معلومة

T7 وضع العلامات بجانب Met

T7 وضع العلامات بجانب Met


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل ستظل علامة T7 تعمل إذا تم وضعها بجوار كودون البدء؟ بمعنى ، هل ستظل تعمل مع Met مرتبط بها في تسلسل الأحماض الأمينية؟

شكرا لك!


من خلال "ما زال يعمل" أفترض أنك تسأل عما إذا كان الجسم المضاد لا يزال يتعرف عليه؟ قد يكون. يتم إجراء عمليات اندماج علامة T7 الداخلية ، على الرغم من أنها قد تتطلب أجسامًا مضادة مختلفة عن عمليات الاندماج ذات العلامات النهائية.

بعد قولي هذا ، هل لديك سبب لإدخال العلامة بعد الميثيونين؟ تبدأ علامة T7 بالفعل بالميثيونين وتعمل بشكل طبيعي لبدء ترجمة الجين T7. تحتوي النواقل المستندة إلى PET أيضًا على هذا الغرض.

[مصدر]

في هذا المتجه ، عادةً ما يتم إدخال الجين الذي يهمك بعد العلامة لإنشاء بروتين اندماج (باستخدام BamHI) أو مباشرة بعد كودون البدء (باستخدام NheI). في كلتا الحالتين ، يتم استخدام كود بدء العلامة T7.


أنت بحاجة إلى موقع ربط ريبوزومي قبل الكودون الأولي.


تختلف أكواد البدء البديلة عن كودون AUG القياسي وتوجد في كل من بدائيات النوى (البكتيريا والعتائق) وحقيقيات النوى. لا تزال تُترجم أكواد البدء البديلة إلى Met عندما تكون في بداية البروتين (حتى لو كان الكودون يشفر حمضًا أمينيًا مختلفًا بخلاف ذلك). وذلك لأنه يتم استخدام نقل منفصل RNA (tRNA) للبدء. [1]

حقيقيات النوى تحرير

تعد أكواد البدء البديلة (غير AUG) نادرة جدًا في جينومات حقيقيات النوى. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن أكواد بدء التشغيل غير AUG التي تحدث بشكل طبيعي لبعض mRNAs الخلوية. [2] سبعة من أصل تسعة بدائل محتملة للنيوكليوتيدات المفردة في كودون بدء التشغيل AUG الخاص باختزال ثنائي هيدرو فولات كانت وظيفية كمواقع بدء الترجمة في خلايا الثدييات. [3] بالإضافة إلى مسار الكودون Met-tRNA Met و AUG الكنسي ، يمكن لخلايا الثدييات بدء الترجمة باستخدام الليوسين باستخدام مادة leucyl-tRNA محددة تقوم بفك تشفير CUG. [4] [5]

المبيضات البيض يستخدم كودون البدء CAG. [6]

بدائيات النوى تحرير

تستخدم بدائيات النوى أكواد بدء بديلة بشكل كبير ، خاصة GUG و UUG. [7]

E. coli تستخدم 83٪ AUG (3542/4284) ، 14٪ (612) GUG ، 3٪ (103) UUG [8] وواحد أو اثنين آخرين (على سبيل المثال ، AUU وربما CUG). [9] [10]

مناطق التشفير المعروفة التي لا تحتوي على أكواد بدء AUG هي تلك الخاصة بـ لاسي (GUG) [11] [12] و لاكا (UUG) [13] في بكتريا قولونية أوبرون لاك. أظهرت دراستان أخريان بشكل مستقل أن 17 أو أكثر من أكواد البدء غير التابعة لـ AUG قد تبدأ الترجمة بتنسيق بكتريا قولونية. [14] [15]

تحرير الميتوكوندريا

تستخدم جينومات الميتوكوندريا أكواد بدء بديلة بشكل أكثر أهمية (AUA و AUU في البشر). [7] العديد من هذه الأمثلة ، مع الكودونات والنطاق المنهجي والاستشهادات ، مذكورة في قائمة NCBI لجداول الترجمة. [16]

الخصائص البيوكيميائية للأحماض الأمينية الغير قطبي قطبي أساسي حمضي الإنهاء: وقف الكودون
الكود الجيني القياسي
الأول
يتمركز
القاعدة الثانية الثالث
يتمركز
يو ج أ جي
يو UUU (Phe / F) فينيل ألانين جامعة كاليفورنيا (سر / ق) سيرين UAU (صور / ص) تيروزين UGU (Cys / C) سيستين يو
جامعة كاليفورنيا يونيون كاربايد كوربوريشن UAC المحتوى الذي ينشئه المستخدمون ج
UUA (ليو / لتر) لوسين ش كاليفورنيا UAA قف (أكسيد الرصاص) [ب] UGA قف (أوبال) [ب] أ
UUG [A] يو سي جي UAG قف (العنبر) [ب] UGG (TRp / W) التربتوفان جي
ج CUU CCU (برو / ف) برولين CAU (صاحب / ح) الهيستيدين CGU (Arg / R) أرجينين يو
CUC CCC كاك CGC ج
CUA CCA CAA (Gln / Q) الجلوتامين CGA أ
CUG [A] CCG CAG CGG جي
أ AUU (إيل / أنا) إيسولوسين ACU (Thr / T) ثريونين AAU (Asn / N) الهليون AGU (سر / ق) سيرين يو
الجامعة الأمريكية بالقاهرة ACC AAC AGC ج
AUA ACA AAA (ليس / ك) ليسين AGA (Arg / R) أرجينين أ
أغسطس [A] (اجتمع / م) ميثيونين ACG AAG AGG جي
جي GUU (فال / V) فالين GCU (علاء / ع) ألانين GAU (Asp / D) حمض الأسبارتيك GGU (Gly / G) جلايسين يو
GUC مجلس التعاون الخليجي GAC GGC ج
GUA GCA GAA (Glu / E) حمض الجلوتاميك GGA أ
GUG GCG أسكت GGG جي
أ كودون AUG كلاً من كود الميثيونين ويعمل كموقع بدء: أول AUG في منطقة ترميز mRNA هو المكان الذي تبدأ فيه الترجمة إلى البروتين. [17] أكواد البدء الأخرى المدرجة بواسطة GenBank نادرة في حقيقيات النوى وعمومًا رموز Met / fMet. [18] ب ^ ^ ^ تم وصف الأساس التاريخي لتعيين أكواد الإيقاف على أنها كهرمان وأصفر وأوبال في سيرة ذاتية كتبها سيدني برينر [19] وفي مقالة تاريخية كتبها بوب إدغار. [20]

