معلومة

المعمل 5: وصمة عار مباشرة وصمة عار غير مباشرة - علم الأحياء

المعمل 5: وصمة عار مباشرة وصمة عار غير مباشرة - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أ.مقدمة عن تلطيخ

نقاش

في مختبرنا ، يمكن فحص مورفولوجيا البكتيريا (الشكل والهيكل) بطريقتين:

  • من خلال مراقبة الكائنات الحية غير الملوثة (الجبل الرطب) ، أو
  • من خلال مراقبة الكائنات الحية الملطخة المقتولة.

نظرًا لأن البكتيريا عديمة اللون تقريبًا وبالتالي تظهر تباينًا ضئيلًا مع المرق الذي تم تعليقها فيه ، فمن الصعب ملاحظتها عندما لا تكون ملطخة. يمكن تلطيخ الكائنات الحية الدقيقة واحدًا من:

  • رؤية تباين أكبر بين الكائن الحي والخلفية ،
  • التفريق بين الأنواع المورفولوجية المختلفة (حسب الشكل والترتيب ورد فعل الجرام وما إلى ذلك) ،
  • مراقبة هياكل معينة (سوط ، كبسولات ، إندوسبورات ، إلخ).

قبل تلطيخ البكتيريا ، يجب أن تفهم أولاً كيفية ذلك "إصلاح" الكائنات الحية على الشريحة الزجاجية. إذا لم يتم إصلاح المستحضر ، فسيتم غسل الكائنات الحية من الشريحة أثناء التلوين. طريقة بسيطة هي طريقة التجفيف بالهواء وتثبيت الحرارة. يتم تثبيت حرارة الكائنات الحية عن طريق تمرير مسحة مجففة بالهواء من الكائنات الحية من خلال لهب موقد غاز أو تثبيته أمام فتحة مبخرة دقيقة. تخثر الحرارة بروتينات الكائنات الحية مما يتسبب في التصاق البكتيريا بالشريحة.

ال إجراء التثبيت الحراري على النحو التالي:

1. إذا كانت الثقافة مأخوذة من وسط أجار:

أ. استخدام زجاجة قطارة الماء منزوع الأيونات الموجود في رف التلوين، مكان 1/2 قطرة ماء بالحجم الطبيعي على شريحة نظيفة عن طريق لمس القطارة للشريحة (انظر الشكل 2). عادة ، استخدم حلقة التلقيح المعقمة لوضع قطرة من الماء منزوع الأيونات على الشريحة.

ب. باستخدام حلقة التلقيح المعقمة الخاصة بك ، قم بإزالة a كمية صغيرة من الثقافة من سطح أجار و المسه برفق 2-3 مرات إلى قطرة الماء حتى الماء غائم بشكل واضح (انظر الشكل 3).

ج. حرق البكتيريا المتبقية على حلقة التلقيح. إذا تمت إضافة الكثير من الثقافة إلى الماء ، فلن ترى بكتيريا ملطخة.

د. بعد أن تبرد حلقة التلقيح ، نشر التعليق على ما يقرب من نصف الشريحة لتشكيل غشاء رقيق (انظر الشكل 4).

ه. السماح لهذا التعليق الرقيق الهواء جاف تمامًا (انظر الشكل 5). يجب أن تجف اللطاخة تمامًا قبل تثبيت الشريحة!

F. لإصلاح حرارة البكتيريا على الشريحة ، التقط الشريحة المجففة بالهواء باستخدام ملقط الغطاء وأمسك الجزء السفلي من الشريحة المقابلة للمسحة بالقرب من فتحة المبخرة لمدة 10 ثوانٍ (انظر الشكل 6) كما أوضح معلمك. إذا لم يتم تسخين الشريحة بشكل كافٍ ، فسيتم غسل كل البكتيريا. في حالة ارتفاع درجة حرارتها ، يمكن أن تتلف السلامة الهيكلية للبكتيريا.

2. إذا تم أخذ الكائن الحي من أ ثقافة المرق:

أ. باستخدام شربي ، ارسم دائرة حول حجم النيكل على ال قاع شريحة المجهر الخاص بك (انظر الشكل 10)

ب. اقلب الشريحة. باستخدام حلقة التلقيح المعقمة ، ضع 2 أو 3 حلقات من المزرعة بطريقة معقمة داخل هذه الدائرة على أعلى من الشريحة (انظر الشكل 11). لا تستخدم الماء.

ج. باستخدام حلقة التلقيح ، انشر التعليق فوق المنطقة التي تحددها الدائرة لتشكيل غشاء رقيق.

د. السماح لهذا التعليق الرقيق الهواء جاف تمامًا.

ه- لإصلاح حرارة البكتيريا على الشريحة ، التقط الشريحة المجففة بالهواء باستخدام ملقط الغطاء وأمسك الجزء السفلي من الشريحة المقابلة للمسحة بالقرب من فتحة المبخرة لمدة 10 ثوانٍ (انظر الشكل: إذا ارتفعت درجة حرارتها بشكل مفرط ، يمكن أن تتضرر السلامة الهيكلية للبكتيريا.

لفهم كيفية عمل التلوين ، سيكون من المفيد معرفة القليل عن الطبيعة الفيزيائية والكيميائية للبقع. وعادة ما تكون البقع عبارة عن أملاح يكون فيها أحد الأيونات ملونًا. (الملح هو مركب يتكون من أيون موجب الشحنة وأيون سالب الشحنة.) على سبيل المثال ، صبغة الميثيلين الأزرق هي في الواقع ملح ميثيلين أزرق كلوريد والذي سينفصل في الماء إلى أيون ميثيلين أزرق موجب الشحنة وهو أزرق اللون وأيون الكلوريد سالب الشحنة وهو عديم اللون.

يمكن تقسيم الأصباغ أو البقع إلى مجموعتين: قاعدية وحمضية. إذا كان جزء اللون من الصبغة موجودًا في أيون موجب، كما في الحالة المذكورة أعلاه ، يطلق عليه اسم أ صبغة أساسية (أمثلة: الميثيلين الأزرق ، البنفسجي الكريستالي ، السافرانين). إذا كان جزء اللون في ملف أيون سالب الشحنة، يطلق عليه صبغة حمضية (أمثلة: نيجروزين ، أحمر الكونغو).

بسبب طبيعته الكيميائية ، يحتوي السيتوبلازم في جميع الخلايا البكتيرية على شحنة سالبة طفيفة عند النمو في وسط قريب من درجة الحموضة المحايدة. لذلك ، عند استخدام ملف صبغة أساسية، يتحد جزء اللون موجب الشحنة من البقعة مع السيتوبلازم البكتيري سالب الشحنة (تجذب الشحنات المعاكسة) ويصبح الكائن الحي ملطخة مباشرة (انظر الشكل 1). ان صبغة حمضية، بسبب طبيعته الكيميائية ، يتفاعل بشكل مختلف. نظرًا لأن الجزء الملون من الصبغة موجود على الأيونات السالبة ، فلن يتم دمجه بسهولة مع السيتوبلازم البكتيري سالب الشحنة (مثل صد الشحنات). بدلاً من ذلك ، فإنه يشكل ملف تودع حول الكائن الحي، مما يترك الكائن الحي نفسه عديم اللون (انظر الشكل. وبما أن الكائن الحي يُرى بشكل غير مباشر ، فإن هذا النوع من التلوين يسمى غير مباشر أو نفي، ويستخدم للحصول على عرض أكثر دقة لحجم البكتيريا وأشكالها وترتيباتها.

في مختبر اليوم ، سنقوم بصنع بقع مباشرة وغير مباشرة للعديد من الكائنات الحية الدقيقة.

ب- صبغة مباشرة باستخدام صبغة أساسية

في التلطيخ المباشر ، يتحد جزء اللون موجب الشحنة من الصبغة الأساسية مع البكتيريا سالبة الشحنة ويصبح الكائن الحي ملطخًا بشكل مباشر.

الكائنات الحية

ثقافاتك النقية المكورات العنقودية البشروية (المكورات العنقودية مع ترتيب المكورات العنقودية) أو ميكروكوكس لوتس (coccus مع ترتيب tetrad أو sarcina) و الإشريكية القولونية (عصية صغيرة) أو الهوائيات المعوية (عصية صغيرة) من المختبر 3.

إجراء (يتم القيام به بشكل فردي)

1. الإشريكية القولونية أو الهوائيات المعوية

أ. إصلاح مسحة من أي منهما الإشريكية القولونية أو الهوائيات المعوية على النحو التالي:

1. عادة ، استخدم حلقة التلقيح المعقمة لوضع قطرة من الماء منزوع الأيونات على الشريحة.

2. 3).

3. إذا تمت إضافة الكثير من الثقافة إلى الماء ، فلن ترى بكتيريا ملطخة.

4. 4).

5. يجب أن تجف اللطاخة تمامًا قبل تثبيت الشريحة!

6. إذا تم تسخينها أكثر من اللازم ، يمكن أن تتلف السلامة الهيكلية للبكتيريا.

ب. ضع الشريحة على صينية تلطيخ وقم بتغطية الفيلم بالكامل سافرانين (انظر الشكل 7 أ). وصمة عار دقيقة واحدة.

ج. التقط الشريحة من أحد طرفيها وأمسكها بزاوية فوق صينية التلوين. استخدام زجاجة الغسيل على سطح المنضدة برفق اغسل الزعفران الزائد من الشريحة (انظر الشكل 7 ب). اغسل أيضًا أي بقعة على قاع من الشريحة أيضًا.

د. استخدام كتاب من الورق النشاف ل جفف الشريحة لتجف (انظر الشكل 8). لاحظ باستخدام مجهر الغمر بالزيت.

2. ميكروكوكس لوتس أو المكورات العنقودية البشروية

أ. إصلاح مسحة من أي منهما ميكروكوكس لوتس أو المكورات العنقودية البشرويةعلى النحو التالي:

1. وصمة عار مع الكريستال البنفسجي ل دقيقة واحدة.

ج. اغسل البنفسج الكريستالي الزائد بالماء.

د. جففه وراقبه باستخدام الفحص المجهري بالغمر بالزيت.

3. حضّر شريحة ثالثة من الفلورا والخلايا الطبيعية في فمك كالتالي:

أ. استخدم قطعة قطن معقمة لكشط داخل فمك ولثتك بقوة.

ب. افرك المسحة على الشريحة (لا تستخدم الماء), مجفف هواء، و إصلاح الحرارة.

ج. وصمة عار مع الكريستال البنفسجي ل 30 ثانية.

د. اغسل البنفسج الكريستالي الزائد بالماء.

ه. جففه وراقب. ابحث عن الخلايا الظهارية باستخدام هدف 10x الخاص بك ، وقم بتوسيطها في الحقل ، وانتقل إلى الغمر بالزيت لمراقبة بكتيريا النباتات الطبيعية على الخلايا الظهارية وحولها.

4. تأكد من سكب الصبغة المستخدمة بعناية في صينية التلوين في حاوية جمع صبغات النفايات ، ليس أسفل الحوض.

ج- صبغة غير مباشرة باستخدام صبغة حمضية في التلوين السلبي ، يتم صد جزء اللون سالب الشحنة من الصبغة الحمضية بواسطة الخلية البكتيرية سالبة الشحنة. لذلك ستكون الخلفية ملطخة وستبقى الخلية عديمة اللون.

التنظيم

استخدم الثقافة النقية لـ ميكروكوكس لوتس متاح.

إجراء (يتم القيام به بشكل فردي)

1. ضع أ قطرة صغيرة من النيجروزين باتجاه أحد طرفي شريحة مجهر نظيفة.

2. باستخدام حلقة التلقيح المعقمة ، أضف كمية صغيرة من ميكروكوكس لوتس إلى الصبغة وتخلط بلطف مع الحلقة.

3. باستخدام حافة شريحة أخرى ، وزعي الخليط بضغط متفاوت عبر الشريحة بحيث يكون هناك بالتناوب بين المناطق الفاتحة والمظلمة (انظر الشكل 9). تأكد من الصبغة ليس سميكًا جدًا أو لن ترى البكتيريا!

4. دع الشريحة يجف تمامًا في الهواء على الشريحة. لا تقم بإصلاح الحرارة ولا تغسل الصبغة.

5. تأكد من سكب الصبغة المستخدمة بعناية في علبة التلوين الخاصة بك في حاوية جمع صبغات النفايات ، ليس أسفل الحوض.

