معلومة

2 ب: التركيب والتسلسل والتحليل التوافقي للبروتينات - علم الأحياء

2 ب: التركيب والتسلسل والتحليل التوافقي للبروتينات - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أهداف التعلم

صف بعبارات عامة الإجراءات والخطوات الكيميائية في تحديد ما يلي للبروتينات:

  • الوزن الجزيئي الغرامي
  • وجود بعض الأحماض الأمينية المحددة
  • تكوين الأحماض الأمينية
  • N و C الأحماض الأمينية الطرفية
  • حمض أميني محدد ضروري للربط والنشاط
  • تسلسل الأحماض الأمينية
  • الهيكل الثانوي
  • هيكل ثلاثي الأبعاد

الصورة المصغرة: هيكل الهيموجلوبين البشري. تكون الوحدات الفرعية α و باللون الأحمر والأزرق ، ومجموعات الهيم المحتوية على الحديد باللون الأخضر. من PDB: 1GZX. (جنو ، بروتيوبيديا الهيموجلوبين).


الهيكل والحالات التوافقية لميتوكوندريا الأبقار سينسيز بواسطة cryo-EM

يتم تصنيع الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، وهو عملة الطاقة الكيميائية في علم الأحياء ، في الخلايا حقيقية النواة بشكل أساسي بواسطة سينسيز ATP للميتوكوندريا. تعمل تركيبات ATP بواسطة آلية تحفيزية دوارة حيث ينتقل البروتون من خلال F المُدخل في الغشاءا تقترن المنطقة بتوليف ATP في الحفاز F1 المنطقة عن طريق دوران مجمع ثانوي دوار مركزي. نبلغ هنا عن تحليل المجهر الإلكتروني الجسيمي الفردي (cryo-EM) لمركب ATP للميتوكوندريا البقري. سمح لنا الجمع بين بيانات cryo-EM مع تحليل المعلومات الحيوية بتحديد ثنية الوحدة الفرعية ، مما يشير إلى مسار انتقال البروتون عبر Fا المنطقة التي تتضمن كل من الوحدات الفرعية a و b. كشف التصنيف ثلاثي الأبعاد للصور عن سبع حالات متميزة للإنزيم تُظهر أنماطًا مختلفة من الانحناء والالتواء في تركيب ATP السليم. تقلبات الدوران من ج8- الخيط داخل Fا المنطقة تدعم آلية السقاطة البراونية للدوران الذي يحركه البروتون في توليفات ATP.


خلفية

يوفر التحليل المقارن لجينومات حقيقيات النوى فرصة غير مسبوقة لاستكشاف ما يجعل نوعًا معينًا فريدًا. تتضمن الآليات الجينية التي تولد اختلافات خاصة بالأنواع الطفرات المنتقاة بشكل إيجابي والتي تمنح ميزة اللياقة والتثبيت العشوائي للطفرات المحايدة بشكل انتقائي واكتساب جينات جديدة [1 ، 2]. وبالتالي ، فإن الاختلاف بين الأنواع يشمل التباين في تسلسل الجينات ، ولا سيما تلك الخاصة بالجينات التنظيمية ، وخصائص التسلسلات غير المشفرة والحمض النووي المتكرر ، وعدد الجينات والذخيرة [3 ، 4]. حتى الآن ، ركز علم الجينوم المقارن في حقيقيات النوى بشكل كبير على الجينات التي تشفر البروتينات مع مجالات أو أشكال محددة تجريبياً (بروتينات ذات سمات محددة (PDFs)) [5 ، 6]. نظرًا لأن تحليل ملفات PDF كشف عن درجة عالية من التشابه بين الأنواع المختلفة ، فقد كان من المقبول على نطاق واسع أن تفرد نوع معين كان مدفوعًا بالتغيرات في الجينات أو العناصر التنظيمية [1-6] ، على عكس الاختلاف في الترميز الثابت تسلسل أو إنشاء جينات جديدة. وقد أدى ذلك إلى منظور واسع الانتشار مفاده أن عددًا قليلاً فقط من الكائنات الحية النموذجية يمكن أن يوفر الأساس التجريبي لتعيين وظائف لكل جين حقيقي النواة تقريبًا.