تم استخدام tRNAs البادئ الهندسي (tRNA fMet2 مع CUA anticodon) لبدء الترجمة عند كودون التوقف الكهرماني UAG. [21] يُطلق على هذا النوع من الحمض النووي الريبي (tRNA) المصمم هندسيًا اسم الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) لأنه يمنع إشارة إيقاف الترجمة التي تحدث عادةً في أكواد UAG. أظهرت إحدى الدراسات أن الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) البادئ الكهرماني لا يبدأ الترجمة إلى أي درجة قابلة للقياس من أكواد UAG المشفرة جينومياً ، فقط المراسلين المنقولين بالبلازميد مع مواقع Shine-Dalgarno القوية في المنبع. [22]


الملخص

تم حل الاختلافات بين تسلسلين من النوكليوتيدات المنشورة سابقًا لجين العاثية T7 1. يحتوي التسلسل المنقح على ثمانية تغييرات من التسلسل الذي تم استخدامه لتجميع تسلسل النيوكليوتيدات الكامل لـ T7 DNA. لا تغير المراجعات العدد الإجمالي للنيوكليوتيدات في T7 DNA أو العدد المتوقع للأحماض الأمينية في T7 RNA polymerase. يقدم واحد فقط من التغييرات أي تغيير في مواقع الانقسام المتوقعة للنويدات الداخلية التقييدية المعروفة ، وقد تم تأكيد صحة التسلسل المنقح في هذا الموضع عن طريق قطع T7 DNA بالأنزيم المناسب. ومع ذلك ، فإن المراجعات تحدث فرقًا جوهريًا في تسلسل الأحماض الأمينية المتوقعة لـ T7 RNA polymerase: 37 من 883 من الأحماض الأمينية تتغير ، 35 بسبب تحول في إطار القراءة لتمتد واحد من 37 حمضًا أمينيًا. يتوافق إطار القراءة المتوقع عبر هذه المنطقة الآن مع تلك المتنبأ بها لنفس المنطقة من بوليميريز T3 RNA المتماثل. الوزن الجزيئي المحسوب لـ T7 RNA polymerase هو الآن 98856.

تم إجراء هذا البحث في مختبر Brookhaven الوطني تحت رعاية وزارة الطاقة الأمريكية. حصلت باربرا موفات ، طالبة الدكتوراه في قسم الوراثة الطبية بجامعة تورنتو ، على زمالة من حكومة أونتاريو وقسم الوراثة الطبية بجامعة تورنتو.


الشكل 1: كانت التطورات المبكرة في فهم الحمض النووي أساسًا للإفراط في التعبير عن البروتين.

منذ فجر عصر الحمض النووي المؤتلف في سبعينيات القرن الماضي ، شاركت New England Biolabs (NEB) بشكل متكامل في التعبير عن البروتينات وتنقيتها ، من أجل اهتماماتها البحثية وعمليات التصنيع الحيوي. في عام 1978 ، بدأت الشركة في فحص الكائنات الحية الدقيقة بحثًا عن إنزيمات التقييد. يتذكر علماؤنا التحديات التي واجهتهم في تنقية كميات محدودة من الإنزيمات المقيدة والبروتينات الأخرى من الكائنات الحية الأصلية المعزولة عن البيئة. ساعدت جهود هؤلاء العلماء لاستنساخ ، والإفراط في التعبير ، وتنقية إنزيمات التقييد من الأنظمة المؤتلفة على تطوير مجال البيولوجيا الجزيئية. العديد من أساليبهم الأصلية صمدت ليتم تطبيقها من قبل علماء آخرين في دراسة بنية ووظيفة البروتينات الفردية. الآن ، يسعى علماء NEB إلى تطوير طرق سريعة ومبسطة لتعبير البروتين المؤتلف وتنقيته التي تعتمد على مضيفات التعبير البروتيني المهندسة والأنظمة الخالية من الخلايا المحسّنة.

جلبت الفترة من 1966 إلى 1977 سلسلة من الإنجازات الرائعة في العلوم البيولوجية (الشكل 1). خلال ذلك الوقت ، تم تفسير الشفرة الجينية بشكل صحيح ، وعزل الجين الأول ، واكتشفت الإنزيمات التي تقطع الحمض النووي في تسلسلات محددة (إنزيمات التقييد) والتي تلصق قطع الحمض النووي معًا (ligases DNA). مكنت هذه الاكتشافات في نهاية المطاف من استنساخ الجينات الأول وإنشاء أول كائنات دقيقة معدلة وراثيًا. في عام 1977 ، تقدمت تقنيات تسلسل الحمض النووي إلى ما وراء الامتداد الشاق لقواعد قليلة فقط في وقت واحد لتزويد العلماء بالقدرة على فتح المعلومات الجينية المشفرة في جزء معين من الحمض النووي. جعلت التطورات العلمية الملحوظة في ذلك العقد من الإفراط في التعبير عن البروتين وتنقيته أمرًا ممكنًا ، مما أدى إلى تغيير مسار البحوث البيولوجية والطبية إلى الأبد مع تمكين صناعة التكنولوجيا الحيوية من الظهور.

تم تأسيس NEB في عام 1974 بهدف تزويد الباحثين بالإنزيمات المقيدة النقية ، و ligases DNA ، وغيرها من الأدوات اللازمة لاستنساخ الجينات والتعبير عنها. كانت إنزيمات التقييد هي حجر الزاوية في عروض منتجاتنا المبكرة. في ذلك الوقت ، قام علماؤنا بتنقيةهم من البكتيريا المعزولة من البيئة. وقد شكل ذلك العديد من التحديات للإنتاج على نطاق تجاري. على سبيل المثال ، لا يتم التعبير عن إنزيمات التقييد الأصلية بشكل عام بكثرة ويجب تنقيتها خالية من العديد من النيوكليزات الأخرى التي تنتجها الكائنات البرية. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما نشأت صعوبات مع زراعة الكائنات الحية الدقيقة على نطاق واسع.