6. لاحظ باستخدام مجهر الغمر بالزيت. ابحث عن منطقة لا تحتوي على صبغة أكثر من اللازم ولا تحتوي على القليل جدًا (المنطقة التي تظهر ضوء ارجواني حيث يأتي الضوء من خلال الشريحة). إذا كانت الصبغة سميكة جدًا ، فلن يمر الضوء الكافي ؛ إذا كانت الصبغة رفيعة جدًا ، فستكون الخلفية فاتحة جدًا للحصول على تباين كافٍ.

النتائج

ارسم رسومات لتحضيراتك الثلاثة المباشرة للبقع وإعداداتك غير المباشرة للبقع.


نصيحة تقنية: الجمع بين التألق المناعي المباشر وغير المباشر باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس المضيف

يمكن إجراء التألق المناعي بطريقتين ، عن طريق الكشف المباشر أو غير المباشر. يستخدم التألق المناعي المباشر جسمًا مضادًا مترافقًا بالفلوروفور لتلطيخ البروتين المستهدف. يتضمن التألق المناعي غير المباشر أولاً ربط الجسم المضاد الأولي بالهدف ، ثم اكتشاف الجسم المضاد الأولي باستخدام جسم مضاد ثانوي مترافق. يوفر التألق المناعي غير المباشر ميزة الحساسية العالية. عادة ما يحمل كل جزيء من الأجسام المضادة المترافقة 4-6 صبغات فلورية. مع التألق المناعي المباشر باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، يمكن لجسم مضاد واحد فقط الارتباط بمولد الضد المستهدف على البروتين ، مع تمييزه بـ 4-6 جزيئات صبغية. مع التألق المناعي غير المباشر ، ترتبط العديد من الأجسام المضادة الثانوية بكل جسم مضاد أولي ، مما يزيد بشكل كبير من عدد الأصباغ المرتبطة بالبروتين المستهدف. ومع ذلك ، يوفر التألق المناعي المباشر ميزة القدرة على تلطيخ عينة بأجسام مضادة أولية متعددة من نفس الأنواع المضيفة في وقت واحد.

ستستمر الأجسام المضادة الثانوية في التعرف على الجسم المضاد الأولي المقترن بالصبغة ، وبالتالي لا يمكن دمج الجسم المضاد المسمى مباشرة مع عنصر أولي غير مقترن من نفس النوع في خطوة تلطيخ واحدة ، لأن الجسم المضاد الثانوي المسمى سيكتشف كلًا من الأجسام المضادة الأولية المصنفة وغير المصنفة. ومع ذلك ، يمكن إجراء التلوين بالتتابع للسماح بالكشف غير المباشر عن أول جسم مضاد أولي باستخدام ثانوي ، متبوعًا بالتلطيخ بجسم مضاد أولي مُسمى مباشرة من نفس النوع ، بدون تفاعل تبادلي مع الثانوي. يوفر البروتوكول التالي مثالاً على تلطيخ متسلسل مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية غير المقترنة من مضيفي الأرانب والماوس ، متبوعًا بأحد الماوس الأساسي المسمى مباشرة. يمكن تكييفه مع مجموعات أخرى من الأنواع المضاد الأولية.

بروتوكول للتألق المناعي المباشر وغير المباشر المشترك

1. قم بإجراء تثبيت ، نفاذية ، وحجب عيناتك وفقًا للبروتوكول المفضل للأجسام المضادة الأولية.

ملحوظة: راجع بروتوكولاتنا الخاصة بالاكتشاف المستند إلى الأجسام المضادة لمزيد من المعلومات حول التثبيت والنفاذية والحظر.

2. احتضان العينات مع الفئران والأجسام المضادة الأولية غير المسماة مخففة في منع المخزن المؤقت في الشركة المصنعة & # 8217s تركيز الموصى بها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.

3. اشطف العينات ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم قم بإجراء غسيل 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني.

4. احتضان العينات بالأجسام المضادة الثانوية الفلورية المضادة للفأر والأرانب المخففة في حجب العازلة لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. عادة ، يتم استخدام الاتحادات الثانوية الفلورية بتركيز نهائي من 1-2 ميكروغرام / مل.

ملحوظة: تأكد من استخدام الأجسام المضادة الثانوية شديدة الامتصاص مع الحد الأدنى من التفاعل التبادلي لجميع الأنواع المضيفة للأجسام المضادة. في حالة تلطيخ أقسام الأنسجة البشرية أو الحيوانية التي قد تحتوي على جلوبولين مناعي داخلي ، تأكد من أن الأجسام المضادة الثانوية لها أيضًا تفاعل عرضي ضئيل مع الأنسجة نفسها.

5. اشطف العينات ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم قم بإجراء غسيل 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني ، محميًا من الضوء.

6. احتضان عينات مع الفأر المسمى مباشرة الجسم المضاد الأولية المخففة في حجب العازلة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قد يتم تضمين المواد المضادة النووية أو phalloidin المسمى في هذه الخطوة.

ملحوظة: قد تحتاج إلى استخدام تركيز أعلى من الجسم المضاد الأولي المسمى مباشرة مما قد تستخدمه في التألق المناعي غير المباشر.

7. اشطف العينات ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم قم بإجراء غسيل 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني ، محميًا من الضوء.

8. قم بتركيب العينات في وسط وصورة مضادة للتآكل.


مثال على البيانات

الجمع بين تلطيخ التألق المناعي المباشر وغير المباشر للتجميد بشبكية الفئران مع مضاد للخيط العصبي H و CF ™ 568 ماعز مضاد للفأر (دقيقة × فأر) (عمليات عصبية ، أحمر) ، مضاد للأرنب مضاد لـ GFAP و CF ™ 488A ماعز مضاد للأرانب ، بدرجة عالية متصالب كثف (الخلايا الدبقية ، أخضر) ، متبوعًا بـ CF ™ 640R Mix-n-Stain ™ المسمى الماوس المضاد لـ ZO1 (الوصلات الضيقة ، أرجواني). مثبت في وسط تركيب Everbrite ™ مع DAPI (نوى ، أزرق). الجمع بين التلوين المناعي المباشر وغير المباشر لخصية الفئران مع مضاد الفأر المضاد للتوبيولين و CF ™ 488A ماعز مضاد للفأر (دقيقة × فأر) (أنابيب دقيقة ، خضراء) ، متبوعًا بـ CF ™ 555 Mix-n-Stain المسمى الماوس anti-ZO1 (ضيق الوصلات ، حمراء) و CF ™ 640R phalloidin (خيوط أكتين ، سماوي).

منتجات ذات صله

تقدم Biotium مجموعة واسعة من الأجسام المضادة الثانوية عالية الامتصاص المترافقة مع أصباغ CF ™ الساطعة والمستقرة ضوئيًا. نقدم أيضًا أكثر من 1000 من الأجسام المضادة الأولية ، وهي متوفرة في شكل نقي أو باختيارك من 13 لونًا من ألوان الصبغة CF ™. بالإضافة إلى ذلك ، توفر مجموعات الأجسام المضادة ™ Mix-n-Stain الخاصة بنا طريقة سريعة وبسيطة لتوصيل الجسم المضاد الأساسي الخاص بك مع مجموعة واسعة من أصباغ CF ™. تأكد أيضًا من رؤية منتجاتنا الملحقة للتألق المناعي ، بما في ذلك TrueBlack ™ Lipofuscin Autofluorescence Quencher ووسائط التثبيت المضادة للتلاشي EverBrite ™ و CoverGrip ™ Coverslip Sealant.


التألق المناعي المباشر مقابل غير المباشر

تعتمد تقنيات التألق المناعي (IF) أو التصوير الخلوي على استخدام الأجسام المضادة لتسمية مستضد مستهدف محدد بصبغة فلورية (تسمى أيضًا الفلوروفورات أو الفلوروكرومات) مثل إيزوثيوسيانات الفلورسين (FITC). تُستخدم الأجسام المضادة المرتبطة كيميائيًا بالفلوروفور بشكل شائع في IF.

يسمح الفلوروفور بتصور التوزيع المستهدف في العينة تحت المجهر الفلوري (على سبيل المثال epifluorescence والمجاهر متحد البؤر). نحن نميز بين طريقتين IF اعتمادًا على ما إذا كان الفلوروفور مترافقًا مع الجسم المضاد الأساسي أو الثانوي:

  • يستخدم Direct IF جسمًا مضادًا واحدًا موجهًا ضد الهدف محل الاهتمام. ال الجسم المضاد الأولي يتم تصريفه مباشرة إلى حامض الفلور.
  • يستخدم IF غير المباشر اثنين من الأجسام المضادة. ال الجسم المضاد الأولي غير مقترن ويستخدم جسم مضاد ثانوي مترافق مع فلوروفور موجه ضد الجسم المضاد الأولي للكشف عنه.

يمثل الرسم البياني أدناه كلاً من الطرق المباشرة وغير المباشرة.

كلتا الطريقتين لها مزاياها وعيوبها كما هو موضح في الجدول أدناه.

عادة ما تكون بروتوكولات IF المباشر أقصر لأنها تتطلب خطوة واحدة فقط لوضع العلامات.

لا تقتصر الطرق المباشرة وغير المباشرة على التألق المناعي. كما أنها ذات صلة بالتقنيات الأخرى التي تعتمد على استخدام الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور مثل قياس التدفق الخلوي و ELISA واللطخة الغربية والكيمياء المناعية.

قد يكون اكتشاف البروتينات منخفضة الوفرة أمرًا صعبًا في بعض الأحيان حتى مع الطرق غير المباشرة. تقدم الأجسام المضادة Biotinylated طبقة إضافية لزيادة تضخيم الإشارة. تعرف على المزيد حول كيفية عمل الطرق القائمة على استخدام الأجسام المضادة المقترنة بالبيوتين هنا.


إجراء تلطيخ سلبي

  1. خذ شريحة زجاجية نظيفة وخالية من الشحوم وجافة.
  2. ضع حد أدنى من نيجروزين باتجاه أحد طرفي الشريحة الزجاجية عبر قطارة.
  3. ثم خذ تلقيح من لوحات الاستزراع أو الثقافة المائلة عبر حلقة تلقيح معقمة وتخلطها مع قطرة من النيجروزين.
  4. بعد ذلك ، خذ قطعة أخرى نظيفة وخالية من الشحوم و شريحة زجاجية جافة ووضع أحد طرفيه باتجاه المركز.
  5. ثم، إمالة الشريحة الزجاجية فوق البقعة التي تحتوي على كائن الاختبار عن طريق عمل زاوية حادة.
  6. ارسم الشريحة المائلة قليلاً حتى تلامس قطرة كائن الثقافة ، و يجر عبر حافة الشريحة الزجاجية لجعلها متساوية وعريضة و مسحة بكتيرية رقيقة.
  7. السماح للشريحة الزجاجية مجفف هواء (لا تقم بإصلاح الحرارة).
  8. أخيرًا ، ضع قطرة من الغمر النفط ولاحظ الشريحة الزجاجية تحت المجهر لظهور خلية بكتيرية عديمة اللون بخلفية رمادية.


مزايا

  • من خلال التلوين السلبي ، يمكن ملاحظة الخلايا غير الملطخة الواضحة بسهولة على الخلفية المصبوغة باللون الأسود.
  • لا تتضمن طريقة التلوين السلبي التثبيت الحراري للعينة. نتيجة لذلك ، لن تتشوه الخلية بالحرارة.
  • يمكن أن تلطخ أيضًا الكائنات الحية الدقيقة الحساسة للحرارة مثل اللولبيات, الخميرة إلخ.
  • تسمح تقنية التلوين السلبي أيضًا بفحص كبسولة شفافة حول جدار الخلية للعديد من الكائنات الحية الدقيقة مثل المستخفية الحديثة.
  • إنها طريقة سهلة وسريعة للغاية تستخدم فيها بقعة حمضية واحدة فقط.

سلبيات

  • لا يوفر التلوين السلبي الكثير من المعلومات حول الخلية بدلاً من حجم الخلية وشكلها وترتيبها.
  • باستخدام هذه التقنية ، لا يمكننا فحص سلالة معينة أو نوع من الكائنات الحية.

استنتاج

لذلك ، يمكننا أن نستنتج أن تقنية التلوين السلبي هي طريقة بسيطة لفحص الكائن الدقيق باستخدام صبغة حمضية واحدة. ينتج عن التلوين السلبي عينة غير ملوثة أو واضحة ذات خلفية داكنة اللون.