من الواضح أن التحليل المقارن لجينوم حقيقيات النوى حتى الآن يفتقر بشكل ملحوظ إلى تحليل أصول ووظائف الجينات المشفرة للبروتينات التي تفتقر حاليًا إلى العناصر أو المجالات المحددة (البروتينات ذات السمات الغامضة (POFs)) [7 ، 8]. اقترحت دراسات تنميط التعبير في الكائنات الحية المختلفة أن POFs تلعب دورًا مهمًا في العديد من العمليات البيولوجية المختلفة. ومع ذلك ، لا تزال أدوارها البيولوجية وأصولها غير مفهومة جيدًا ، كما أن توضيح وظائفها يعد حاليًا هدفًا رئيسيًا للبحث البيولوجي في جميع الكائنات الحية المدروسة تقريبًا [7 ، 8]. في هذا البحث ، ندرس إمكانية أن تلعب الجينات التي تشفر POFs ، والتي تمثل ما يقرب من ربع جميع الجينات حقيقية النواة ، دورًا في تحديد الاختلافات بين الأنواع. بالقياس إلى توقع أن يتم حفظ ملفات PDF غالبًا بين الأنواع [4-6] ، قد يتوقع المرء أن تظهر POFs نمطًا متوازيًا للحفاظ على النشوء والتطور. لاختبار هذا الافتراض ، أجرينا تحليلًا مقارنًا لعشرة بروتينات حقيقية النواة مختلفة ، بما في ذلك خميرة البراعم والانشطار ، والديدان ، وذبابة الفاكهة ، والبعوض ، أرابيدوبسيسوالأرز والفأر والجرذ والإنسان. بشكل مثير للدهشة ، على عكس ملفات PDF ، وجدنا أن POFs تتضمن نسبة أكبر بكثير من البروتينات شديدة التباين. تؤكد نتائجنا على أهمية تحديد أصول ووظائف POFs كسبب أساسي لخصوصية الأنواع.


مقدمة

يحدد تسلسل البروتين طبيعة الطاقة الحرة الخاصة به ، لكنه أثبت أنه يمثل تحديًا كبيرًا للتنبؤ بالميلات الهيكلية المعتمدة على التسلسل من المبادئ الفيزيائية الأولى. هذا له عواقب عملية مهمة للتصميم العلاجي ، حيث أن التفضيلات المطابقة يمكن أن تحدد خصوصية الدواء. مثبط الكيناز من النوع الثاني Gleevec هو مثال رئيسي ، لأنه يرتبط بقوة بـ ABL kinase ولكنه لا يرتبط بـ SRC kinase على الرغم من وجود هوية تسلسلية بنسبة 47٪. 1 ، 2 تم اقتراح أن خصوصية جليفيك ترجع جزئيًا إلى اختلاف نزعات بروتينات كيناز لتشكل يعرف باسم "DFG-out" والذي يجب أن يتخذه البروتين لربط مثبطات النوع الثاني. 3-7 ومع ذلك ، فقد تم الجدل حول هذا الأمر وأثبتت أصول الاختلاف المعتمدة على التسلسل صعوبة تأكيدها من خلال التحليل البنيوي البحت. 8-11

تفتح الأصول التطورية للبروتينات زاوية أخرى للهجوم. تؤدي التفاعلات الفيزيائية بين اثنين من البقايا في بنية البروتين إلى التباين الطفري المشترك في محاذاة تسلسل متعددة (MSA) لعائلة البروتين ، والتي حفزت تقنيات التحليل التطوري المشترك التي تتنبأ بالاتصالات في الهيكل من خلال تحديد أزواج الموضع المترابطة بقوة في MSA (انظر المرجع 12 ، 13 للمراجعة). وقد أثبتت أساليب "التجديد العكسي" أنها مناسبة بشكل خاص لهذا الغرض. هذه الاستدلالات على نموذج هاميلتوني ذو الطاقة الإحصائية "بوتس" الذي تتوافق معلماته مع نقاط قوة التفاعل المباشر بين البقايا والبقايا ، عن طريق ملاءمة إحصائيات MSA باستخدام تقنيات مستعارة من الفيزياء الإحصائية. 14 لقد تم إثبات قوة استدلال Ising العكسي من خلال استخدامه كمكون مركزي لـ "تحليل الاقتران المباشر" (DCA) للتنبؤ بتلامس البروتين ، والذي ثبت أنه يتنبأ بأفضل 200 زوج من أزواج التلامس داخل البروتين في العديد من البروتينات مع ∼ دقة 80٪ كما أكدتها دراسات علم البلورات بالأشعة السينية ودراسات الرنين المغناطيسي النووي ، بالإضافة إلى ملامسات البروتينات ، والتطابقات البديلة غير المتبلورة ، والاتصالات التي تتم بوساطة يجند ، وقد تم استخدامها للتنبؤ بهيكل ab-initio. 14-20

يمكن استخدام نموذج بوتس لأكثر من مجرد توقع جهات الاتصال. يوفر النموذج احتمالية (أو مع لوغاريتم ، طاقة إحصائية) لأي تسلسل معين ، ويتنبأ بالتغير في الطاقة الإحصائية للتسلسل لأي مجموعة من الطفرات. ترتبط هذه الطاقة الإحصائية بالطاقة الحرة القابلة للطي للبروتين ، ويمكن أن تتحلل إلى شروط تفاعل خاصة بالموقع والمخلفات والتي بدأت للتو في استكشاف علاقتها مع المصطلحات الزوجية في وظائف الطاقة الحرة القائمة على الهيكل. 21 ، 22 وهذا يثير إمكانية التنبؤ بالخصائص الخاصة بالتسلسل بما في ذلك النزعات المطابقة.