لتلبية الطلب المتزايد باطراد على مثل هذه الأدوات الجزيئية - ولتقليل التكاليف للعملاء - لجأت شركتنا إلى تقنية الحمض النووي المؤتلف لاستنساخ الإنزيمات والتعبير عنها في بكتيريا المختبر المألوفة ، الإشريكية القولونية. أنتج NEB بعض الإنزيمات المؤتلفة الأولى المتاحة للبيع التجاري ، والتي بدأت خبرة الشركة الطويلة في التعبير عن البروتين المؤتلف. منذ تلك الأيام الأولى ، كانت هذه التقنية جزءًا لا يتجزأ من نجاحنا والتكنولوجيا الحيوية بشكل عام.

على مدار الأربعين عامًا الماضية ، عملنا باستمرار على ابتكار واعتماد منهجيات تعبير جديدة يمكنها تحسين إنتاج البروتينات المؤتلفة - تسويق أكثر من 550 إنزيمًا مؤتلفًا حتى الآن. أدناه ، نسلط الضوء على بعض الابتكارات الرئيسية في التعبير البروتيني التي قادت رحلة شركتنا ، مع الأخذ في الاعتبار النظرة التاريخية والعين نحو المستقبل.

التعبير المبكر عن البروتين المؤتلف
أول الإنزيمات المؤتلفة من بكتريا قولونية عُرضت للبيع في 1980: بوليميريز DNA (Pol I) الذي استنسخه بيل كيلي لأول مرة في مختبر نورين موراي في جامعة إدنبرة ، و T4 DNA ligase ، الذي استنسخه جيف ويلسون في نفس المختبر قبل عدة سنوات. بدأت الأبحاث المتخصصة حول التعبير البروتيني أيضًا في NEB في ذلك العام ، بما في ذلك الجهود المبذولة لإنشاء لقاح ضد الملاريا باستخدام مستضدات سطحية مؤتلفة من الطفيليات. اعتمدت الشركة منهجيات جديدة للاستنساخ والتعبير لاستخدامها مع إنزيمات التقييد لزيادة الغلة وتحسين النقاء وتسهيل توصيف بنية ووظيفة إنزيم التقييد.

تضمن العمل المبكر إنشاء طرق وأدوات لتمكين استنساخ إنزيم التقييد بكتريا قولونية، والتي أصبحت بالفعل معيار الاستنساخ والتعبير ولا تزال كذلك اليوم بالنسبة للبروتينات التي لا تتطلب تعديلات معقدة بعد الترجمة (1). لاستنساخ أنظمة تعديل التقييد الأجنبية بتنسيق بكتريا قولونية والإفراط في إنتاج إنزيمات التقييد الفردية ، كان من الضروري توصيف وإزالة أنظمة التقييد المعتمدة على الميثيل للكائن الحي. تم إجراء العديد من الاكتشافات الرئيسية ذات الصلة بواسطة علماء NEB ، الذين تم تكييفهم وراثيًا بعد ذلك بكتريا قولونية سلالات لتكون متسامحة مع تلك الإنزيمات التقييدية (2).

ناقلات الاستنساخ والمروجين: استخدمت تلك الجهود الأولى في الاستنساخ بكتريا قولونية plasmid pBR322 ، وهو ناقل مبكر طوره فرانسيسكو بوليفار وراي رودريغيز ، وكانا باحثين ما بعد الدكتوراه في مختبر هيرب بوير بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. بالمناسبة ، كان هيرب بوير هو الذي اكتشف إنزيم التقييد EcoRI وأثبت أن النهايات "اللزجة" التي أنشأها يمكن أن تنضم إلى شظايا الحمض النووي من مصادر مختلفة ، مما يجعله أول إنزيم تقييد مفيد لاستنساخ الحمض النووي.

استخدم NEB مشتقات pBR322 التي تحمل λPL (محفز قوي يسار من Lambda bacteriophage) ، والذي يتم التحكم فيه بواسطة درجة الحرارة: "إيقاف التشغيل" عند 32 درجة مئوية و "تشغيل" عند 42 درجة مئوية. لأن pBR322 لديه رقم نسخة معتدل فقط (

30-40 نسخة) لكل خلية ، تحولت الشركة بسرعة إلى بلازميد ذي رقم نسخ أعلى ، pUC19 ، طوره جو ميسينغ في جامعة كاليفورنيا في ديفيس. قدم هذا المتجه مواقع استنساخ متعددة ورقم نسخ أعلى بكثير (

250 نسخة لكل خلية) ، واستخدمت مروجًا من lac operon.

في عام 1984 ، طور ويليام ستوديير من مختبرات Brookhaven الوطنية نظامًا محفزًا لمحفز T7. من خلال طريقته ، يتم استنساخ الجين المستهدف في اتجاه مجرى مروج T7 الذي يتعرف عليه T7 RNA polymerase (من جين مدمج في بكتريا قولونية جينوم سلالات التعبير المهندسة). غالبًا ما يؤدي نظام المروج القوي هذا إلى إنتاج بروتينات غير متجانسة تشتمل على ما يصل إلى 50 ٪ من إجمالي البروتين الخلوي. أصبح هذا النهج شائعًا في كل من NEB وفي جميع أنحاء مجال التكنولوجيا الحيوية.

سرعان ما أثمرت جهود شركتنا الداخلية بشأن إنزيمات التقييد المؤتلف. في عام 1982 ، أصبح PstI أول منتج مستنسخ وعبر عنه علماء NEB. المؤتلف بكتريا قولونية سلالة مفرطة في التعبير حوالي 100 × أكثر من الكائن الحي الأصلي. سمح ذلك للشركة بتخفيض سعر الوحدة لـ PstI بمقدار 20 ضعفًا. بعد ذلك ، قامت الشركة باستنساخ وإفراط في التعبير وبيع عدد متزايد من إنزيمات التقييد كل عام بدءًا من EcoRI و HaeII و HindIII ، ثم تبعها العديد من الإنزيمات الأخرى. اليوم ، يتم تنقية جميع إنزيمات تقييد & gt250 التي تبيعها تقريبًا من استنساخ التعبير المفرط المصنوع بواسطة NEB.