يحدث التنافر بين البقعة سالبة الشحنة والعينة ، وبعد ذلك يمكننا ملاحظة الخلايا ذات الأشكال والأحجام المختلفة مثل الخطوط العريضة غير الملطخة ضد أ خلفية ملطخة.


المعمل 5: الدودة المفلطحة و Lophotrochozoans الأصغر

فيلوم روتيفيرا: الروتيفيرا
Phylum Acanthocephala: الديدان ذات الرأس الشوكي
Phylum Ectoprocta (Bryozoa) & ndash & ldquomoss Animals & rdquo (Bugula ، بلوماتيلا)
Phylum Brachiopoda & ndash & ldquolampshells & rdquo (Lingula ، تيريبراتيلا)

الشعبة من هذه النقطة فصاعدًا ، تتمتع جميع الحيوانات التي يغطيها موقع Zoo Lab الإلكتروني بتماثل ثنائي أساسي وهي ثلاثية الأرومات ، أي ثلاث طبقات جرثومية حقيقية (الأديم الظاهر والأديم المتوسط ​​والأديم الباطن) تتشكل أثناء مَعِدة مرحلة تطور الأريمة. في حين أن التناظر الشعاعي قد يكون مناسبًا تمامًا للأشكال اللاطئة أو البطيئة الحركة ، فإن الحيوانات النشطة في البحث عن الطعام والمأوى والأصحاب تتطلب خطة جسم جديدة. التناظر الثنائي المقترن بالرأس يحل هذه المشاكل. يتحرك الطرف الأمامي للأمام ويتبعه الخلفي. يبقى الجانب الظهري متجهًا لأعلى والجانب البطني يظل لأسفل وعادة ما يكون مخصصًا للحركة.

تنقسم الدرجة الثنائية للميتازوان إلى قسمين رئيسيين: الأوليات و deuterostomes ، والتي يتم فصلها على أساس عدد من الاختلافات الجنينية. تشير الدلائل المستمدة من تحليل تسلسل جين الريبوسوم الصغير إلى أنه بعد مرور بعض الوقت على تباعد الديوتوستومات السلفية والأولية عن بعضها البعض خلال العصر الكمبري ، انقسمت البروتستومات إلى مجموعتين كبيرتين (superphyla) ، Ecdysozoa و Lophotrochozoa. في هذا المختبر ، سوف نفحص شعبة واحدة من فصيلة acoelomate lophotrochozoan والعديد من الشعب الزائفة الزائفة و eucoelomate lophotrochozoan phyla.

تحتوي Phylum Platyhelminthes على أكثر من 20000 نوع تعيش بحرية وطفيلية من حيوانات acoelomate تسمى الديدان المفلطحة. في الديدان المفلطحة ، يكون الجسم المسطح ظهريًا بطنيًا ، مع الفم والمسام التناسلية عادةً في وضع بطني. تمتلئ المساحة بين القناة الهضمية والخارج بألياف عضلية الأديم المتوسط ​​وحمة غير متمايزة. على الرغم من أن المساحات المملوءة بالسوائل في الحمة تعمل كهيكل هيدروستاتيكي للدعم والمساعدة في النقل الداخلي ، إلا أن الحيوانات تفتقر إلى تجويف الجسم ، وهذا هو سبب تسميتها بـ acoelomate. تمتلك معظم الديدان المفلطحة التي تعيش بحرية نظامًا هضميًا من نوع الأوعية الدموية (الفم موجود ولكن لا يوجد فتحة الشرج) ، بينما لا تحتوي الأشكال الطفيلية عمومًا على جهاز هضمي.

الديدان المفلطحة لها جهاز عصبي مركزي يتكون من زوج من العقد الدماغية وأحبال عصبية طولية متصلة بالأعصاب المستعرضة. يتكون نظام الإخراج (الغائب في بعض الأشكال) من قناتين جانبيتين مع بروتونفيريديا تحمل خلايا اللهب. على الرغم من أن العديد من الديدان المفلطحة تعيش بحرية ، فإن الشعبة تضم أيضًا بعض الأنواع الطفيلية المهمة جدًا.

من حيث التكاثر ، يمكن أن تتكاثر الديدان المفلطحة عن طريق الاتصال الجنسي أو اللاجنسي. معظم الأنواع أحادية المسكن ولكنها تمارس الإخصاب المتبادل. يمكن للعديد من طوربينات المياه العذبة التكاثر اللاجنسي عن طريق الانشطار الذي ينقسم فيه الحيوان ببساطة إلى نصفين ، كل منهما يتجدد النصف الآخر. في بعض التوربينات (كما هو الحال في معظم الحيوانات الأخرى) ، يحتوي الصفار الذي يوفر التغذية للجنين النامي داخل خلية البويضة نفسها ، وهي حالة توصف بأنها endolecithal. في الكائنات أحادية الجين ، الديدان الخيطية والديدان الخيطية (وكذلك في عدد قليل من التوربينات) ، يساهم صفار البيض في الخلايا المنبعثة من أعضاء تسمى غدد الصفار ، وبالتالي توصف البيض بأنها ectolecithal. قد تكون التنمية مباشرة أو غير مباشرة.

يحتوي Class Turbellaria على أشكال تعيش بحرية تتراوح في الحجم من بضعة مم إلى 50 سم. معظم الأنواع تعيش في القاع في البيئات البحرية والمياه العذبة التي تزحف فوق الصخور أو الرمال أو الغطاء النباتي. يمكن للأشكال الأصغر أن تسبح عن طريق الأهداب البطنية ، لكنها تتحرك غالبًا عن طريق وضع طبقة من المخاط تساعد في الالتصاق وتساعد الأهداب على اكتساب الجر. تستخدم الأشكال الأكبر تقلصات عضلية قوية للزحف أو السباحة. فريدة من نوعها بالنسبة لعشاق التوربينات هي رابديت على شكل قضيب توجد بين خلايا البشرة البطنية لسطح الجسم. تفرز هذه الرابديت مخاطًا يكسو جسم الحيوان ، ربما للحماية من الحيوانات المفترسة أو لمنع الجفاف.

من حيث التغذية ، فإن معظم التوربينات هم مفترسون وزبالون. الإفرازات المخاطية للبشرة تحبس وتقتل الفرائس. يظهر البلعوم العضلي على الرغم من استخدام الفم البطني لإفراز إنزيمات الجهاز الهضمي في الفريسة ، والتي يتم امتصاصها بعد ذلك في الأمعاء المتفرعة التي تشكل تجويفًا للأوعية الدموية المعوية. بالإضافة إلى الجهاز العصبي البسيط ، تمتلك التوربينات بقع عين حساسة للضوء تسمى ocelli والتي تساعد على توجيه الحيوان نحو اتجاه الضوء. تتركز المستقبلات اللمسية والكيميائية في بعض الأشكال مثل المستوي الذي شوهد في المختبر في نتوءات جانبية من الرأس تسمى الأذنين تشبه فصوص الأذن. يمكن أن يحدث التكاثر في التوربينات اللاجنسي من خلال الانشطار أو جنسيًا جميع الأشكال أحادية المسكن ولكنها تمارس الإخصاب المتبادل. يُعرف المستورقون أيضًا بقدراتهم الهائلة في التجديد ، وسيؤدي المستورق الذي تم تقطيعه إلى ثلاث قطع إلى ظهور ثلاثة أفراد كاملين جدد!

يحتوي الصنف Monogenea على حيوانات تسمى المثقوبة أحادية الجين. على الرغم من أن معظم الأنواع عبارة عن طفيليات خارجية على جلد أو خياشيم الأسماك ، إلا أن هناك أشكالًا قليلة موجودة في مثانة الضفادع وحتى واحدة تعيش في عين فرس النهر! دورة حياة الحظ أحادي الجين مباشرة ، مع مضيف واحد. نظرًا لأنه يجب أن يعتمدوا على مضيف واحد لكل من التكاثر والانتقال ، فقد طورت المثقوبة أحادية الجين آليات تضمن عادةً أن الطفيليات لا تعرض حياة مضيفيها للخطر ، ولكن في الظروف المزدحمة (مثل مفرخات الأسماك) ، يمكن أن تنتج ، الإضرار بالعدوى.

يحتوي Class Trematoda على حوالي 8000 نوع من الحيوانات الشبيهة بالأوراق تسمى flukes digenetic. البالغات هي طفيليات داخلية على الفقاريات ولكن العديد من اللافقاريات تعمل كمضيف وسيط والعديد من الأنواع ذات الأهمية الطبية والاقتصادية! التطور هو الديدان الخيطية غير المباشرة ليس فقط البالغين ولكن اليرقات تتكاثر وجميع الأنواع لها عائلان على الأقل ، أحدهما للانتقال والآخر للتكاثر. الغالبية العظمى من المثقوبة تمتلك مصاصين كبيرين يستخدمان للربط ، أحدهما الأمامي يسمى المصاص الفموي ، والذي يحيط بالفم والآخر الخلفي يسمى المصاص البطني ، أو الحق.

في الديدان الثلاثية ، تؤدي بويضة واحدة إلى إنتاج العديد من السلالات! عادة ما يتم ترسيب البيض في الماء عن طريق بول أو براز العائل النهائي. عندما تصل إلى المياه العذبة ، تفتح البويضة وتسبح يرقة مهدبة حرة السباحة تسمى ميراسيديوم. سوف تسبح الميراسيديوم بعد ذلك حتى تجد مضيفًا وسيطًا مناسبًا ، والذي يكون عادةً حلزونًا مائيًا ينجذب إليه كيميائيًا. عندما يعثر الميراسيديوم على الحلزون ، فإنه يخترقه ويفقد أهدابه ويتطور إلى كيس بوغي ، والذي ينتج عن طريق اللاجنسي إما المزيد من الأكياس البوغية أو عددًا من الكائنات الحية التي تنتج أيضًا عن طريق اللاجنسي إما المزيد من أشكال ريديا أو ذيل يسمى cercariae. يخرج السركاريا من الحلزون ، يسبح حوله ويخترق مضيفًا وسيطًا ثانيًا ، المضيف النهائي (النهائي) أو المحول على الغطاء النباتي (في حالة حظ كبد الأغنام) ، حيث يتم تحويله إلى ميتاسركاريا ، وهي مثقوبة الأحداث البالغة. ينمو من metacercariae عندما يأكله المضيف النهائي.

عدوى Trematode في البشر

يمكن أن يصاب البشر بعدد من الديدان المثقوبة الخطيرة بعدة طرق. في حالة حظ الكبد الشرقي (Clonorchis sinensis) ، تحدث العدوى عن طريق تناول الأسماك النيئة أو غير المطبوخة جيدًا (والتي تعمل كمضيف وسيط ثانٍ للطفيلي) التي تحتوي على metacercariae من trematode.

في حالة دودة المثقوبة (البلهارسيا) ، يمكن أن تحدث العدوى عندما يخترق السركاريا الذيل من خلال الجلد المكشوف للأشخاص الذين يستحمون أو يعملون في المياه التي تحتوي على السركاريا (مثل حقول الأرز الآسيوية). البلهارسيا مرض مزمن يمكن أن يضر بالأعضاء الداخلية ويضعف النمو والتطور المعرفي عند الأطفال. يرتبط الشكل البولي من داء البلهارسيات بزيادة مخاطر الإصابة بسرطان المثانة لدى البالغين ، ويعد المرض ثاني أكثر الأمراض الطفيلية تدميراً من الناحية الاجتماعية والاقتصادية بعد الملاريا!

إن حظ كبد الأغنام (Fasciola hepatica) هو طفيلي شائع في الأغنام والماشية ، والذي يصاب بالعدوى عن طريق تناول النباتات المائية التي تحتوي على metacercariae (مثقوبة الأحداث). يمكن للإنسان أن يكتسب الطفيل عن طريق تناول الجرجير النيء (الذي ينمو بشكل طبيعي على أطراف البحيرات والبرك ويزرع في العديد من البلدان في آسيا وأوروبا) الذي يحتوي على ميتاسركاريا من الحظيرة.