هدفنا هو استنتاج النزعات المطابقة للكينازات الفردية لحالة DFG-out غير النشطة ، حيث يتم توجيه فكرة "DFG" بعيدًا عن موقع كيناز النشط على عكس التشكل الفعال لـ DFG. 6 نتوقع التفضيل المطابق من خلال حسابات "الترابط" لطاقة بوتس لتسلسل كدالة للتشكيل. التسلسلات التي توقعها تحليلنا أن يكون لها عقوبة عالية لحالة DFG-out لا يتم ملاحظتها أبدًا في تلك الحالة في الهياكل البلورية ، بينما يتم ملاحظة التسلسلات المتبقية في كل من DFG-in و DFG-out ، ونجد أيضًا أن التسلسلات ذات درجة عالية العقوبة المتوقعة ترتبط بشكل سيئ بمثبطات النوع الثاني في مقايسة ربط عالية الإنتاجية. علاوة على ذلك ، يشير تحليلنا إلى أن استقرار حلقة التنشيط في حالة DFG-in يلعب دورًا مهمًا في تحديد مشهد الطاقة.


خلفية

تتطلب استجابة البروتين التعاوني وبالتالي سلوك الشبكة التعاونية نقل المعلومات بين المواقع البعيدة في مجمع البروتين أو البروتين. غالبًا ما تحقق هياكل البروتين مثل هذا الاتصال بعيد المدى عن طريق الحركة الخيفية [1-4] ، ولكن هذا بالتأكيد ليس مطلبًا. بشكل أساسي أي تغيير في الخصائص الديناميكية لبقايا البروتين ، عند الارتباط بالرابط على سبيل المثال ، والذي ينتشر بكفاءة من خلال الهيكل ويمكن اكتشافه في موقع بعيد ، يشكل شكلاً من أشكال نقل الإشارة [5-9]. تم تكريس العديد من الدراسات النظرية والتجريبية للديناميات الهيكلية للبروتينات الكروية وآثارها على وظيفة البروتين. تركز الدراسات التجريبية الحديثة ، من ناحية ، على دور ديناميكيات البروتين في التحفيز [10] ، ونقل الإشارة [7 ، 11] ، والاستجابة التعاونية [12] وتجميع البروتين [13]. من ناحية أخرى ، سبرنا النهج النظري في العلاقة بين الديناميات الهيكلية للبروتين ونقل الإشارة ، وهي محدودة فقط بالتعقيد التوافقي المرتبط بالفضاء المطابق. استجابةً لذلك ، تم تطوير تقنيات مثل الديناميات الجزيئية المستهدفة [11] ، والانتشار الحراري متباين الخواص [5] أو أخذ العينات مثل Go-like [14] لتقليل درجات الحرية للسماح برسم خرائط لمسار يربط حالة أرضية واحدة بـ نظيره الخيفي. بالإضافة إلى ذلك ، قام رانجاناثان وزملاؤه بتعيين البقايا التي تشارك في نقل الإشارة في العديد من البروتينات المهمة عن طريق استخلاص الطفرات المرتبطة التطورية من محاذاة التسلسل المتعددة [7]. تُظهر هذه الدراسات معًا (1) أن التغييرات في ديناميكيات البروتين يمكن أن تنتشر من خلال بنية البروتين ، مما يؤدي إلى إنشاء ارتباطات طويلة المدى بين المواقع النشطة البعيدة [6 ، 14] ، (2) يشارك جزء صغير فقط من المخلفات في بنية البروتين في انتشار الإشارة [ 9 و 12] و (3) يتم حفظ أنماط الاتصال داخل البروتين هذه بشكل عام داخل عائلات البروتين وحتى طيات البروتين [4 ، 7].