التنقية باستخدام كروماتوغرافيا التقارب
بعد فترة وجيزة من بدء الشركة في إنتاج إنزيمات التقييد المؤتلف ، نشأت الرغبة في الجمع بين التنقية الفعالة وعملية التعبير. في منتصف الثمانينيات من القرن الماضي ، بدأ NEB في البحث عن أحد أنظمة علامات التقارب الأولى ، بدمج تشفير الجينات بكتريا قولونيةبروتين ربط المالتوز (MBP) في الإطار مع الجين المستهدف ذي الاهتمام. يمكن بعد ذلك تنقية بروتين "الاندماج" الناتج باستخدام راتنج كروماتوغرافيا الأميلوز قبل إزالة علامة الاندماج باستخدام بروتياز خاص بالموقع. تم إطلاق نظام انصهار وتنقية البروتين pMAL في عام 1988 في أول مجموعة للشركة لتعبير البروتين وتنقيته. اكتشف لاحقًا أن MBP لديها أيضًا قدرة طبيعية على زيادة قابلية ذوبان البروتينات المستهدفة المدمجة بشكل كبير في بكتريا قولونية.

في السنوات التالية ، ازداد اهتمام علماء التكنولوجيا الحيوية بعلامات التقارب. تم تطوير واستخدام بروتينات اندماج إضافية: على سبيل المثال ، الجلوتاثيون S-ترانسفيراز (GST) ، ومجال ربط الكيتين (CBD) وعلامات الببتيد الصغيرة مثل polyhistidines (poly-His) و FLAG octapeptides و S-tags و streptavidin II و polyarginines (بولي أرج). من بين هؤلاء ، كان وضع علامات poly-His الأكثر تأثيرًا ، والذي طورته شركة Roche في أواخر الثمانينيات. يمكن استعادة بروتينات الاندماج التي تحمل علاماته باستخدام كروماتوغرافيا تقارب المعادن الثابتة (IMAC) ، عادةً باستخدام خرزات Ni 2+ أو الراتنجات. حتى يومنا هذا ، يعتبر الجمع بين تعبير البروتين متعدد العلامات مع IMAC هو النهج الأكثر شيوعًا لتنقية البروتين غير الضاد القائم على التقارب. تتسامح الطريقة مع مجموعة واسعة من الظروف ، بما في ذلك وجود عوامل تغيير طبيعة البروتين ، وتركيزات عالية من الملح ، والمنظفات. يمكن استخدامه أيضًا مع العديد من كواشف تحلل الخلايا الشائعة وعدد من الإضافات العازلة.

عادة ما يتم إزالة علامات التقارب و / أو شركاء الاندماج من البروتينات المؤتلفة المنقاة من خلال الهضم ببروتياز خاص بالموقع. عيب هذا النهج هو أن البروتين المستهدف الذي تم إطلاقه يحتاج إلى تنقيته من العلامة المحررة والبروتياز من خلال خطوات كروماتوغرافيا إضافية. إذا حدث أن احتواء شريك الاندماج على نفس علامة التقارب مثل البروتياز ، فيمكن أن يبسط ذلك تنقية البروتين المستهدف. يتمثل الأسلوب الأكثر شيوعًا في إزالة كل من شريك الاندماج (على سبيل المثال ، 6His-MBP) والبروتياز (على سبيل المثال ، البروتياز TEV الموسوم له) في خطوة التقاط IMAC واحدة. يتم استخدام هذه التقنية في نظام الانصهار والتنقية NEBExpress MBP (الشكل 2).

الشكل 2: نظرة عامة على نظام الانصهار والتنقية NEBExpress MBP (المعروف سابقًا باسم نظام انصهار وتنقية البروتين pMAL) ، حيث يتم دمج البروتين المستهدف في بروتين ربط المالتوز (MBP) لتعزيز القابلية للذوبان والتعبير ، متبوعًا ببسيط. تقنية تنقية TEV = فيروس حفر التبغ

تستخدم طريقة NEB الأخرى لتنقية البروتين المتقارب مجالات بروتينية ذاتية الربط تسمى inteins. تم وصفها لأول مرة في عام 1990 ، وقد ثبت أنها مجال بروتين يمكنه تحفيز استئصاله من البروتين (3, 4). كان باحثو NEB يدرسون inteins بسبب وجودهم في بوليميرات DNA معينة شديدة الحرارة ونتيجة لذلك شاركوا في توضيح آلية تفاعل intein (5). سرعان ما تقاربت هذه الأبحاث مع أعمال أخرى في التعبير البروتيني لتنتج استراتيجية جديدة تتوسطها الوريد لإزالة بروتين الانصهار دون الحاجة إلى الانقسام القائم على البروتياز (6).

في النهج الجديد ، بكتريا قولونية يتيح التعبير عن البروتين المستهدف الذي يحمل علامة مجال ربط intein-chitin (intein-CBD) تنقية بخطوة واحدة باستخدام راتنج الكيتين. عندما تمر محللة الخلية فوق الراتينج ، يتم تجميد بروتينات الاندماج ، يتم تحرير البروتين المستهدف من CBD عن طريق تحفيز الانقسام التلقائي داخل الوريد من خلال إضافة عازلة تحتوي على الثيول أو ببساطة عن طريق تحول الأس الهيدروجيني. قام NEB بتسويق هذا العمل باعتباره مجموعة IMPACT (تنقية بوساطة مع علامة ربط الكيتين تقارب) في أواخر التسعينيات (6).

حل مشاكل التعبير عن البروتين
مع نمو الشركة ، ازدادت أيضًا حاجتها إلى التعبير عن فئات من البروتينات إلى جانب إنزيمات التقييد. قدم هذا التطور تحديات جديدة لأنه لا تعبر جميع البروتينات بشكل جيد (أو على الإطلاق) في بكتريا قولونية. بالإضافة إلى تقديم سلالات التعبير المألوفة BL21 و BL21 (DE3) ، ركز NEB على حل التعبير عن البروتينات "الصعبة". سعى علماؤنا لتحسين قدرة بكتريا قولونية للتعبير عن البروتينات الصعبة ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على روابط ثنائية كبريتيد متعددة
و / أو المجالات الغشائية وتلك التي يمكن أن تكون سامة للخلايا المضيفة.