حظ الرئة (Paragonimus westermani) هو طفيلي خطير محتمل موجود في آسيا وأمريكا الجنوبية ويمكن أن يتسبب في وفاة المضيف البشري. يُسعل بيضهم من رئتي مضيفهم ، ويبتلعه ويقضي عليه في البراز ، ويمكن أن يصاب البشر بالعدوى عن طريق تناول سرطان البحر النيء أو غير المطبوخ جيدًا في المياه العذبة (المضيف الوسيط الثاني للطفيلي) الذي يحتوي على metacercariae من الحظ.

يحتوي Class Cestoda على حوالي 4000 نوع من الديدان الشريطية ، وكلها طفيليات داخلية معدلة للغاية تعيش في كل أنواع الفقاريات المعروفة تقريبًا. ينقسم الجسم الطويل المسطح للدودة الشريطية (التي يشار إليها باسم ستروبيلا) إلى أجزاء تسمى البروجلوتيدات. تحتوي معظم الأشكال على عضو يسمى scolex في الطرف الأمامي مع مصاصات وخطافات وما إلى ذلك والتي تعلق على جدار القناة الهضمية وتمنعها من الانجراف.

تفتقر الديدان الشريطية إلى الجهاز الهضمي وتتغذى عن طريق امتصاص العناصر الغذائية مباشرة من المضيف. يتم تغطية سطح الجسم بالكامل بإسقاطات دقيقة تسمى الثروات الدقيقة التي تزيد بشكل كبير من مساحة السطح الامتصاصية للدودة الشريطية. تفرز الديدان الشريطية أيضًا المواد التي تثبط الإنزيمات الهضمية لمضيفها بالإضافة إلى خفض درجة الحموضة حولها إلى المستوى الذي يمكن أن تعمله ولكن ليس الإنزيمات الهضمية لمضيفها. في الديدان الشريطية ، يتم إعطاء الكثير من الستروبيلا للتكاثر. كل proglottid أحادي المسكن ، والتخصيب المتبادل أو حتى الإخصاب الذاتي شائع. يمكن ملء Proglottids بما يصل إلى 100000 بيضة!

مع استثناءات قليلة ، تتطلب جميع الديدان الخيطية مضيفين على الأقل ، والبالغ هو الطفيلي في الجهاز الهضمي للفقاريات. غالبًا ما يكون أحد العوائل الوسيطة من اللافقاريات (غالبًا ما يكون مفصليات مثل البرغوث أو القمل أو مجداف الأرجل) الذي يأكله المضيف النهائي. يتم إلقاء البيض الموجود داخل البروجلوتيدات يوميًا في البراز في التربة حيث قد يظلون كامنين لبعض الوقت. في بعض الأحيان ، تزحف البروجلوتيدات الحاملة للبيض من فتحة الشرج بمفردها ويمكن العثور عليها وهي تتلوى على كلب أو قطة أو طفل مصاب أو على الملابس والفراش المصابة. بمجرد إطلاق البيض ، يجب أن يتم ابتلاعها من قبل مضيف وسيط من أجل أن تفقس في يرقات معقوفة تسمى oncospheres ، والتي تخترق جدار الأمعاء وتلتقطها الدورة الدموية حيث يتم نقلها إلى العضلات الهيكلية أو القلب أو حتى بعض أنواع أخرى. العضو حيث يتم تحفيزهم على شكل cysticerci (ديدان المثانة). كل cysticercus هو في الأساس scolex من الداخل إلى الخارج والذي يظهر بعد أن يتم تناول الأنسجة المصابة (ما يسمى & ldquomeasly meat & rdquo) للمضيف الوسيط من قبل المضيف النهائي. ثم يعلق سكوليكس على بطانة الأمعاء عن طريق مصاصات و / أو خطافات.

عدوى الدودة الشريطية في البشر

يمكن أن يصاب البشر بالديدان الشريطية عن طريق تناول اللحوم المطبوخة بشكل سيئ والتي تحتوي على الكيسات المذنبة للدودة الشريطية. أهم الديدان الشريطية التي تصيب البشر هي الدودة الشريطية (Taenia saginata) والدودة الشريطية لحم الخنزير (Taenia solium).

نوع آخر من الديدان الخيطية التي يمكن أن تصيب البشر هي الدودة الشريطية السمكية الواسعة (Diphyllobothrium latum) ، وهي شائعة في الأسماك التي تعيش في منطقة البحيرات العظمى. مرة أخرى ، تحدث العدوى عن طريق تناول الكيسات المذنبة في الأسماك النيئة أو غير المطهية جيدًا. في معظم الحالات ، لا تسبب الديدان الشريطية الموجودة في القناة الهضمية ضررًا كبيرًا لمضيفها من البشر ، ولكنها تهاجر أحيانًا إلى أعضاء أخرى مثل العين أو حتى الدماغ ، حيث يمكن أن تسبب مشاكل عصبية خطيرة وحتى الموت من داء الكيسات المذنبة الدماغي!

الدودة الشريطية للكلاب (Diplydium caninum) شائعة في الكلاب ولكن يمكن التقاطها من قبل البشر (عادةً الأطفال) الذين يبتلعون البراغيث المصابة التي تعمل كمضيف وسيط للطفيلي.

على النقيض من الشُعبة المشعة و acoelomate حيث يتم ملء الفراغ بين جدار الجسم والجهاز الهضمي مع mesoglea أو بحمة اللحمة المتوسطة الصلبة ، فإن الحيوانات الثنائية المتبقية التي يغطيها موقع Zoo Lab الإلكتروني لها تجويف للجسم توجد فيه الأعضاء الداخلية. في الكاذب الكاذب ، يستمر الجوف الأريمي الجنيني كتجويف الجسم. نظرًا لأنه لا يصطف مع الصفاق الأديم المتوسط ​​(بطانة الجوف) ، فإنه يطلق عليه & ldquofalse cavity & rdquo أو pseudocoel.

يحتوي Phylum Acanthocephala على حوالي 1000 نوع من الحيوانات الطفيلية تسمى الديدان ذات الرأس الشوكي ، وكلها طفيليات داخلية في المسالك المعوية للفقاريات (خاصة الأسماك). مطلوب مضيفين لإكمال دورة الحياة ، والأحداث طفيليات من القشريات والحشرات. معظم الأنواع صغيرة جدًا (أقل من 40 مم). الديدان ذات الرأس الشائك لها تأثير دائم ململة مغطاة بأشواك متقوسة توفر وسيلة للتعلق بأمعاء المضيف. يخرج البيض من العائل وتؤكله بعض الحشرات أو القشريات حيث تفقس وتمر بعدة مراحل نمو. عندما يأكل طائر أو ثديي أو سمكة العائل الوسيط ، فإن اليرقة بالداخل تلتصق بجدار الأمعاء بخرطومها الشوكي.

تحتوي Phylum Rotifera على حوالي 1800 نوع من الحيوانات المجهرية تسمى rotifers والتي تحمل تاجًا أماميًا من الأهداب والتي تعطي مظهر عجلة دوارة. على الرغم من كونها عالمية (موزعة على نطاق واسع) ، إلا أن معظمها يوجد فقط في بيئات المياه العذبة. ينقسم مخطط الجسم العام للروتيفر إلى ثلاث مناطق: رأس يحمل عضوًا مهدبًا يسمى الإكليل (عضو العجلة) ، مما يخلق تيارات ترسم أشكالًا صغيرة من العوالق في الفم ، والتي تنفتح على بلعوم عضلي يسمى ماستكس. . تم تجهيز ماستكس بفكوك معقدة تتكون من سبع قطع صلبة تسمى الكأس وتستخدم لإمساك الفريسة ومضغها. يحتوي الجذع على الأعضاء الحشوية ، والقدم (عند وجودها) مجزأة وحلقة في مفاصل يمكن أن تقصر أو تلسكوب. تفرز غدد الدواسة الموجودة على القدم مادة لزجة تثبت الحيوان على الركيزة أو تسمح له بالزحف مع حركات مثل العلقة.

من هذه النقطة فصاعدًا ، جميع الحيوانات التي ستتم دراستها في موقع Zoo Lab هي eucoelomate ، أي أنها تحتوي على تجويف حقيقي (تجويف الجسم) مبطّن بطبقة رقيقة من نسيج الأديم المتوسط ​​تسمى الصفاق. ملحوظة: يجب اعتبار تطور اللولب أحد أهم الخطوات في تطور الأشكال الأكبر والأكثر تعقيدًا لأنه يوفر مساحة كبيرة للأعضاء التي يمكن تثبيتها في مكانها بواسطة أغشية رقيقة تسمى المساريق!

تحتوي Phylum Ectoprocta (وتسمى أيضًا Bryozoa) على حوالي 4000 نوع من الأشكال الاستعمارية الصغيرة تسمى حيوانات الطحالب الموجودة في المياه العذبة والبيئات البحرية الضحلة. على الرغم من أن الطحالب الحمراء ممثلة بشكل جيد في سجل الحفريات ، إلا أنها موجودة بكثرة اليوم. تستغل الأشكال البحرية الحديثة جميع أنواع الركائز الثابتة بما في ذلك الأصداف والصخور والأخشاب البحرية وقيعان السفن. في الواقع ، مثل البرنقيل ، تعد الكائنات الخارجية واحدة من أهم مجموعات الكائنات الحية الملوثة التي يجب إزالتها بشكل دوري من أجسام السفن والقوارب. يعيش كل فرد من أفراد المستعمرة في غرفة صغيرة تسمى zoecium (& ldquoanimal house & rdquo) ، والتي تفرزها بشرتها.

يتكون كل فرد (zooid) من جزء تغذية وجزء تشكيل حالة. يمكن أن يكون الزوسيوم هلاميًا أو كيتينيًا أو كلسيًا ، وأحيانًا يكون مشبعًا بحبيبات الرمل. يحتوي جزء التغذية من الحيوان على lophophore (جهاز تغذية مهدب يمكن استخدامه أيضًا لتبادل الغازات) والجهاز الهضمي والعضلات والجهاز العصبي. يعيش كل فرد نوعًا من وجود & ldquojack-in-the-box & rdquo ، حيث ظهر ليغذي ثم ينسحب سريعًا إلى غرفته الواقية التي غالبًا ما تكون مغلقة بباب سحري صغير (غطاء زجاجي).

يحتوي Phylum Brachiopoda (& ldquoarm foots & rdquo) على حيوانات تُعرف باسم قذائف القنابل. هذه مجموعة قديمة تم تمثيلها جيدًا في السجل الأحفوري (مع حوالي 30000 نوع موصوف) ولكن فقط حوالي 300 نوع حي. تشبه Brachiopods الرخويات ذات الصدفتين ، ولكن على عكس ذوات الصدفتين ، لها أصداف تقع على الجانب البطني والظهري بدلاً من اليسار واليمين.

تنقسم Brachiopods إلى فئتين بناءً على ما إذا كانت لها قذائف متصلة بواسطة مفصل متشابك & ldquoteeth & rdquo أو بأصداف ذات أحجام غير متساوية. تسمى Brachiopods في المجموعة الأخيرة بقذائف لأن الصمام البطني الأكبر يشبه مصباح الزيت الروماني. تلتصق بعض عضويات الأرجل بالركيزة عن طريق رأس على الصمام البطني بينما يقوم البعض الآخر بتثبيت الصمام البطني بالركيزة (مثل المحار) أو يحفر في الرواسب. مثل bryozoans ، تحتوي ذوات الأرجل أيضًا على lophophore يحيط بالفم والذي يستخدم للتغذية وتبادل الغازات.

Lab-5 01

تحتوي هذه الشريحة على عينتين من الديدان المفلطحة التوربينية المستطيلة التي تعيش بحرية. تم تلطيخ إحدى العينات ، بينما تم حقن الأخرى باللون الأسود الكربوني للكشف عن مدى التجويف الأعمى للأوعية الدموية المعوية ، والذي ينقسم إلى ثلاثة جذوع متعددة الفروع (أحدهما أمامي واثنان خلفيان). بدون فتحة الشرج ، يجب أن يمر الطعام أولاً من خلال الفم إلى تجويف الأوعية الدموية المعدية حيث يتم هضمه ، وبعد ذلك تخرج الفضلات من نفس الفتحة. لاحظ البلعوم الكبير الثابت في كل مستورق يُستخدم للتغذية. توجد في منطقة الرأس نتوءات جانبية تسمى الأذنين (لم يتم تطويرها جيدًا في العينات الموضحة) تحتوي على مستقبلات اللمس والمواد الكيميائية بالإضافة إلى العين الحساسة للضوء (بقع العين).