الآن بعد أن أصبحت المبادئ المتعلقة بالديناميات الهيكلية المرتبطة بآليات نقل الإشارات داخل البروتينات واضحة ، نقدم هنا طريقة لتحديد هذه التقلبات الهيكلية وتحديدها كمياً من حيث المعلومات التي تسمح بحساب نقل المعلومات بين المواقع النشطة. على وجه الخصوص ، نستخدم نظرية المعلومات [15] ، وبشكل أكثر تحديدًا مفهوم المعلومات المتبادلة ، كوسيلة لوصف العلاقة بين ديناميكيات البروتين البنيوية وسلوك التأشير. ينبع هذا الارتباط مباشرة من العلاقة بين تعريفات الانتروبيا كمقياس للاضطراب البنيوي في الديناميكا الحرارية الإحصائية ، من ناحية ، وكمقياس للخطأ في قنوات الاتصال في نظرية المعلومات من ناحية أخرى [16]. إن قدرة البروتينات الكروية على نقل المعلومات في جميع أنحاء هيكلها ، وبالتالي ربط سلوك مواقع المستجيب البعيدة ، يتم توفيرها بالفعل من خلال التغيير في الديناميات الهيكلية التي يسببها الارتباط الترابطي. ولكن بشكل أكثر جوهرية ، ينشأ نقل المعلومات من الاعتماد المطابق المتبادل للبقايا المختلفة المكونة لبروتين أو مركب بروتيني. بعبارة أخرى ، عندما تؤثر المرونة التوافقية لبقايا واحدة على المرونة التوافقية لبقايا أخرى ، فإن التغييرات في الديناميكيات الهيكلية ستنتج تغييرات مرتبطة في الانتروبيا وبالتالي يتم تبادل المعلومات [17]. تحدد المعلومات المتبادلة مقدار الاعتماد المطابق بين مخلفات البروتين. نتيجة لذلك ، يمكن اعتبار البروتين على أنه شبكة من المخلفات تتبادل المعلومات التوافقية. يوفر هذا التفسير إطارًا نظريًا لفهم كيف تشكل إعادة توزيع الاضطرابات الديناميكية الحرارية داخل شبكة من مخلفات البروتين شبكة نقل المعلومات.

لتوضيح نهجنا النظري للمعلومات ، قمنا بتعيين شبكة نقل المعلومات القائمة على المخلفات لمجال SH2 الخاص بـ Fyn tyrosine kinase [18] ، وهو عضو في عائلة Src من كينازات [19] ، التي تشارك في مسارات الإشارات الأساسية ، من أجل مثال على التحكم في نمو الخلايا وانتشارها وتمايزها وحركتها والتصاقها بالخلية [20]. يشترك أفراد العائلة في بنية مشتركة متعددة المجالات ، مع المجال الأصلي Src homology 3 (SH3) في N-terminal [21] ، ومجال التماثل Src 2 (SH2) [22 ، 23] ، ومجال التيروزين كيناز ومجال قصير ذيل C- طرفي. في شكله غير النشط ، يتم عزل مجال كيناز بواسطة مجالات SH3 و SH2 (انظر الشكل 1 أ). يرسو المجال SH3 بالرابط الذي يربط SH2 بمجال kinase. يحتفظ مجال SH2 بتسلسل فوسفوتيروزين C- طرفي (انظر الشكل 1 أ). يؤدي نزع الفسفرة من تسلسل المحطة C إلى إطلاقه من موقع ربط الفوسفوببتيد SH2. وهذا بدوره يؤدي إلى إطلاق رابط SH2-kinase من مجال SH3 وإلغاء إرساء مجال كيناز الذي يزيد عن 40 أنجستروم (انظر الشكل 1 أ) بعيدًا عن موقع ربط فوسفوببتيد SH2 [24].

إن Fyn tyrosine kinase ومجال SH2 الخاص به. فين تيروزين كيناز (أ) يتكون من ثلاثة مجالات: المجال N-terminal SH3 ، مجال SH2 الذي يربط أشكال phosphotyrosine ، المجال SH1 مع نشاط التيروزين كيناز وذيل C قصير الذيل. عندما يكون غير نشط ، فإن التيروزين في الموضع 527 في الجزء C-terminal يتم فسفرته وربطه بمجال SH2. في (ب) يتم تصور مجال SH2 مع ببتيد الفوسفوتيروسين المرتبط بالطرف C. تمت إضافة المصطلحات القياسية لعناصر البنية الثانوية ، انظر أيضًا (د). (ج) عرض عن قرب لمواقع ربط الفوسفوببتيد والكارهة للماء ، بما في ذلك السلاسل الجانبية للمخلفات ذات الصلة بالربط. يتم توفير التسمية القياسية لبقايا التفاعل الرئيسية في [25] (معرف PDB 1AOT [38]). تم إنشاء جميع الرسومات الجزيئية باستخدام YASARA http://www.yasara.org و PovRay http://www.povray.org.