الشكل 3: التعبير عن البروتين مع روابط ثاني كبريتيد متعددة باستخدام مختص بخلطه الإشريكية القولونية تشكيل رابطة ثاني كبريتيد في السيتوبلازم من النوع البري بكتريا قولونية ليست مواتية ، في حين أن خلط ورق اللعب بكتريا قولونية يمكن أن تطوي هذه البروتينات بشكل صحيح في السيتوبلازم.

البروتينات التي تحتوي على روابط ثاني كبريتيد: روابط ثاني كبريتيد هي روابط تساهمية بعد الترجمة تتكون من أكسدة زوج السيستين. تزيد روابط ثاني كبريتيد الأصلية من ثبات البروتين ، لذلك غالبًا ما توجد في البروتينات الموجودة خارج بيئة السيتوبلازم الغنية بالوصاية - على سبيل المثال ، الببتيدات المفرزة ، والهرمونات ، والأجسام المضادة ، والإنترفيرون ، والإنزيمات خارج الخلية. عندما يتم التعبير عن هذه البروتينات في بكتريا قولونية السيتوبلازم ، قد يكون من الصعب عليهم طيها بشكل صحيح. في عام 2009 ، قام NEB بتسويق سلالات تعبير SHuffle ، والتي تم تصميمها لدعم الطي الصحيح للبروتينات مع روابط ثاني كبريتيد متعددة (الشكل 3). تعبر هذه السلالات بشكل أساسي عن إيزوميراز ثنائي كبريتيد DsbC داخل السيتوبلازم لتعزيز تصحيح البروتينات الميسوكسيدة (7).

الشكل 4: تحليل لطخة غربية من 6 بروتين بروجيا ماليزي الموسوم (يسار) بروتين ملايي معبراً عنه عند 20 درجة مئوية في BL21 (DE3) المختصة بكتريا قولونية (يمين) الأجزاء القابلة للذوبان من بروتين B. malayi المعبر عنها عند 30 درجة مئوية في BL21 (DE3) أو Lemo21 (DE3) المختصة بكتريا قولونية

تعبير غشاء أو بروتين سام: يمثل التعبير عن بروتينات الغشاء تحديًا لمعظم الأنظمة غير المتجانسة ، وغالبًا ما يؤدي إلى تراكم البروتين واختلال تشكيله لأن أجزاء الغشاء كارهة للماء. عند العمل مع بكتريا قولونية كمضيف ، من المفيد التعبير عن هذه البروتينات باعتدال وبالتالي منع تشبع مسار التكوين الحيوي لبروتين الغشاء. NEB's Lemo21 (DE3) المختصة بكتريا قولونية تم تصميم السلالة للتعبير المضبوط لتحقيق التجميع الأمثل لبروتينات الغشاء والطي الأمثل للبروتينات القابلة للذوبان (الشكل 4) (8).

بالنسبة للحالات التي تكون فيها البروتينات غير المتجانسة سامة للخلايا المضيفة ، فإن التحكم بإحكام في التعبير الجيني يمكن أن يحسن قابلية المضيف من خلال الحفاظ على مستويات التعبير عن بروتين هدف سام أقل بقليل من تحمل السلالة المضيفة. في الأنظمة القوية القائمة على محفز T7 ، تتمثل إحدى الوسائل الفعالة للتحكم في التعبير في استخدام سلالة مضيفة تعبر عن بروتين مثبط بوليميريز T7 RNA (LysY) ، كما هو الحال في سلالات Lemo21 (DE3) أو T7 Express lysY / Iq.

للتعبير عن بروتين عالي السمية ، قد يكون من الضروري استخدام نظام تعبير خالٍ من الخلايا. تم إعادة تكوين مجموعة PURExpress في NEB لتخليق البروتين في المختبر من المكونات النقية اللازمة لـ بكتريا قولونية ترجمة. يمكن أيضًا استخدام هذه المجموعة مع محسنات رابطة ثاني كبريتيد PURExpress لتحسين طي البروتين. البديل هو NEBExpress الخالية من الخلايا بكتريا قولونية نظام تخليق البروتين باستخدام محلول الخلية لتوفير تعبير عالي المستوى عن البروتينات المستهدفة من قوالب الحمض النووي الخطية أو البلازميدية. (لمزيد من المعلومات حول التعبير الخالي من الخلايا ، راجع مقالة ب.

مستقبل التعبير عن البروتين
يتطور مجال التكنولوجيا الحيوية لتعبير البروتين باستمرار. تقود التطبيقات مثل هندسة البروتين وعلم الأحياء التركيبي التقدم نحو التعبير البروتيني عالي الإنتاجية. يريد الباحثون الآن اختبار المئات ، بل الآلاف ، من البروتينات المعبر عنها في يوم واحد - لتضييق نطاق تركيزهم بسرعة إلى المتغيرات الأكثر إثارة للاهتمام. بالنسبة لطرق الاستنساخ التقليدية ، فإن إدخال نواقل في سلالة مضيفة لتكاثر الخلية يستغرق عدة أيام. لذا فإن التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا (والذي يمكن تحقيقه في غضون ساعة أو أقل) سيصبح مهمًا بشكل متزايد في السنوات القادمة.

تمامًا كما جاء التعبير البروتيني في الجسم الحي من بدايات متواضعة وتطور لإحداث سلالات مضيفة شديدة الهندسة والمعالجة الحيوية المنظمة ، نتوقع ثورة مماثلة في أنظمة التعبير عن البروتين الخالية من الخلايا. تم تخصيص جيل جديد من علماء NEB لتعزيز التعبير الخالي من الخلايا من خلال هندسة خطوط خلوية جديدة كمصادر استخراج ، وتطوير عمليات تصنيع محسنة خالية من الخلايا (على سبيل المثال ، تقنيات PURExpress أو NEBExpress) ، وتحسين تركيبات النظام الخالية من الخلايا ، واستكشاف الإمكانات لتوسيع نطاق النظام لإنتاج كميات ملليغرام إلى جرام من البروتينات بدون زراعة الخلايا.

مراجع
1 Rosano GL ، Ceccarelli EA. التعبير عن البروتين المؤتلف في النظم الميكروبية. أمام. ميكروبيول. 5 يوليو 2014: 172 https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00341.