مختبر 5 02

  1. تجويف الشدق
  2. المعدة
  3. تجويف الوعاء البطني
  4. البشرة
  5. البلعوم
  6. حمة

تحتوي هذه الشريحة على مقطع عرضي عبر المنطقة البلعومية (الوسطى) من الدودة المسطحة المستوية. لاحظ البلعوم العضلي الكبير الذي يقع داخل مساحة تسمى التجويف الشدقي. أثناء الرضاعة ، يمكن إخراج البلعوم من خلال الفم واستخدامه لامتصاص السوائل والأنسجة الرخوة من الفريسة التي تم التقاطها. يمكن أيضًا رؤية فرعين من تجويف الأوعية الدموية الواسع. هذا التجويف مبطن بخلايا كبيرة مفرغة تتكون من المعدة. يوجد على السطح الخارجي للديدان المفلطحة بشرة مهدبة تحتوي على العديد من خلايا الغدة بالإضافة إلى أجسام ذات لون داكن على شكل قضيب تسمى الرابديت والتي يمكنها تفريغ محتوياتها لتشكيل طبقة مخاطية واقية حول الجسم. نظرًا لعدم وجود تجويف في الجسم ، تمتلئ المساحة بين القناة الهضمية والبشرة في هذه الخلايا بشبكة من نسيج الأديم المتوسط ​​بالإضافة إلى ألياف العضلات التي تعمل بشكل دائري وطولي وقطري.

مختبر 5 03

  1. تجويف الوعاء البطني
  2. المعدة
  3. حمة
  4. Rhabdites على البشرة

مختبر 5 04

تُظهر هذه الشريحة جبلًا كاملًا ملطخًا من حظ الكبد الشرقي (Clonorchis sinensis) ، وهو طفيلي مهم للديدان الخيطية للإنسان في العديد من مناطق آسيا ، وخاصة الصين وجنوب شرق آسيا واليابان. يصاب البشر عن طريق تناول الأسماك النيئة أو المطبوخة بشكل سيئ والتي تحتوي على metacercariae المحصنة. بعد تناولها ، تذوب هذه الأكياس في الأمعاء ، وتطلق النوى الصغيرة التي تهاجر بعد ذلك إلى القناة الصفراوية والكبد.

القسم الأمامي

مختبر 5 05

  1. مصاصة الفم والفم
  2. البلعوم
  3. المريء
  4. الأعور المعوية
  5. المسام التناسلية
  6. مصاصة بطنية (حق)

القسم الأوسط

مختبر 5 06

  1. رحم
  2. معوي سيكا
  3. غدد صفار البيض
  4. قناة الصفار
  5. المبيض
  6. وعاء منوي
  7. الخصيتين
  8. المثانة المفرزة

القسم الخلفي

مختبر 5 07

مختبر 5 08

تُظهر هذه الشريحة يرقات ريديا لطفيل المثقوبة. تتطور هذه المرحلة اليرقية عادة في أنسجة الحلزون المائي. تحتوي redia على مجموعات من الخلايا تسمى "كرات الجراثيم" والتي تتطور في النهاية إلى يرقات السركاريا الذيل ، والتي تخرج من الحلزون وتخترق مضيفًا وسيطًا ثانيًا أو تحويضًا على الغطاء النباتي لتصبح ميتاسركاريا.

مختبر 5 09

تُظهر هذه الشريحة يرقات الذيل-السركاريا لطفيلي داء المثقوبة. هذه المرحلة اليرقية ، التي تتطور عادة في أنسجة الحلزون المائي ، ستخرج من مضيفها الوسيط وتخترق مضيفًا وسيطًا ثانيًا أو كيسًا على الغطاء النباتي لتصبح ميتاسركاريا.

مختبر 5 10

تحتوي هذه الشريحة على أقسام ملطخة من الدودة الشريطية للكلب Diplydium caninum مأخوذة من أربع مناطق مختلفة. يحتوي الجزء الأمامي الأكبر على scolex ، وهو عضو مرفق متخصص يحتوي غالبًا على خطافات و / أو مصاصات. ينقسم باقي الجسم إلى سلسلة خطية من الأجزاء تسمى proglottids ، يحتوي كل منها على مجموعة كاملة من الأعضاء التناسلية. أصغر proglottids في الجزء الأول من ستروبيلا (جسم) الدودة الشريطية غير ناضجة ، بينما تلك الموجودة في الوسط ناضجة. أقدم البروغلوتيدات الطرفية هي حبلي ، مما يعني أنها مليئة بالبيض. يمكن أن تصاب الكلاب والقطط بالعدوى عن طريق تناول البراغيث البالغة (العوائل الوسيطة) التي تحتوي على يرقات الكيسات المذنبة.

سكوليكس (عن قرب)

مختبر 5 11

مختبر 512

  1. الخصيتين
  2. الأسهر
  3. المهبل
  4. المبيض
  5. غدة صفار البيض
  6. المسام التناسلية

تُظهر هذه الشريحة بروجلوتيدًا ناضجًا من الدودة الشريطية للكلب Diplydium caninum. لاحظ أن هناك مجموعتين كاملتين من الهياكل التناسلية الذكرية والأنثوية التي تشمل الخصيتين ، و vasa deferentia (جمع الأسهر) ، والمبيضين ، والغدد الصفار ، والمهبل ، والمسام التناسلية. تصاب الكلاب والقطط بالعدوى عن طريق أكل البراغيث البالغة (العوائل الوسيطة) التي تحتوي على يرقات الكيسات المذنبة.

مختبر 5 13

  1. قناة الإخراج
  2. الخصيتين
  3. رحم
  4. المسام التناسلية
  5. الأسهر
  6. المهبل
  7. المبايض
  8. غدد صفار البيض

تُظهر هذه الشريحة بروجلوتيدًا ناضجًا من الدودة الشريطية Taenia pisiformis ، وهي نوع شائع في الأمعاء الدقيقة للكلاب والقطط. لاحظ أن كل جزء يحتوي على مجموعة كاملة من الهياكل التناسلية بما في ذلك الخصيتين والأسهر (قناة الحيوانات المنوية) والمبيض وغدة الصفار والمهبل والمسام التناسلية.

مختبر 5 14

تُظهر هذه الشريحة scolex من المنطقة الأمامية من معظم الدودة الشريطية Taenia pisiformis. لاحظ سلسلة الخطافات على جزء مرتفع من scolex يسمى rostellum بالإضافة إلى الماصات الجانبية الأربعة. تمكن هذه الخطافات والمصاصات من بقاء الدودة الشريطية متصلة بالجدار المعوي لمضيفها.

خطاف على المنصة

مختبر 5 15

تُظهر هذه الشريحة منظرًا مكبّرًا للرأس المرتفع للسكولكس (rostellum) من الدودة الشريطية للكلب والقط ، Taenia pisiformis. لاحظ المجموعة الهائلة من الخطافات التي تستخدمها الدودة الشريطية للتعلق بالمسالك المعوية لمضيفها.

مختبر 5 16

تُظهر هذه الشريحة يرقات الدودة الشريطية Taenia pisiformis. لاحظ scolex المنغمس على الطرف الأيمن من "دودة المثانة". بعد أن يتم أكل النسيج المصاب للمضيف الوسيط من قبل المضيف النهائي ، تتلاشى scolex وتلتصق ببطانة الأمعاء عن طريق الخطافات والمصاصات.

مختبر 5 17

تُظهر هذه الشريحة عينة ملطخة من دودة شوكية بالغة تنتمي إلى فصيلة Acanthocephala. على الرغم من تسجيل الإصابات البشرية ، إلا أن الديدان البالغة تتطفل عادة على المسالك الهضمية للأسماك والطيور والثدييات المنزلية والبرية. تتطور يرقات الديدان ذات الرأس الشوكي في أنواع مختلفة من القشريات أو الحشرات. لاحظ أن الخرطوم المقلوب يحتوي على العديد من الأشواك المعاد تدويرها والتي تعطي الكائن الحي اسمه. يمكن أن تسبب هذه الأشواك (التي تسمح للديدان بالبقاء متصلة بالجهاز الهضمي) تدميرًا هائلاً ومؤلمًا في بعض الأحيان للغشاء المخاطي في الأمعاء.

خرطوم Acanthocephalan (عن قرب)

مختبر 5 18

مختبر 5 19

تظهر هذه الشرائح اثنين من دوارات ملطخة. تستمد هذه الحيوانات الكاذبة اسمها من تاج مهدب مميز (كورونا) يعطي ، عند الضرب ، انطباعًا بأن عجلة دوارة. حركة هذه الأهداب تخلق تيارات مائية تجذب المواد الغذائية إلى فم الكائن الحي. بمجرد الدخول ، يمضغ الطعام ويطحن في جزء عضلي من البلعوم يسمى ماستكس المجهز بفكين صلبين صغيرين يسمى التروفي. على الرغم من وجود عدد قليل من الأنواع البحرية ، إلا أن معظم الروتيفيرا توجد في موائل المياه العذبة في جميع أنحاء العالم.

صور فوتوغرافية لدوارات حية

مختبر 5 20

تُظهر هذه الصورة المجهرية عيّنتين حيّتين من الروتيفر فيلودينا المشترك. لاحظ الامتداد الجانبي لجدار الجسم في منطقة رأس العينة على اليمين (يُشار إليه بالسهم الأحمر). تحتوي هذه البنية (التي تسمى الهوائي) على العديد من الشعيرات الحسية الدقيقة. يمكن رؤية الهالة ("عضو العجلة") التي تحتوي على قرصين كبيرين مهدبين والقدم بإصبعين (النتوءات التي يشير إليها السهم الأزرق) على العينة الموجودة على اليسار. تنتج غدد الدواسة (التي تفتح بواسطة مجاري عند أطراف أصابع القدم) مادة لاصقة تستخدم للتثبيت المؤقت على الركيزة.

مختبر 5 21

تُظهِر هذه الصورة المجهرية منظرًا مكبّرًا لروتيفر فيلودينا للمياه العذبة. لاحظ الهالة الواضحة (عضو العجلة) مع أهدابها وصاريها المتمركز في الوسط (المشار إليه بالسهم الأحمر) ، وهو جزء عضلي من البلعوم مجهز بفكين كيتيني (تروفي) يطحن ويقطع الطعام المبتلع.

مختبر 5 22

تُظهر هذه الصورة المجهرية نوعًا آخر من الروتيفر في جنس Monostyla. هذه الأنواع الشائعة من المياه العذبة لها غطاء صلب يشبه الكيتين يسمى لوريكا.

مختبر 5 23

تُظهر هذه الشريحة العديد من حدائق الحيوانات في بلوماتيلا خارج المياه العذبة. لاحظ lophophores واضح. تتكون أجهزة التغذية هذه من كتل من مخالب مهدبة محمولة على التلال المحيطة بالفم. بالإضافة إلى التكاثر عن طريق التبرعم ، تتكاثر طحالب المياه العذبة بلا تزاوج عن طريق أجسام مقاومة خاصة تسمى الأرومة الستاتوبلاست (غير مرئية على هذه الشريحة). يتم إنتاج هذه الهياكل الداكنة على شكل قرص (والتي تشبه أحجار إسفنج المياه العذبة) خلال الصيف والخريف ، ويمكن أن تظل كامنة حتى تتحسن الظروف البيئية في الربيع.

مختبر 5 24

تُظهر هذه الشريحة جزءًا من مستعمرة متفرعة من البريوزوان البحري (ectoproct) Bugula. يتم إنتاج التفرع داخل المستعمرة من خلال التبرعم اللاجنسي المتكرر لأفراد يطلق عليهم اسم zooids. لاحظ مجسات lophophores (أجهزة التغذية الهدبية المحيطة بالفم والتي يمكن استخدامها أيضًا لتبادل الغازات). مثل العديد من الكائنات المجوفة الاستعمارية ، فإن المستعمرات الخارجية متعددة الأشكال ، حيث تعمل معظم حدائق الحيوان كإطعام للأفراد. تحمي نباتات الحيوانات الدفاعية التي تسمى أفيكاليا المستعمرة من الكائنات الحية الصغيرة ، بما في ذلك اليرقات الزاحفة والديدان متعددة الأشواك والمفصليات التي تبني الأنبوب. ويشبه كل صحن رأس طائر مكتمل بعضلات قوية وبنية حادة تشبه المنقار (المنصة) التي تستخدم للاستيلاء على زوائد الكائنات الحية التي تتعدى على ممتلكات الغير.