يحتوي مجال SH2 على طول نموذجي لحوالي 100 من الأحماض الأمينية ويعرض طية بسيطة (كما هو موضح في الشكل 1 ب) حيث تكون ورقة β مركزية مضادة للتوازي محاطة بطرفين ألفا. عادةً ما يتم شرح خيوط من βA إلى βG ، بينما يشار إلى α-helices باسم αA و αB. تُظهر اللوحة B (و D) من الشكل 1 الهيكل (التسلسل) المسمى لمجال Fyn SH2 المستخدم في التحليل الحالي (انظر طرق معلومات الهيكل). يتكون موقع ربط الببتيد لمجال Fyn SH2 من منطقتين وظيفيتين: جيب ربط الفوسفوتيروزين (الملصقات الحمراء في الشكل 1C) ، المسؤول عن التعرف على pTyr ، وجيب الربط الكاردي للماء ، والذي يتفاعل مع المخلفات C- الطرفية إلى pTyr ( الملصقات الزرقاء في الشكل 1 ج) [25 ، 26]. يقع تجويف الربط الأول بين الصفيحة المركزية المضادة المتوازية و α-helix αA. يقع جيب الربط الثاني على الجانب الآخر من تجويف ربط الفوسفوتيروزين ، بين الصفيحة المركزية و α-helix αB. في الشكل 2 ج ، يتم شرح أسماء الوحدات البنائية المتضمنة في ربط متواليات الفسفرة الطرفية C على الهيكل باتباع المصطلحات المحددة في [25 ، 26]. هذه الأسماء ، على سبيل المثال سيتم استخدام HisβD4 ، عند الإشارة إلى بقايا أي تجويف ملزم. مخلفات أخرى ، على سبيل المثال سيتم الإشارة إلى Ser23 ، من خلال اسم الحمض الأميني الخاص بهم وموقعهم في هياكل Fyn SH2 PDB المستخدمة هنا (انظر الطرق). لمزيد من المناقشة التفصيلية لوظيفة SH2 والتسمية ، نشير إلى الأدبيات [25 ، 26].

التغيير في المعلومات المتبادلة لكل بقايا وأهم مجموعة. يؤدي ربط الببتيد بالتيروزين الفسفوري بمجال SH2 إلى حدوث تغيير في تفاعلات بقايا المعلومات المتبادلة. (أ) تعرض هذه اللوحة التغيير في المعلومات المتبادلة لكل تفاعل ثنائي. من الواضح أن معظم المخلفات تظل غير متأثرة. يختبر عدد من المخلفات في مواقع معينة التأثير الأقوى. (ب) معظم المخلفات لا تواجه أي تغيير تقريبًا في المعلومات المتبادلة. يوضح الشكل الداخلي التوزيع في الذيل بدءًا من تغيير في المعلومات المتبادلة أكبر من 0.5 (مستوى الضوضاء) (ج) تجميع البقايا باستخدام التغيير في المعلومات المتبادلة كقياس تشابه (انظر الطرق) ، ينتج عنه مجموعة من المخلفات شديدة الاقتران ، الموجودة في جيوب الربط وبالقرب من منطقة رابط كينيز في مجال SH2. تم إنشاء جميع الرسومات الجزيئية باستخدام YASARA http://www.yasara.org و PovRay http://www.povray.org.

أظهر العمل التجريبي على دور الرابط بين المجالين SH3 و SH2 في Fyn أن طبيعة الرابط ، أي نمط البقايا ، تحدد كلاً من الاتجاه والاقتران بين المجالين [27 ، 28]. على هذا النحو فإنه له تأثير مباشر على سلوك تنشيط بروتين كيناز وعلى الاتصال داخل الجزيئات. هذه الملاحظة مدعومة بالديناميكيات التجريبية والجزيئية التي قام بها كوريان وآخرون. [9] على كيناز SRC. أظهروا أن تحرير تسلسل C-terminal من موقع ربط SH2 يفصل حركات نطاقات SH2 و SH3 عن طريق زيادة مرونة حلقة الوصلة التي تربط هذين المجالين. وبالتالي ، فإن رابط الموصل بين المجال SH2 و SH3 يعمل كآلية قفل المفاجئة المحرضة واستبدال ثلاثة من البقايا الثمانية في هذا الرابط بواسطة الجلايسينات يولد كيناز نشطًا بشكل أساسي. في الواقع ، يقترن موقع ربط الفوسفوببتيد في أحد طرفي مجال SH2 بالرابط SH3-SH2 على الجانب الآخر من مجال SH2. الأهم من ذلك ، يتم تحقيق التعاون بدون حركة خيفية كبيرة داخل مجال SH2 ، وبالتالي ينشأ من الاختلافات الدقيقة في الديناميكيات بين الحالات المرتبطة بالفوسفوببتيد والحالات غير المقيدة. يُظهر تحليلنا أن المعلومات المتبادلة تحدد وتحدد التعاون في مجال SH2 عبر مسافات طويلة ، مما يؤكد النتائج الأخرى للهياكل غير الخيطية المختلفة [29 ، 30]. بمعنى آخر ، يؤدي ربط ببتيد الفوسفوتيروزين إلى تبادل المعلومات من جيوب ربط SH2 نحو البقايا الموجودة في الجانب الآخر من المجال ، مستهدفًا مناطق الرابط. ومن ثم ، فإن موقع ربط الببتيد SH2 يعمل كمفتاح يوزع المعلومات عن حالة الربط الخاصة به على كلا الرابطين مع المجالات الأخرى ، وينسق وحدة الإرساء SH2-SH3.


