copias de genes durante la reacción, también lo hace la fluorescencia, lo que indica el progreso de la reacción.


Consideration of the Cycle Threshold Values from Real-Time RT-PCR SARS-CoV-2 Interpretation for the Clinicians: Analysis of 339 Positive Cases from a Referral Laboratory in Jakarta, Indonesia

خلفية: real-time RT-PCR was recommended by WHO for COVID-19 diagnosis. The cycle threshold (Ct) values were expected to have an association with clinical manifestation. However, the diagnostic modalities such as quantitative molecular detection and virus isolation were not yet available for the routine test. This study has been conducted to analyze the relationship between the Ct values of qualitative rRT-PCR and the clinical manifestation and to describe the factors determining the result.

أساليب: from March to April 2020, specimens were sent to our laboratory from different healthcare centers in Jakarta. The patient's characteristic and clinical manifestation were extracted from the specimen's epidemiology forms. The specimens extracted and tested using rRT-PCR, and the Ct value were collected. The data were analyzed using the appropriate statistic test.

نتائج: from 339 positive results, the mild to moderate case was 176 (52%) and the severe cases was 163 (48%). Female was dominant in the mild to moderate cases (58%), while the male was prevalent in the severe cases (60%). The median age for mild to moderate case was 35 years old and severe cases was 49 years old. Statistical analysis found relationship between both group with gender (p = 0.001) and age (p < 0.001), but not with the Ct value.

استنتاج: many variables in specimen sampling and processing could affect the Ct value result. In addition, the disease's severity was depended with the host immune response, regardless the number of virus. There was suggested no significant difference between the Ct values of mild-moderate and severe COVID-19, and thus should not be loosely interpreted.

الكلمات الدالة: Cycle Threshold SARS-Cov-2 clinical interpretation rRT-PCR.


الحواشي

Author contributorship: JW JB and PW contributed to the conception of the work, JW ran the searches and wrote the first draft of the paper with assistance from JB. PW developed the tools for fig 2. JB, JW, and PW all contributed to the revised drafts of the paper and approved the final version for submission.

Acknowledgments: The authors would like to acknowledge Jon Deeks for helpful discussions at an early point in writing this article and Richard Lehman for suggestions and comments on a draft of this article.

تضارب المصالحBMJ has judged that there are no disqualifying financial ties to commercial companies. The authors declare the following other interests: JB has given Grand Rounds talks on medical reasoning and has published a book The Science of the Art of Medicine: A Guide to Medical Reasoning for which he receives royalties. JW has no competing interests to declare.

Funding: JW is funded by a doctoral research fellowship from the National Institute for Health Research. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, the National Institute for Health Research, Health Education England, or the Department of Health.

Patient consent: The cases in this article are fictitious and therefore no consent was needed.

Provenance and peer review: Commissioned, based on an idea from the author externally peer reviewed.

This article is made freely available for use in accordance with BMJ's website terms and conditions for the duration of the covid-19 pandemic or until otherwise determined by BMJ. You may use, download and print the article for any lawful, non-commercial purpose (including text and data mining) provided that all copyright notices and trade marks are retained.


شاهد الفيديو: ماذا تعني قيمة دورة العتبة في فحص تفاعل البوليميراز المتسلسلSignificance of CT value in COVID19 PCR (ديسمبر 2022).