أفولاريوم (عن قرب)

مختبر 5 25

تُظهر هذه الشريحة منظرًا مكبّرًا لصفيحة من الطائر البريوزوان بوغولا الاستعماري البحري. لاحظ منقار الفك السفلي والجهاز العضلي. تحمي أفولاريا المستعمرة من الكائنات الحية الصغيرة ، بما في ذلك ترسيخ اليرقات والديدان متعددة الأشواك ومفصليات الأرجل التي تبني الأنبوب.

مختبر 5 26

هذه شريحة من حظ أحادي الجين مأخوذة من خياشيم سمكة الراي اللاسعة الأطلسية. على عكس الديدان الثلاثية الوراثية ، فإن الأنواع أحادية الجين لها دورة حياة مباشرة حيث تتطور اليرقات الهدبية المسماة أونكوميراسيديا على أو داخل مضيف واحد. على الرغم من وجود عدد قليل من الأنواع في المثانة البولية للضفادع والسلاحف ، فإن معظم هذه المثقوبة تتشبث بالخياشيم والأسطح الخارجية للأسماك عن طريق عضو ملحق خلفي يسمى opisthaptor مجهز بخطافات.

مختبر 5 27

تُظهر هذه الشريحة جبلًا كاملًا ملطخًا من حظ كبد الغنم (Fasciola hepatica). هذا الطفيلي الكبير هو طفيلي شائع للأغنام والماشية ، والذي يصاب بالعدوى عن طريق تناول النباتات المائية التي تحتوي على metacercariae (مثقوبة الأحداث). بمجرد تناولها ، يتم هضم جدران الكيس وتحفر اليرقات عبر جدار الأمعاء إلى تجويف الجسم وفي النهاية إلى الكبد.

مختبر 5 28

تُظهر هذه الشريحة عينة بالغة من المثقوبة الرئوية Paragonimus westermani. توجد في شرق آسيا وجنوب غرب المحيط الهادئ وبعض أجزاء أمريكا الجنوبية ، وهي تتطفل على عدد من الحيوانات آكلة اللحوم البرية والخنازير والقوارض والبشر. تسبب الإصابة بمرض المثقوبة الرئوية أعراضًا تنفسية ، مع صعوبات في التنفس وسعال مزمن ، والوفيات شائعة! يصاب البشر بمرض المثقوبة الرئوية عن طريق تناول سرطانات المياه العذبة النيئة أو غير المطبوخة جيدًا والتي تحتوي على فلوك ميتاسركاريا.

مختبر 5 29

تُظهر هذه الشريحة زوجًا من مثقوبات الدم البالغة أثناء الجماع. تختلف المثقوبة في الدم عن معظم المثقوبة الأخرى من خلال كونها ثنائية المسكن (أي وجود جنسين منفصلين). الذكور أكبر حجمًا ولديهم أخدود بطني كبير يسمى القناة النسائية الخلفية للمصاص البطني الذي يحمل الأنثى الأصغر (المصبوغة بلون داكن) أثناء الجماع ، وهو مستمر. البلهارسيا المنسونية هي واحدة من ثلاثة أنواع من داء المثقوبة في الدم المسؤولة عن المرض لدى البشر ويسمى داء البلهارسيات. يصاب البشر عندما تحفر يرقات السركاريا الذيلية (التي تهرب من حلزون المياه العذبة التي تعمل كمضيف وسيط) في الجلد المكشوف للأفراد الذين يستحمون أو يسبحون أو يعملون في مثل هذه الموائل.

35 مختبر 5

يتضمن هذا النموذج عدة مناظر لدودة مسطّحة توربيلية تعيش بحرية. تُظهر الصورة على اليسار الجهاز العصبي (باللون الأبيض) ، والذي يتكون من زوج من العقد الدماغية مع حبلين عصبيين بطنيين متصلين بسلسلة من الأعصاب المستعرضة تسمى الصوار ، مما يعطيها مظهرًا يشبه السلم. تشمل الهياكل الحسية الأخرى العيون البسيطة الحساسة للضوء (العين) والمستقبلات الكيميائية التي تتركز في الإسقاطات الجانبية للرأس والتي تسمى الأذنين (لأنها تشبه فصوص الأذن). على الرغم من أن التكاثر في المستورقات يمكن أن يحدث لاجنسيًا من خلال الانشطار ، إلا أن جميع الأشكال أحادية المسكن مع كل من الأعضاء التناسلية الذكرية والأنثوية. تظهر أيضًا العديد من ميزات الجهاز التناسلي (الموضحة باللونين الأزرق والأصفر) في النموذج الموجود على اليسار.

يُظهر النموذج الموجود على اليمين العديد من تجويف الأوعية الدموية المعدي المتفرّع (كما هو موضح باللون الأحمر) والذي يخرج من خلال فتحة بطنية واحدة في نهاية البلعوم العضلي القابل للكسر (يظهر باللون الأبيض الفاتح في كلا الطرازين وكذلك على المستوي العلوي الصغير
نموذج). يظهر أيضًا في النموذج جزءًا من نظام الإخراج / التنظيم التناضحي (كما هو موضح باللون الأخضر) الذي يتكون من البروتونفيريديا التي تجمع وتفرز بعض النفايات بالإضافة إلى المياه الزائدة التي تدخل أشكال المياه العذبة عن طريق التناضح. تتكون البروتونفيريديا من الأنابيب المفرغة المغلقة داخليًا والمفتوحة للخارج بواسطة سلسلة من قنوات التجميع التي تؤدي إلى فتحة خلفية تسمى nephridiopore. تنتهي النهايات الداخلية لكل من هذه الأنابيب بما يسمى بخلايا اللهب (يظهر أحدها في النموذج الصغير السفلي) ، والتي تحتوي على خصلات من الأهداب التي تومض مثل لهب الشمعة. يؤدي ضرب هذه الأهداب إلى سحب الماء من خلال كوب يشبه الشبكة ، مما ينتج عنه ترشيح من الماء وجزيئات صغيرة.

الأقسام الأمامية

مختبر 536

  1. العقدة الدماغية
  2. الحبل العصبي البطني
  3. أوسيلوس
  4. أذني
  5. الخصيتين
  6. المبيض
  7. قناة البيض
  8. طبقة عضلية دائرية
  9. طبقة العضلات الطولية

المقاطع الخلفية

مختبر 537

  1. تجويف الوعاء البطني
  2. البلعوم
  3. الجهاز الإخراجي
  4. الحبل العصبي البطني
  5. الخصيتين
  6. الحويصلة المنوية
  7. قناة البيض
  8. حمة

خلية اللهب المقربة

مختبر 5 38

30 مختبر 5

تُظهِر هذه الصورة نموذجًا لمرض حظ الكبد الشرقي (Clonorchis sinensis) ، وهو طفيلي مهم للديدان الخيطية للإنسان في العديد من مناطق آسيا. يصاب البشر عن طريق تناول الأسماك النيئة أو غير المطبوخة التي تحتوي على metacercariae المحصنة. بعد تناولها ، تذوب هذه الأكياس في الأمعاء ، وتطلق النوى الصغيرة التي تهاجر بعد ذلك إلى القناة الصفراوية والكبد. للحصول على مناظر عن قرب للهياكل المصنفة الموجودة في أقسام مختلفة من حظ الكبد ، انقر فوق الروابط أدناه.

الظهرية الأمامية

مختبر 532

1. البلعوم 2. العقد الدماغية 3. ceca المعوية 4. الحويصلة المنوية 5. الرحم

بطني أمامي

مختبر 5 31

1. الفم 2. مصاصة الفم 3. المريء 4. ceca المعوية 5. مصاصة بطنية 6. المسام التناسلية 7. الرحم 8. الغدد الصفار

الظهرية الخلفية

مختبر 534

1. الحويصلة المنوية 2. الرحم 3. الأعور المعوية 4. الوعاء المنوي 5. المثانة الإخراجية 6. المسام الإخراجية 7. القنوات المحية 8. غدة ميليس

بطني خلفي

مختبر 5 33

1. الرحم 2. غدد صفار البيض 3. غدة ميليس 4. المبيض 5. وعاء منوي 6. الخصيتين 7. المثانة الإخراج 8. الأعور المعوية


تعريف التلوين البسيط

يُعرَّف التلوين البسيط بأنه أحد الأمور العادية ، إلا أن الطريقة الشائعة المستخدمة لتوضيح حجم البكتيريا وشكلها وترتيبها للتمييز بين مجموعات البكتيريا المختلفة. يلطخ الخلية البكتيرية بشكل موحد وبالتالي يزيد من وضوح رؤية الكائن الحي. مصطلح بسيط تلطيخ قابل للتبديل أحيانًا بمصطلحات مثل تلطيخ مباشر أو إيجابي أو أحادي اللون. الآن دعونا نفهم سبب تسمية التلوين البسيط بمثل هذه الأسماء البديلة.

  • تلطيخ مباشر: لأنها طريقة مباشرة تلطخ الخلية البكتيرية بخلفية عديمة اللون.
  • تلطيخ إيجابي: لأنه يستخدم أصباغ أساسية موجبة الشحنة ترتبط بالخلية البكتيرية سالبة الشحنة.
  • تلطيخ أحادي اللون: لأنه يضيف تباينًا للعينة باستخدام صبغة واحدة فقط.

بقع بسيطة

يمكن تعريف البقع البسيطة على أنها الأصباغ الأساسية، وهي المحاليل الكحولية أو المائية (المخففة بنسبة تصل إلى 1-2٪). يمكن تحريرها بسهولة أوه & # 8211 ويقبل ح + أيون ، بسبب البقع البسيطة مشحونة بشكل إيجابي. كما البقع البسيطة موجب الشحنة ، يطلق عليهم عادة الأصباغ الموجبة أو الموجبة.

يستخدم عادة لتلوين معظم البكتيريا. نظرًا لأن البقعة البسيطة تحمل شحنة موجبة ، فإنها تلتصق بقوة بخلية بكتيرية سالبة وتجعل الكائن الحي ملونًا من خلال ترك الخلفية عديمة اللون. أمثلة من البقع البسيطة تشمل الزعفران والأزرق الميثيلين والبنفسجي الكريستالي وما إلى ذلك.

البقع الأساسية مختلفة زمن التعرض لاختراق الخلية البكتيرية وتلطيخها.

البقع الأساسيةوقت التعرض لتلطيخ البكتيريا
الميثيلين الأزرق1-2 دقيقة
الكريستال البنفسجي20-60 ثانية
كاربول فوشين15-30 ثانية
سفرانين30-60 ثانية

مبدأ

يعتمد مبدأها على إنتاج ملف ملحوظ التباين بين ال الكائن الحي والمناطق المحيطة بها باستخدام صبغة أساسية. تتكون الصبغة الأساسية من حامل صبغ إيجابي ، والذي يجذب بقوة مكونات الخلية السالبة والجزيئات المشحونة مثل الأحماض النووية والبروتينات. وبالتالي ، ينتج عن تقنية التلوين البسيطة خلية بكتيرية ملونة على خلفية عديمة اللون.

إجراء تلطيخ بسيط

يتضمن الخطوات الثلاث التالية:


تحضير المسحة

تظهر اللطاخة البكتيرية كغشاء رقيق من الثقافة البكتيرية. لإعداد اللطاخة ، نحتاج إلى تنفيذ الخطوات التالية:

  1. خذ شريحة زجاجية نظيفة وخالية من الشحوم.
  2. أضف قطرة من الماء المقطر في وسط الشريحة الزجاجية.
  3. بعد ذلك ، أضف لقاحًا من الثقافة البكتيرية بحلقة تلقيح معقمة على الشريحة الزجاجية.
  4. بعد ذلك ، قم بخلط اللقاح مع قطرة من الماء المقطر لعمل غشاء رقيق عن طريق تدوير حلقة التلقيح بشكل موحد حتى تكوين طبقة بكتيرية رقيقة.


تحديد الحرارة

بعد تحضير اللطاخة ، حرك الشرائح المعدة فوق موقد بنسن & # 8217 s لثلاث مرات على الأقل. ثم اترك الشريحة تجف في الهواء. هناك العديد من الأسباب لإجراء التثبيت الحراري ولا يمكن تخطيها للأسباب التالية:

  • يساعد التثبيت الحراري في تثبيت عينة على الشريحة الزجاجية.
  • يساعد التثبيت الحراري البقعة على اختراق المسحة.