الملخص

تم التحقق من التسلسل والمحتوى الحلزوني لاثنين من الببتيدات الغنية بالألانين (AQK18 و GpAQK18 ، Gp: l -propargylglycine) ومقترناتها مع البولي (الإيثيلين جليكول) (PEG) بواسطة مطياف الكتلة متعدد الأبعاد (MS) ، بما في ذلك التأين بالرش الكهربائي (ESI) ) أو تأين امتصاص الليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) المتداخل مع تجزئة قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS 2) والفصل الحساس للشكل عبر قياس الطيف الكتلي لحركة الأيونات (IM-MS). تم تحديد التركيب والتسلسل وتوزيع الوزن الجزيئي للببتيدات والمقارنات الحيوية من خلال تجارب MS و MS 2 ، والتي أكدت أيضًا ارتباط PEG عند الطرف C من الببتيدات. كشف ESI المقترن بـ IM-MS عن وجود ملف عشوائي ومطابقات حلزونية α للببتيدات في الطور الغازي. الأهم من ذلك ، أن نسبة التشكل الحلزوني زادت بشكل كبير بعد مرفق PEG ، مما يشير إلى أن الاقتران يضيف الاستقرار إلى هذا المطابق. تم تشكيل التجمعات المطابقة التي تم اكتشافها في الطور الغازي إلى حد كبير في محلول ، كما تم تأكيده من خلال تجارب ثنائية اللون دائرية مستقلة (CD). تمت محاكاة المقاطع العرضية للتصادم (المتوسط ​​الدوراني للمناطق المتحركة للأمام) للملف العشوائي والمطابقات الحلزونية للببتيدات واتحادات PEG الخاصة بهم للمقارنة مع القيم التجريبية المستخلصة بواسطة IM-MS من أجل تأكيد هوية البنى المرصودة وفهمها تأثير استقرار سلسلة البوليمر. يُظهر أن الربط بالطرف C يزيد من كثافة الشحنة الموجبة ويذيب الشحنات الموجبة داخل الجزيئية في موقع الاقتران ، وبالتالي يعزز استقرار حلزونات ألفا ، ويحافظ على شكلها ويزيد من ميلها الحلزوني.


2 ب: التركيب والتسلسل والتحليل التوافقي للبروتينات - علم الأحياء

الكيمياء الحيوية: 2. السنة ، الفصل الشتوي ، مقرر إجباري

ناتاليا . بولوفي ، دكتوراه.
أستاذ مشارك، كلية الكيمياء ، الطلاب trg 12-16 ، بلغراد

جيليكا ر. ميلو إيفي
مساعد، كلية الكيمياء ، الطلاب trg 12-16 ، بلغراد

أسبوعي: أربع ساعات من المحاضرات + سبع ساعات من العمل المخبري (4 + 0 + 7)

الهدف من هذا المقرر الدراسي هو مساعدة الطلاب على اكتساب المعرفة الأساسية لبنية ووظيفة البروتينات والأحماض النووية. يجب أن يفهم الطلاب العلاقة بين بنية ووظيفة البروتينات والأحماض النووية. يوفر هذا المقرر الدراسي للطلاب أساسًا لدورات الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في السنوات اللاحقة من دراستهم. سيصبح الطلاب على دراية بالتقنيات والأساليب الأساسية المستخدمة لعزل وتوصيف البروتينات والأحماض النووية وسيكتسبون المهارات الأساسية اللازمة للعمل في مختبر الكيمياء الحيوية.

فهم بنية البروتينات والأحماض النووية ، والعلاقة بين بنية ونشاط البروتينات والعلاقة بين البروتينات والأحماض النووية على مستوى الدراسات الجامعية. اكتسب المهارات الأساسية اللازمة للعمل في مختبر كيميائي حيوي وطور فهمًا أوليًا للعمل التجريبي مع البروتينات والأحماض النووية.

محاضرات وتمارين تجريبية وتمارين نظرية وعمل فردي وجماعي مع الطلاب على دمج وحدات المقرر.


قم بتنزيل وطباعة هذه المقالة لاستخداماتك العلمية والبحثية والتعليمية الشخصية.

شراء عدد واحد من علم مقابل 15 دولارًا أمريكيًا فقط.

علم

المجلد 343 ، العدد 6176
14 مارس 2014

أدوات المادة

الرجاء تسجيل الدخول لإضافة تنبيه لهذه المقالة.

بقلم مارتن جينيك ، فوجو جيانغ ، ديفيد دبليو تايلور ، صامويل إتش ستيرنبرغ ، أمين كايا ، إنبو ما ، كارولين أندرس ، مايكل هاور ، كايهونغ زو ، ستيفن لين ، ماتياس كابلان ، أنتوني تي إيفاروني ، إيمانويل شاربينتيير ، إيفا نوجاليس ، جينيفر أ. دودنا

يؤدي تجليد الحمض النووي الريبي التوجيهي إلى إحداث تغييرات هيكلية في مجموعة من إنزيمات شق الحمض النووي.