2 رالي إي إيه ، ويلسون ج. الإشريكية القولونية K-12 يقيد الحمض النووي الذي يحتوي على 5-ميثيل سيتوزين. PNAS 83 (23) 1986: 9070-9074 https://doi.org/10.1073/pnas.83.23.9070.

3 هيراتا آر وآخرون. التركيب الجزيئي للجين ، VMA1 ، ترميز الوحدة الفرعية التحفيزية لـ H (+) - نقل أدينوزين ثلاثي الفوسفاتيز من أغشية الفراغ في خميرة الخميرة. J. بيول. تشيم. 265(12) 1990: 6726–6733.


التوليف المقولب للأحماض النووية غير الطبيعية

أدى نهج الفوسفوراميديت لتخليق الحمض النووي في المرحلة الصلبة [38 ، 39] الذي تم تطويره في أوائل الثمانينيات إلى الاستخدام السائد للحمض النووي الاصطناعي في عدد لا يحصى من التطبيقات. وبالمثل ، من المتوقع أن تؤدي التحسينات في توليف XNAs إلى زيادة استخدامها وفتح تطبيقات جديدة في العقود القادمة. يمكن تقسيم تخليق XNA على نطاق واسع إلى أساليب إنزيمية وغير إنزيمية. يمكن تصنيع بعض XNAs المستخدمة على نطاق واسع (على سبيل المثال ، 2′OMe ، LNA ، PS ، 2′MOE) كيميائيًا ، على الرغم من أن عوائد حتى أكثر أنواع XNAs التي يمكن الوصول إليها صناعياً تقتصر على حوالي 150 نقطة أساس [40]. بالنسبة إلى كيميائيات XNA الأخرى ، لا يوجد مسار تخليقي موثوق به للمرحلة الصلبة معروف [41]. علاوة على ذلك ، يعتمد تخليق المرحلة الصلبة على معرفة واضحة بالتسلسل الذي يتم تصنيعه. في المقابل ، يتيح التوليف القوالب نقل المعلومات العامة وهو ضروري لتطور قليل النوكليوتيدات الوظيفية.

التوليف غير الأنزيمي النموذجي

يستخدم التوليف غير الأنزيمي النموذجي تقليديًا النيوكليوتيدات المنشطة أو كتل بناء قليلة النوكليوتيد القصيرة التي تنظم ذاتيًا على قالب عبر تفاعلات تقشير القاعدة وتتفاعل مع البلمرة. تم توسيع نسخ القوالب هذا ، الذي كان رائدًا في السبعينيات [42،43،44] ، ليشمل العديد من كيميائيات XNA [45،46،47،48،49،50،51،52،53] ، غالبًا في سياق النواة الحيوية الأولية. تكاثر الحمض. على سبيل المثال ، أنظمة النسخ القوالب لخماسيات PNA [54 ، 55] باستخدام amination الاختزالية فعالة بما يكفي للسماح بتجارب اختيار النموذج [56]. كما تم استغلال استراتيجيات مماثلة لتجميع الأحماض النووية عبر ربط النقر المحفز بالنحاس لأوليغنوكليوتيدات [57 ، 58] وعن طريق ربط الفوسفوراميدات [59] ، وأظهرت العمود الفقري الناتج بعض التوافق الحيوي [60]. في امتداد مثير للاهتمام لهذا العمل ، تم استخدام قوالب الحمض النووي أيضًا لتنظيم الكيانات الكيميائية عن طريق التقارب للتفاعلات المبرمجة [61،62،63]. على وجه الخصوص ، وسعت مجموعة Liu أساليب التخليق النموذجية هذه لربط كيانات مختلفة من الأحماض غير النووية في تسلسلات دقيقة محددة بواسطة قالب DNA [64]. تسمح مثل هذه التركيبات الكيميائية النموذجية بتركيب وتكرار كيميائية متباينة بشكل متزايد دون تقييد تنوع البوليمر من خلال قدرة المونومرات المكونة لها على العمل كركائز للبوليميرات أو غيرها من الإنزيمات المعدلة للحمض النووي.

الربط الإنزيمي وتعديل XNAs

لقد ثبت أن العديد من ligases DNA تقبل ركائز غير طبيعية وقد تم استخدامها بمفردها أو بالاشتراك مع بوليميرات XNA لتخليق أليغنوكليوتيدات XNA. يشبه إلى حد كبير استراتيجيات الربط الكيميائي المذكورة أعلاه ، يسمح الربط الإنزيمي للأوليغومرات المنظمة مسبقًا على قالب بوضع النيوكليوتيدات المعدلة ، بما في ذلك التعديلات المتعددة المختلفة ، في مواقع محددة. لقد ثبت مؤخرًا أن العديد من ligases المتاحة تجاريًا يمكن أن تحفز ربط ركائز XNA بما في ذلك 2′OMe و HNA و LNA و TNA و FANA [41 ، 65]. علاوة على ذلك ، أسفرت أساليب التصميم العقلاني والنمذجة الجزيئية الآن عن أول Ligase XNA من قالب XNA [66]. عملت مجموعات Liu و Hili أيضًا على نطاق واسع مع تخليق الحمض النووي بوساطة ligase من الحمض النووي المتنوع 3 أو 5 mers [67 ، 68] ، مما يسمح بمجموعة كبيرة ومتنوعة من التعديلات ، بما في ذلك الكارهة للماء ، والأليفاتية ، والعطرية ، والحمضية ، و شقوق أساسية ، ليتم دمجها باستخدام هذه "quasicodons" القصيرة. بالاتفاق مع النتائج التي تم الحصول عليها مع تحديدات SOMAmer (بطيئة معدل إيقاف بطيء معدل Aptamer) [22] ، وجدوا أن التوصيف الوظيفي مع الشقوق غير القطبية يبدو أنه يعزز تقارب الاختيار الأسرع وربط aptamer الأقوى [21]. بدمج التنوع الكيميائي غير الموجود في البروتينات (على سبيل المثال ، المخلفات المهلجنة) ، قامت المجموعة بعزل الأبتاميرات عالية التقارب ضد PCSK9 والإنترلوكين 6 [69]. تلخص الاستراتيجيات المذكورة أعلاه نموذج الاستفادة من الخصائص الفريدة للأحماض النووية (أي التوليف المشفر والقابلية للتطور) إلى جانب مجموعة موسعة من البدائل الكيميائية لإنشاء جزيئات وظيفية ذات إمكانات علاجية.