تلطيخ البكتيريا

إنها الخطوة الأخيرة والأكثر أهمية ، والتي يمكن من خلالها تحديد الخصائص المورفولوجية للبكتيريا من خلال الفحص المجهري ، بمجرد تلطيخ الخلايا. تتضمن هذه المرحلة الخطوات التالية وهي كالتالي:

  1. أضف البقعة إلى مسحة الحرارة الثابتة.
  2. اسمح للبقعة بالوقوف لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى تتمكن من اختراق الخلايا.
  3. اغسل الشريحة الزجاجية بعناية.
  4. جفف الشريحة بالورق الماص (لا تمسح الشريحة).
  5. افحص الشريحة الزجاجية تحت المجهر من طاقة منخفضة إلى عالية للحصول على عرض مكبرة للعينة. يمكن للمرء أيضًا إضافة قطرة من الغمر بالزيت فوق الشريحة الزجاجية والمنطقة الملطخة # 8217s لملاحظتها تحت هدف 100X.


فيديو

مزايا

  • تلطيخ بسيط جدا بسيط طريقة الأداء ، والتي تلطخ الكائن الحي باستخدام كاشف واحد.
  • إنها سريعون طريقة تقلل من وقت الأداء بأخذ 3-5 دقائق فقط.
  • يساعد التلوين البسيط في فحص أو توضيح الشكل والحجم والترتيب البكتيري.
  • كما أنه يساعدنا على التفريق بين الخلايا البكتيرية والبنى غير الحية.
  • يمكن أن يكون التلوين البسيط مفيدًا في دراسة أولية للبكتيريا & # 8217s الخصائص المورفولوجية.

سلبيات

  • لا يعطي الكثير من المعلومات حول الخلية بصرف النظر عن الخصائص المورفولوجية للبكتيريا.
  • من خلال التلوين البسيط ، لا يمكننا تصنيف نوع معين من الكائنات الحية.

استنتاج

لذلك ، يمكننا أن نستنتج أن طريقة التلوين البسيطة هي أسهل طريقة لتلوين الكائن المجهري لأنه يستخدم صبغة أساسية واحدة. تعتمد نتائج التلوين البسيط على نوع البقعة الأساسية التي تم استخدامها.

سيحدد لون البقعة لون العينة التي يجب تحديدها. على سبيل المثال ، عندما تحتفظ البكتيريا بلون الزعفران ، فإنها تظهر باللون الوردي المائل إلى الأحمر ، وينطبق الشيء نفسه على البقع الأخرى.

هناك تجاذب بين البقعة الإيجابية والخلية البكتيرية السلبية في التلوين البسيط ، مما ينتج عنه ملاحظة البكتيريا الملونة مع خلفية مشرقة.


ملاحظات على البكتيريا الحية

في بعض الأحيان يتم اختراق نتائج الفحص لأن الكائن الملوث ينمو في الوسط بدلاً من العزلة البكتيرية المقصودة. لإجراء فحص سريع للتحقق من أن مورفولوجيا الخلية متوافقة مع الثقافة التي تم أخذ اللقاح منها ، يمكن تحضير حامل مبلل وفحصه في الحقل المظلم و / أو تباين الطور. في حالة وجود الأبواغ الداخلية غالبًا ما تكون واضحة في تباين الطور ، مما يسمح للمرء بتجنب الاضطرار إلى عمل بقعة بوغ.

في كثير من الأحيان ، يتطلب التعرف على كائن حي غير معروف معرفة حركته ، أي قدرته على الحركة متعدية. قد يكون من الصعب تفسير نتائج حضانات أجار الحركية ، جزئيًا للبكتيريا الهوائية التي لا تنمو جيدًا في الأجار. الفحص السريع الجيد للحركة هو فحص ثقافة صغيرة جدًا باستخدام طريقة الإسقاط المعلق. ستكون الثقافة الشابة عبارة عن مزرعة مرق تم تلقيحها في الليلة السابقة ، أو ثقافة مرق تم تخفيفها 10 أضعاف أو نحو ذلك في الصباح ، وحضنتها ، وفحصها بعد الظهر. يتم تحضير ثقافة الإسقاط المعلق عن طريق وضع قطرة صغيرة جدًا من الوسط على ساترة ، ثم عكس الغطاء فوق شريحة منخفضة بحيث لا يتصل الجزء السفلي من القطرة بالشريحة نفسها. يمكن استخدام الفازلين إذا لزم الأمر لعمل حجرة محكمة الغلق.

يمكن فحص القطرات المعلقة باستخدام جميع العدسات الموضوعية ، على الرغم من القدرة على النظر في عمق الهبوط ، قد يكون الحد الأقصى 100x. ستعمل شريحة الاكتئاب المنحنية على تشويه تأثيرات تباين الطور ، لكن الحقل المظلم قد يعمل وسيكون كافياً لاكتشاف الحركة. تتحرك جميع البكتيريا الحية بواسطة الحركة البراونية (الجزيئية) ، بمعدل اهتزاز يتناسب عكسياً مع حجم الخلية. الحركة البراونية السريعة هي خاصية شائعة للمكورات غير المتحركة مثل المكورات العنقودية أو العقدية أو المكورات الدقيقة. ومع ذلك ، يتم جلد بعض البكتيريا ، وتظهر حركة انتقالية أيضًا. ستنتقل الكائنات الحية المتحركة حقًا عبر مجال المجهر. ابحث عن حركة اتجاهية محددة ، وهبوط ، وحركة ضد التيارات.


إجراء

    الحصول على تعليق موحد للخلايا: اتبع بروتوكول تحييد الكتابة / التربسين لنوع الخلية المحدد. ضع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم مناسب. للحصول على تعداد دقيق للخلايا ، من الضروري وجود تعليق موحد يحتوي على خلايا مفردة. ماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل في الأنبوب 5-7 مرات باستخدام ماصة مع تجويف صغير (5 مل أو 10 مل ماصة). بالنسبة للخلايا التي تم إذابتها من الحفظ بالتبريد (في وسط 1 مل من الحفظ بالتبريد) ، استخدم الماصة لأعلى ولأسفل 7-10 مرات باستخدام ماصة مل واحدة.

لتحديد دقيق ، يجب أن يكون العدد الإجمالي للخلايا التي تعلو 1 مم 2 بين 15 و 50. إذا كان عدد الخلايا لكل 1 مم 2 يتجاوز 50 ، خفف العينة وعد مرة أخرى. إذا كان عدد الخلايا لكل 1 مم 2 أقل من 15 ، فاستخدم عينة أقل تمييعًا. في حالة عدم توفر عينات أقل تمييعًا ، قم بحساب الخلايا على جانبي مقياس الهيموسيتومتر (مناطق 8 × 1 مم 2).

احتفظ بعدد منفصل من الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة. إذا كانت أكثر من 25٪ من الخلايا غير قابلة للحياة ، فلن يتم الحفاظ على الثقافة على الكمية المناسبة من الوسائط. أعد احتضان الثقافة وضبط حجم الوسائط وفقًا لالتقاء الخلايا وظهور الوسائط. قم بتضمين الخلايا في الأعلى واليسار التي تلامس الخط الأوسط. لا يتم حساب الخلايا التي تلامس الخط الأوسط في الأسفل واليمين.

أنا. التريبان الأزرق هو "البقعة الحيوية" المستبعدة من الخلايا الحية.
ثانيا. تظهر الخلايا الحية عديمة اللون ومشرقة (قابلة للانكسار) في ظل تباين الطور.
ثالثا. تلطخ الخلايا الميتة باللون الأزرق وهي غير قابلة للكسر.

  • النسبة المئوية لجدوى الخلية = [إجمالي الخلايا القابلة للحياة (غير الملطخة) / إجمالي الخلايا (القابلة للحياة + الميتة)] × 100.
  • خلايا قابلة للحياة / مل = متوسط ​​عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مربع × عامل التخفيف × 10 4 /
  • متوسط ​​عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مربع = إجمالي عدد الخلايا القابلة للحياة في 4 مربعات / 4.
  • عامل التخفيف = الحجم الإجمالي (حجم العينة + حجم السائل المخفف) / حجم العينة.
  • إجمالي الخلايا / العينة القابلة للحياة = الخلايا القابلة للحياة / مل × الحجم الأصلي للسائل الذي تمت إزالة عينة الخلية منه.
  • حجم الوسائط المطلوبة = (عدد الخلايا المطلوبة / إجمالي عدد الخلايا القابلة للحياة) × 1000.

طرق الكيمياء المناعية

تستخدم الطريقة الأنزيمية للكيمياء المناعية الكواشف مثل كلوريد الكالسيوم وهيدروكسيد الصوديوم ومحاليل حمض الهيدروكلوريك وزيلين لإزالة الشمع والميثانول. تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية إجراءات تلطيخ مختلفة مثل الطريقة المباشرة بخطوة واحدة ، وطرق ABC ، ​​والطريقة غير المباشرة المكونة من خطوتين ، وتضخيم إشارة Tyramide.

طريقة مباشرة

الطريقة المباشرة هي طريقة تلطيخ خطوة واحدة ، وتتضمن جسمًا مضادًا مرتبطًا (أي مصل FITC مترافق) يتفاعل مباشرة مع مولد الضد في أقسام الأنسجة. تستخدم هذه التقنية جسمًا مضادًا واحدًا فقط ويكون الإجراء قصيرًا وسريعًا. ومع ذلك ، فهو غير حساس بسبب تضخيم الإشارة القليل ونادرًا ما يستخدم منذ إدخال الطريقة غير المباشرة.

الطريقة غير المباشرة

تتضمن الطريقة غير المباشرة جسمًا مضادًا أوليًا غير مسمى (الطبقة الأولى) والذي يتفاعل مع مستضد الأنسجة ، ويتفاعل الجسم المضاد الثانوي المسمى (الطبقة الثانية) مع الجسم المضاد الأولي (ملاحظة: يجب أن يكون الجسم المضاد الثانوي ضد IgG للأنواع الحيوانية التي يكون فيها الجسم المضاد الأولي ظهرت). هذه الطريقة أكثر حساسية بسبب تضخيم الإشارة من خلال العديد من تفاعلات الأجسام المضادة الثانوية مع مواقع مستضدية مختلفة على الجسم المضاد الأولي. بالإضافة إلى ذلك ، يعد هذا أيضًا اقتصاديًا نظرًا لأنه يمكن استخدام جسم مضاد من الطبقة الثانية مع العديد من الأجسام المضادة للطبقة الأولى (التي يتم رفعها من نفس النوع الحيواني) إلى مستضدات مختلفة. يمكن تمييز الجسم المضاد من الطبقة الثانية بصبغة فلورية مثل FITC أو رودامين أو أحمر تكساس ، وهذا ما يسمى طريقة التألق المناعي غير المباشر. يمكن تمييز الجسم المضاد من الطبقة الثانية بإنزيم مثل البيروكسيديز أو الفوسفاتاز القلوي أو الجلوكوز أوكسيديز ، وهذا ما يسمى طريقة الإنزيم المناعي غير المباشر.

طريقة PAP

(طريقة البيروكسيديز المضادة للبيروكسيديز): طريقة PAP هي تطوير إضافي للتقنية غير المباشرة وتتضمن طبقة ثالثة هي الجسم المضاد للأرنب للبيروكسيداز ، مقترنًا بالبيروكسيداز لصنع مركب مستقر جدًا من البيروكسيداز المضاد للبيروكسيديز. المركب ، المكون من الأرانب gaba-globulin و peroxidase ، يعمل كمستضد من الطبقة الثالثة ويصبح مرتبطًا بالماعز غير المقترن المضاد للأرنب gaba-globulin للطبقة الثانية. تكون الحساسية أعلى بحوالي 100 إلى 1000 مرة نظرًا لأن جزيء البيروكسيديز غير مقترن كيميائيًا بمضاد IgG ولكنه مرتبط مناعيًا ، ولا يفقد أيًا من نشاط إنزيمه. كما أنه يسمح بتخفيف أعلى بكثير من الجسم المضاد الأولي ، وبالتالي القضاء على العديد من الأجسام المضادة غير المرغوب فيها وتقليل تلطيخ الخلفية غير المحدد.