المواد والأساليب

استنساخ بنيات EGFP-WRN

لإنشاء EGFP-WRN (aa 1-1432) كامل الطول ، تم تضخيم WRN بواسطة PCR من الإنسان WRN الجين ، تم استنساخه في زهوأنا-Xmaأنا مواقع ناقلات pEGFP-C3 (Clontech). تم إنشاء جزء WRN الذي يحتوي على NLS (aa 1358-1432) بواسطة PCR باستخدام البلازميد المشفر EGFP-WRN (1-1432) كقالب ، ثم تم استنساخه في Kpnأنا-Xmaأنا مواقع ناقلات pEGFPC3. تم استنساخ بقية شظايا EGFP-WRN المستخدمة في هذه الدراسة في زهوأنا-سابقة بمعنى البيئةمواقع RI لمتجه pEGFPC3 (مع أو بدون NLS) من ناقل pGEX-CS. تم استنساخ شظايا WRN التي تشفر الأحماض الأمينية 949-1432 و949-1092 في Ncoأنا-باممواقع HI لناقلات pGEX-CS (Brosh، Jr et al.، 2001). تم إنشاء أجزاء WRN التي تحتوي على مجالات نوكلياز خارجية وهليكاز (aa 54-946) ومجال C- طرفي (aa 1072-1432) بواسطة PCR ، باستخدام بلازميد تشفير EGFP-WRN كقالب ، ثم تم استنساخه في Ncoأنا-باممواقع HI لمتجه pGEX-CS. لإنشاء متحولة حذف EGFP-WRN RQC (EGFP-WRNΔ853-1089 ، I852L) قدمنا ​​اثنين كيسمواقع I (الأحماض الأمينية 852 و 1089) في تسلسل pEGFP-WRN (aa 1-1432) باستخدام نظام الطفرات المختبرية الموجه في المختبر قليل النوكليوتيد من Stratagene (الطفرات الموجهة من موقع التغيير السريع). بعد، بعدما كيسأنا الهضم ، تم تنقية الناقل المهضوم وتدينه. تم تسلسل جميع الأجزاء.

Transfections ، التوطين في الخلايا الحية ومقايسات التألق المناعي

كانت خلايا U-2 OS و B16F10 من ATCC ، وكانت خلايا AG11395 من Coriell. نمت الخلايا في وسيلة Dulbecco المعدلة لـ Eagle (تقنيات الحياة) و 10 ٪ FBS. بالنسبة لفحوصات التوطين في الجسم الحي ، نمت الخلايا في أطباق ميكروويل ذات قاع زجاجي (MatTek) وتم نقلها باستخدام النواقل المقابلة باستخدام مجموعة ترنسفكأيشن كالفوس للثدييات (Clontech). بعد 15 ساعة ، تم عرض الخلايا تحت مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر (زايس 410) في القناة الخضراء (488 نانومتر) (عدسة 63 × NA 1.4). ثم تم تراكب الصور وتحليلها باستخدام نظام التصوير Metamorp 4.1 (شركة Universal Imaging Corporation). بالنسبة لمقايسات التلوين ، تم إصلاح الخلايا المنقولة التي تنمو على ساترة (15 ساعة بعد تعداء) بنسبة 4 ٪ بارافورمالدهيد في 1 × PBS (لمدة 15 دقيقة في RT) ، وتم تنفيسها بنسبة 0.4 ٪ Triton X-100 في 1 × PBS (لمدة 10 دقائق في RT). بعد خطوة الحجب (0.1٪ توين -20 ، 2٪ جيش صرب البوسنة في 1 × برنامج تلفزيوني ، لمدة ساعة واحدة عند RT) ، تم تحضين الأغطية بأجسام مضادة لـ B23 الماعز (سانتا كروز) (تخفيف 1: 200 في منع المخزن المؤقت) لمدة 2 ساعات في RT. تم بعد ذلك الكشف عن الأجسام المضادة للماعز باستخدام الأجسام المضادة المضادة للماعز المترافقة مع تكساس الأحمر (Jackson Laboratories 1: 200 in blocking buffer) لمدة ساعة واحدة في RT. بعد الغسيل ، تم تثبيت الأغطية على Vectashield (مختبرات Vector) وعرضها تحت مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر (زايس 410) في قنوات منفصلة (أخضر ، 488 نانومتر أحمر ، 568 نانومتر). ثم تمت معالجة الصور كما كان من قبل.

تحليل لطخة غربية لمستويات التعبير البروتيني لشظايا GFP-WRN المختلفة

بعد حوالي 15 ساعة من تعداء العدوى ، تم جمع الخلايا التي تنمو على أطباق 10 سم (80-90 ٪ متكدسة). تم إعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر / بيليه من المخزن المؤقت لعينة SDS ، وغليها وتحليلها (8 ٪ من العينة) بواسطة SDS-PAGE متبوعًا بصمة غربية مع جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ GFP (Clontech).