توليف البوليميراز من XNAs

إن البلمرة الإنزيمية للأحماض النووية هي أوامر من حيث الحجم أسرع وأكثر دقة من النسخ أو التوليف الكيميائي ويتم الآن متابعتها من أجل تخليق أليغنوكليوتيد من الجيل التالي [70 ، 71] ، بهدف استبدال تقنية الفوسفوراميديت. وبالمثل ، فإن تخليق XNA الأنزيمي قد يسهل إنتاج أليغنوكليوتيدات XNA. يتم قبول XNAs مع تعديلات محافظة كيميائيًا كركائز بواسطة البوليميراز الطبيعي ، بينما حققت هندسة البوليميرات لقبول نطاق أوسع من ركائز XNA نجاحًا أيضًا [72 ، 73]. في الواقع ، أثبتت بعض البوليميرات أنها قابلة للتكيف بدرجة كبيرة مع ركائز جديدة. بوليميرات عائلة B المحبة للحرارة ، خاصةً تلك الموجودة في بيروكوكس و المكورات الحرارية أجناس ، أثبتت أنها قابلة بشكل خاص للهندسة لركائز XNA [33 ، 74 ، 75 ، 76 ، 77 ، 78 ، 79 ، 80 ، 81]. قد تكون هذه اللدونة الوظيفية مدعومة بالثبات الحراري العالي ، مما يعزز قدرًا أكبر من التسامح مع الطفرات التي من شأنها أن تؤدي إلى زعزعة الاستقرار بشكل مفرط. ومع ذلك ، الأسرة A [82،83،84،85،86،87،88،89،90] والبوليميرات المتوسطة مثل Phi29 [91 ، 92] بالإضافة إلى بوليميرات RNA [93،94،95،96،97 ] تم تصميمها أيضًا لقبول ركائز XNA بنجاح (الجدول 1). ومع ذلك ، فإن كفاءة وإخلاص وحركية البوليميرات المهندسة على ركائز XNA عادة ما تكون معرضة للخطر بالنسبة إلى الإنزيمات الأصلية والركائز الطبيعية. في كثير من الأحيان ، هناك حاجة لظروف "التأثير" (على سبيل المثال ، تركيزات البوليميراز الفائق المقاييس أو وجود Mn 2+ ، والتي بدورها تقلل الدقة) لتعزيز الغلة التركيبية [106].

الاستفادة من اختلاط البوليمرات الطبيعية

ربما يكون من اللافت للنظر أن البوليميرات الطبيعية يمكن أن تتضمن نيوكليوتيدات معدلة على الإطلاق ، نظرًا لحاجتها إلى دقة ودقة ركيزة صارمة. ومع ذلك ، في بعض المواضع في النيوكليوتيدات ، يمكن تحمل التعديلات بسهولة. على سبيل المثال ، التعديلات في الموضع C5 للبيريميدينات والموضع C7 لمشروع N7-deaza-purines في الأخدود الرئيسي على الوجهين ولا تتداخل مع اقتران قاعدة Watson-Crick. لذلك ، حتى المقاربات الضخمة في هذه المواضع يتم تحملها بشكل جيد بواسطة البوليميراز [22 ، 107 ، 108 ، 109 ، 110 ، 111 ، 112]. يمكن أن يسمح التوليف الأنزيمي للنيوكليوتيدات مع المجموعات التفاعلية (على سبيل المثال ، للكيمياء المحفزة بالنحاس) في هذه المواضع بتعديلات متقنة بعد التخليق [113،114،115،116،117].

كما سمحت مرونة البوليميراز للباحثين بإجراء استبدال بالجملة للقواعد الطبيعية بمثيلاتها الكيميائية القريبة [118 ، 119]. في بعض الحالات ، يكون التوليف فعالاً بدرجة كافية لإنتاج منتجات PCR معدلة تصل إلى 1.5 كيلو بايت [119]. علاوة على ذلك ، تم تطوير أزواج قاعدة غير طبيعية جديدة تمامًا (UBPs) بناءً على أنماط ارتباط هيدروجين جديدة [105 ، 120] ، كره الماء [121 ، 122] ، وتكامل الشكل [123 ، 124 ، 125]. يمكن تكرار هذه UBPs بواسطة بوليميرات هندسية وطبيعية ، مما يدل على التوسع الناجح للشفرة الجينية ، وتحقيق ترميز المعلومات مؤخرًا بأبجدية وراثية غير مسبوقة من ثمانية أحرف [120].

توليف XNA في الجسم الحي

يمثل تخليق وتكرار XNAs في الجسم الحي حدودًا مهمة في أبحاث XNA نحو أهداف مثل الترميز المستقر للأحماض الأمينية غير الطبيعية والتعامد الجيني للبيولوجيا التركيبية "جدار الحماية". تحقيقا لهذه الغاية ، تم الآن الاستبدال الكامل للسيتيدين و / أو الثيميدين بنظائر البيريميدين المستبدلة بـ 5 في الجينوم البكتيري عن طريق الهندسة الأيضية الدقيقة والتطور [126،127،128،129].

بشكل ملحوظ ، تمكن روميسبيرج وزملاؤه من الهندسة بكتريا قولونية سلالات لها القدرة على التكرار والحفاظ على زوج قاعدتها غير الطبيعية NaM – TPT3 في كل من السياقات البلازميدية [130] والجينومية [131]. لتحقيق ذلك ، صمموا ناقلًا ثلاثي الفوسفات للنيوكليوزيد [132] ، واستدعوا Cas9 لتحطيم التسلسلات بعد أن فقدت UBP ، وأجروا عدة تعديلات على بكتريا قولونية آلات تصنيع وإصلاح الحمض النووي. أظهروا كذلك توافق UBP مع آلات الترجمة لترميز الموقع على وجه التحديد للأحماض الأمينية غير الطبيعية [١٣٣ ، ١٣٤]. من المحتمل أن تتبع المزيد من الكائنات شبه الاصطناعية ذات الجينومات المستبدلة أو القدرة على نشر UBPs هذه النجاحات المبكرة [135 ، 136].