طريقة مجمع Avidin-Biotin (ABC)

طريقة ABC هي طريقة IHC القياسية وواحدة من التقنيات المستخدمة على نطاق واسع للتلوين المناعي الكيميائي. يمكن وصف Avidin ، وهو بروتين سكري كبير ، بالبيروكسيديز أو الفلورسين وله صلة عالية جدًا بالبيوتين. يمكن ربط البيوتين ، وهو فيتامين منخفض الوزن الجزيئي ، بمجموعة متنوعة من الجزيئات البيولوجية مثل الأجسام المضادة. تتضمن التقنية ثلاث طبقات. الطبقة الأولى هي جسم مضاد أولي غير مسمى. الطبقة الثانية عبارة عن جسم مضاد ثانوي معالج بالبيوتينيل. الطبقة الثالثة عبارة عن مركب من أفيدين-بيوتين بيروكسيداز. يتم بعد ذلك تطوير البيروكسيداز بواسطة DAB أو ركيزة أخرى لإنتاج منتجات نهائية مختلفة للقياس اللوني.

طريقة StreptAvidin Biotin (LSAB) المسمى

الستربتافيدين ، المشتق من المكورات العقدية أفيديني ، هو ابتكار حديث لاستبدال أفيدين. جزيء الستربتافيدين غير مشحون بالنسبة للأنسجة الحيوانية ، على عكس أفيدين الذي له نقطة تساوي كهربية قدرها 10 ، وبالتالي يتم التخلص من الارتباط الكهروستاتيكي بالأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يحتوي الستربتافيدين على مجموعات كربوهيدراتية قد ترتبط بكتينات الأنسجة ، مما يؤدي إلى بعض تلطيخ الخلفية. LSAB تشبه تقنيًا طريقة ABC القياسية. الطبقة الأولى هي جسم مضاد أولي غير مسمى. الطبقة الثانية عبارة عن جسم مضاد ثانوي معالج بالبيوتينيل. الطبقة الثالثة هي اتحادات إنزيم-ستربتافيدين (HRP-Streptavidin أو AP-Streptavidin) لتحل محل مجمع أفيدين-بيوتين بيروكسيديز. ثم يتم تصور الإنزيم من خلال تطبيق حلول الكروموجين الركيزة لإنتاج منتجات نهائية مختلفة لونية. يمكن أيضًا أن تكون الطبقة الثالثة عبارة عن صبغة فلورية - ستربتافيدين مثل FITC-Streptavidin إذا كان وضع العلامات الفلورية مفضلًا. يشير تقرير حديث إلى أن طريقة LSAB أكثر حساسية بحوالي 5 إلى 10 مرات من طريقة ABC القياسية.


إرشادات للتلوين غير المباشر في قياس التدفق الخلوي باستخدام كواشف الكشف الثانوية

التين. 2. تلطيخ استراتيجيات. رسم توضيحي للأنواع المختلفة من بروتوكولات التلوين التي قد تحتاج إلى استخدامها للحصول على تلطيخ ناجح غير مباشر ومباشر في قياس التدفق الخلوي.

1. بسيط تلطيخ الأجسام المضادة الأولية

عند تلطيخ العينات بجسم مضاد أولي مترافق مباشرة ، بعد الحضانة الأولية ويغسل بضع بسيطة ، تكون العينة جاهزة للحصول عليها (الشكل 2 أ). التلوين غير المباشر باستخدام جسم مضاد أولي غير مقترن ، تم اكتشافه بجسم مضاد ثانوي ، يتضمن خطوات إضافية: احتضان الجسم المضاد الأساسي ، واغسله ، ثم احتضنه بالجسم المضاد الثانوي المسمى الفلورسنت الذي يتعرف على الجسم المضاد الأساسي. بعد المزيد من عمليات الغسيل ، تكون العينة جاهزة للحصول عليها (الشكل 2 ب).

ومع ذلك ، إذا كان لديك مجموعة من الأجسام المضادة الأولية المقترنة وغير المقترنة ، والتي تتطلب أجسامًا مضادة ثانوية في لوحتك ، فقد يكون التلوين أكثر تعقيدًا. لتجنب الارتباط غير المحدد ، هناك بروتوكولات تلطيخ ، وخطوات للحظر والغسيل ، وخيارات للأجسام المضادة يجب مراعاتها بالإضافة إلى ضوابط قياس التدفق الخلوي المعتادة.

2. الجمع بين الأجسام المضادة المقترنة وغير المقترنة

المشكلة الشائعة عند الجمع بين الأجسام المضادة غير المقترنة والمترافقة هي الاكتشاف غير المناسب للأجسام المضادة الأولية المترافقة / الأجسام المضادة بواسطة الجسم المضاد الثانوي ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. تم توضيح هذه المشكلة في مقطع فيديو يوضح عمليًا كيف يمكن أن يؤدي استخدام الأجسام المضادة الثانوية المحددة من نوع IgG الفأري Bio-Rad & rsquos إلى تحقيق نتائج يمكنك الوثوق بها في التصوير المتعدد ، دون التعرض لخطر الإيجابيات الخاطئة ، وفي خطوتين بسيطتين فقط. لتجنب هذه المشكلة ، من الضروري أن تكون قادرًا على التمييز بين الأجسام المضادة الأولية غير المقترنة والمترافقة عن طريق الأنواع أو الفئة أو النمط المتماثل. يمكن تحضين الأجسام المضادة الأولية معًا وغسلها ومن ثم تصنيفها بأجسام مضادة ثانوية ، والتي تكتشف فقط الأنواع أو الفئة أو النمط المتماثل للأجسام المضادة الأولية غير المقترنة (الشكل 2 ج). لتحسين تلطيخك ، من الناحية المثالية ، يجب معايرة كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية لضمان الحد الأدنى من الخلفية مع إشارة محددة قصوى. يوصى أيضًا بتضمين عنصر تحكم ثانوي خاص بالأجسام المضادة فقط وعنصر تحكم يحتوي على جميع الأجسام المضادة باستثناء الجسم المضاد الأولي غير المُسمى للتحقق من وجود تلطيخ غير محدد. للحصول على مساعدة في تلطيخك ، استعرض بروتوكولات التلوين التفصيلية الخاصة بنا.

3. الحجب والغسيل

يمكن للحضانة بمصل مناسب ، قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية ، تقليل الخلفية عن طريق منع مستقبلات Fc. يجب أن يكون هذا من نفس النوع مثل نوع الخلية الذي يتم تحليله ، وليس من نفس النوع مثل مضيف الجسم المضاد الأولي ، حيث سيتعرف الجسم المضاد الثانوي على المصل المعطل والجسم المضاد الأساسي. إذا كنت تستخدم ألبومين المصل البقري ، فقد يكون ملوثًا بـ IgG البقري الذي يمكن أن يتفاعل مع الأنواع وثيقة الصلة مثل الماعز والأغنام. قم بتضمين خطوات غسيل كافية لإزالة الأجسام المضادة الأولية والثانوية الزائدة. قد تتطلب بروتوكولات التلوين داخل الخلايا خطوات غسيل أطول وأطول لإزالة كل الأجسام المضادة الزائدة. علاوة على ذلك ، قد يؤثر اختيار النفاذية ومخزن الغسيل على تلطيخ ويجب تحسينه لتجربتك.

4. اختيار الجسم المضاد

سيؤثر اختيار الجسم المضاد للأجسام المضادة الأولية والثانوية على تصميمك التجريبي. يمكن إزالة التفاعل التبادلي للأنواع غير المرغوب فيها باستخدام أجسام مضادة ثانوية مُمتزة متصالبة أو أجسام مضادة خاصة بالنمط المتماثل. سيضمن هذا أن الإشارة من الجسم المضاد الثانوي خاصة بالهدف الأساسي. إذا كنت تلطخ الأنسجة المناعية ، التي تحتوي على الكثير من مستقبلات Fc ، فقد ترغب في اعتبار جزء F (ab) كجسم مضاد ثانوي بالإضافة إلى حجبه بالمصل لتقليل الارتباط غير المحدد. عند تعدد الإرسال ، في حالة عدم وجود أجسام مضادة أولية مرفوعة في أنواع مختلفة ، قد تتوفر فئات مختلفة من الغلوبولين المناعي ، على سبيل المثال IgG و IgM ، مما يسمح باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالفئة ، من نفس النوع. العديد من الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة هي الفئران أو الفئران IgG1 أو IgG2a أو IgG2b. تسمح الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالنمط المتماثل بتعدد إرسال الأجسام المضادة النقية من نفس النوع. قد تكون قادرًا على زيادة خيارات التلوين عن طريق خلط هذه الطرق ومطابقتها ، ولكن تأكد دائمًا من أن الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بك لا تتعرف على أهداف متعددة ويتم تنفيذ الضوابط الصحيحة.

5. التعويض

عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية المسمى في لوحة متعددة الألوان ، لا يزال يتعين عليك إجراء التحكم الصحيح في التعويض للفلوروفور الثانوي. أسهل طريقة هي تنفيذ التحكم الفردي في تعويض التلوين باستخدام الجسم المضاد الأولي غير المقترن والجسم المضاد الثانوي المرتبط به. إذا ثبت أن هذا يمثل مشكلة ، بسبب التعبير المنخفض على سبيل المثال ، فيمكن استخدام حبات التعويض. اعتمادًا على قدرة الحبيبات على الارتباط بالجسم المضاد ، قد يكون من الممكن استخدامها مباشرة مع الجسم المضاد الثانوي ، أو مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية. الخيار الثالث هو إجراء تعويض باستخدام جسم مضاد أولي مترافق مباشرة مع نفس الفلوروفور الذي سيتم استخدامه على الجسم المضاد الثانوي. ومع ذلك ، يجب أن يتم استخدام الفلوروفورات الترادفية مع هذه الطريقة بحذر شديد بسبب الاختلافات المتأصلة بين دفعات الفلوروفور الترادفية.

6. الستربتافيدين ككاشف ثانوي

في بعض الأحيان ، يتوفر فقط الجسم المضاد الأولي المعالج بالبيوتين ، وفي هذه الحالة ، فإن استخدام الستربتافيدين المسمى الفلورسنت مع مثل هذا الجسم المضاد سيجعله مناسبًا في قياس التدفق الخلوي دون الحاجة إلى أجسام مضادة ثانوية. يزيل هذا الخيار الحاجة إلى التحقق من التفاعل التبادلي للأجسام المضادة الثانوية مع الأجسام المضادة الأولية الأخرى ويمكن أن يوسع خيارات التلوين المشترك. ومع ذلك ، لا يزال من الضروري إجراء الضوابط السلبية والتعويضات الصحيحة.

7. ضوابط / نصائح التدفق العامة

ضوابط محددة مطلوبة لقياس التدفق الخلوي مثل عناصر التحكم غير الملوثة ، والنمط المتماثل ، والصلاحية ، والتعويض ، وضوابط FMO. يمكن أن يكون بناء الألواح متعددة الألوان أمرًا صعبًا ، كما أن اتباع الإرشادات المتعلقة باختيار الأداة والفلوروفور لهما نفس القدر من الأهمية عند إجراء تلطيخ غير مباشر. بالإضافة إلى هذه الضوابط والإرشادات القياسية لقياس التدفق الخلوي ، قد يتطلب استخدام الأجسام المضادة الثانوية ضوابط إضافية وتحسين كل من الأجسام المضادة وبروتوكول التلوين. يمكن تقييم الارتباط غير المحدد للجسم المضاد الثانوي عن طريق التلوين بالجسم المضاد الثانوي بدون الجسم المضاد الأولي المحدد ، إما بمفرده ، أو بالاشتراك مع الأجسام المضادة الأولية التي ليست الهدف المقصود. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام الجسم المضاد الأولي ، الذي يرتبط به الجسم المضاد الثانوي والمعروف أنه سلبي في عينتك. سيعطيك هذا فكرة عن الارتباط بكل من العينة والأجسام المضادة الأخرى في اللوحة ، مما يسمح لك بتقييم تلطيخ الخلفية غير المحدد.

لمزيد من المعلومات حول الأجسام المضادة الثانوية واستخدامها في تطبيقات مختلفة ، قم بزيارة صفحة الويب المخصصة للأجسام المضادة الثانوية.


شاهد الفيديو: أكثر 10 سجون غير عادية في العالم. لن تصدق أنها موجودة بالفعل!! (شهر فبراير 2023).