2 ب: التركيب والتسلسل والتحليل التوافقي للبروتينات - علم الأحياء

إيريس أ. أ كلاوديو دي نافو ، /> أب خورخي كاسترو- L & # 243pez ، ج آنا جويريرو د Ester Jim & # 233nez-Moreno ، أ Elena M. S & # 225nchez Fern & # 225ndez ، ه فاينا جارك & # 237a-مارت & # 237n ، /> F هيروشي هينو ، F شين إيشيرو نيشيمورا ، /> F Jos & # 233 M. Garc & # 237a Fern & # 225ndez، /> ز كارمن أورتيز ميليت ، /> ه ألبرتو أفينوزا أ Jes & # 250s H.Busto ، أ Gon & # 231alo J.L.Bernardes ، /> د Ram & # 243n Hurtado-Guerrero ، سيج Jes & # 250s M. Peregrina /> ​​* أ وفرانسيسكو كورزانا /> * أ

a Departamento de Qu & # 237mica، Universidad de La Rioja، Centro de Investigaci & # 243n en S & # 237ntesis Qu & # 237mica، E-26006 Logro & # 241o، Spain
بريد الالكتروني: [email protected]، [email protected]

(ب) CIC BioGUNE، Bizkaia Technology، Park Building 800، 48170 Derio، Spain

ج معهد الحوسبة الحيوية وفيزياء الأنظمة المعقدة (BIFI) ، جامعة سرقسطة ، سرقسطة ، إسبانيا

d Instituto de Medicina Molecular، Faculdade de Medicina، Universidade de Lisboa، Avenida Professor Egas Moniz، 1649-028 Lisboa، Portugal

e Departamento de Qu & # 237mica Org & # 225nica، Facultad de Qu & # 237mica، Universidad de Sevilla، E-41012 Sevilla، Spain

كلية الدراسات العليا وكلية علوم الحياة المتقدمة ، مختبر البيولوجيا الكيميائية المتقدمة ، جامعة هوكايدو ، N21 W11 ، سابورو 001-0021 ، اليابان

g Instituto de Investigaciones Qu & # 237micas (IIQ)، CSIC-Universidad de Sevilla، E-41092 Sevilla، Spain

h قسم الكيمياء ، جامعة كامبريدج ، طريق لينسفيلد ، CB2 1EW كامبريدج ، المملكة المتحدة

مركز كوبنهاغن للجليكوميكس ، قسم الطب الخلوي والجزيئي ، كلية طب الأسنان ، جامعة كوبنهاغن ، كوبنهاغن ، الدنمارك

ي Fundaci & # 243n ARAID ، سرقسطة ، إسبانيا

الملخص

مستضد Tn ​​(GalNAc-α-1-ا-Thr / Ser) هو أحد محددات الكربوهيدرات المعروفة المرتبطة بالورم. أصبح استخدام الببتيدات السكرية التي تتضمن هذا الهيكل مكانًا مهمًا وواعدًا للبحث نظرًا لاستخدامها المحتمل كلقاحات مضادة للسرطان. هنا ، التفضيلات المطابقة لببتيد سكري مع مستضد Tn ​​غير طبيعي ، يتميز بثريونين مزين بـ sp 2 تمت دراسة تقليد α-GalNAc من نوع -iminosugar ، في كل من المحلول ، من خلال الجمع بين التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ومحاكاة الديناميكيات الجزيئية ، وفي الحالة الصلبة المرتبطة بجسم مضاد لـ mucin-1 (MUC1) ، عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية. يمكن أن يحاكي مركب Tn المطابق الرئيسي المأخوذ من المستضد الطبيعي في المحلول ويظهر تقاربًا كبيرًا تجاه الأجسام المضادة لـ MUC1. بتشجيع من هذه البيانات ، تم إعداد واختبار لقاح مرشح للسرطان يعتمد على هذا الجليكوببتيد غير الطبيعي والمترافق مع البروتين الناقل Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). إلى حد كبير ، التجارب في الجسم الحي لقد أثبت هذا اللقاح أن هذا اللقاح ينتج مستويات أعلى من الأجسام المضادة المحددة لـ MUC1 IgG مقارنة بالنظير الذي يحمل مستضد Tn ​​الطبيعي وأن الأجسام المضادة التي يتم إنتاجها تتعرف على خلايا سرطان الثدي البشرية بانتقائية عالية. إجمالاً ، نقوم بتجميع الأدلة لتأكيد أن تقديم المستضد ، في كل من المحلول وفي الحالة المرتبطة ، يلعب دورًا مهمًا في فعالية لقاحات السرطان المصممة. علاوة على ذلك ، تثبت النتائج المستمدة من هذا اللقاح أن هناك مجالًا لاستكشاف المزيد من التعديلات على مستوى الكربوهيدرات التي يمكن أن تسهم في تصميم لقاحات أكثر فعالية للسرطان.


شاهد الفيديو: التحليل التوافقي- الدرس الأول-المدرس أنس درغام (شهر فبراير 2023).