التطور الموجه لهندسة بوليميراز XNA

في حين أن تعديلات القاعدة وحتى أزواج القواعد الجديدة تمامًا يتم تحملها بواسطة البوليميرات الطبيعية بدرجات متفاوتة ، فإن التعديلات التي يتم إجراؤها على السكر والعمود الفقري بشكل عام تكون أكثر صعوبة ، خاصة عند الاستبدال الكامل. لتحسين النشاط مع هذه الركائز غير الطبيعية ، غالبًا ما يتم استخدام مناهج هندسة البوليميراز ، بدءًا من الهندسة العقلانية المدفوعة بالرؤى الهيكلية أو التحليل الحسابي إلى الفحص والتطور الموجه. من بين هذه الطرق ، كانت الأساليب القائمة على المستحلب وعرض الملتهمة مفيدة بشكل خاص [137 ، 138].

تم استخدام مجموعة من استراتيجيات التطور الموجهة في هذا المجال. يتحدى التكاثر الذاتي المجزأ (CSR) [139.140.141] البوليميرات لتضخيم الجين الخاص بها داخل حجرة المستحلب. الإثراء الأسي للنسخ النشطة للغاية ، بدلاً من التقسيم البسيط للمتغيرات النشطة ، يجعل المسؤولية الاجتماعية للشركات طريقة قوية. However, it places stringent demands on polymerase performance, which are somewhat relieved in short-patch CSR (spCSR) [85] where amplification is confined to only a short section of the polymerase gene. Nested CSR allows selection of sequences or features not present in the polymerase gene itself (e.g., novel base pairs, reverse transcription of XNA templates) by using out-nesting primers with these features during the CSR amplification step [79, 86]. A further extension called compartmentalized partnered replication (CPR) can be used to select for enzymatic activities other than nucleic acid polymerization by constraining the selectable PCR reaction by the fitness of a partner gene [86, 142]. Recently, CSR has also been adapted for isothermal amplification reactions (iCSR), both at high temperatures [143] and at lower temperatures for evolution of non-thermostable enzymes [91]. Compartmentalized self-tagging (CST) [144] allows selection for much more difficult substrates or conditions selection is based on a primer extension templated by the encoding plasmid. The biotinylated primer along with any plasmids that have been “captured” by sufficient primer extension are partitioned on streptavidin beads. CST has yielded polymerases for a range of XNAs [78], most recently for dxNA [145]. In contrast to bulk emulsification methods, microfluidic devices have been used to generate highly homogeneous emulsion droplets, enhancing the ability to accurately distinguish small incremental improvements important in stepwise selections [146, 147]. Another directed evolution strategy is phage display, whereby polymerases displayed on phage particles are challenged to extend a primer with separable (e.g., biotinylated) nucleotides [80, 89, 148]. In a notable recent use of phage display for polymerase evolution, Chen et al. identified several Taq variants capable of synthesizing and reverse transcribing 2′OMe RNA [88], an XNA of particular interest for therapeutics due to its high biostability and nuclease resistance.

Rational engineering of XNA polymerases: structural insights

Polymerases make many key contacts with the incoming nucleotide triphosphate and primer strand during the catalytic cycle [149]. Structures of polymerases in complex with modified substrates may therefore aid in both rational engineering and retrospective understanding of XNA polymerases. Recently, Kropp et al. solved ternary structures of KlenTaq polymerase with a C5-modified cytidine at each of six successive positions [150] in the catalysis cycle, recapitulating the movement of the modified substrate through the polymerase’s active site and revealing a surprising level of flexibility in both the modified nucleotide and the interacting polymerase residues to accommodate the modification.

Further structural insight into XNA polymerization has been reported by Singh et al. [151] with structures of an engineered KlenTaq in a binary pre-incorporation and a ternary post-incorporation complex with the unnatural base pair dZ:dP. Although none of the mutated amino acids are in direct contact with primer, template, or incoming dZTP, the structure suggests that increased flexibility, particularly in the thumb subdomain, and an increased angle of closure in the finger subdomain facilitate primer elongation with the unnatural base pair.

Chim et al. recently reported ternary structures of a hyperthermophilic B-family polymerase, an engineered KOD mutant, polymerizing TNA [152]. Given the prevalent use of B-family hyperthermophiles in polymerase engineering, the structures of the apo, binary, and ternary polymerase complexes will prove useful in developing hypotheses for further work in the field. Subsequently published ternary structures of KOD and 9°N with DNA primer and template and an incoming dNTP [149, 153] suggest possible explanations for the predisposition of hyperthermophilic archaeal B-family polymerases to engineering: an unusually wide and positively charged channel between the finger and thumb subdomains may allow space for substrate modifications while maintaining strong binding to the template and high processivity. Additionally, whereas the primer template duplex adopts an A-form in the active site of A-family polymerases, it adopts a B-form in KOD, possibly contributing to accommodation of nucleotide modifications in the B-form duplex’s wider major groove.

Rational engineering of XNA polymerases: translation of mutations across substrates and polymerases

There are numerous examples of transferable mutations across XNA substrates and polymerases. A recent report [154] details engineering of a previously described Taq mutant to better incorporate 2′ modified XNAs. From kinetic data on incorporation of different 2′ modified nucleotides, relevant mutations from the literature were chosen based on the hypothesis that the rate-limiting step may be recognition of the modified primer strand. Several mutants showed enhanced synthesis of 2′F and 2′OMe and/or reverse transcription of 2′OMe RNA. In another instance, diversification at eight “specificity determining residues” selected by computational analysis, evolutionary conservation, and literature precedent yielded improved polymerases for RNA and TNA [75]. Furthermore, testing the top mutation sets in the context of different homologous B-family polymerases evidenced their general utility as well as revealing the structural context in which they functioned best. Similarly, polymerase synthesis of increasingly diverse XNAs was achieved with a TNA polymerase by combining the TNA sugar with base modifications known to be polymerase-compatible [31, 32]. While it has been generally believed that mutation of conserved residues is highly deleterious, it is becoming increasingly apparent through this and other work that such mutations can be key in allowing activity with unnatural substrates [75, 155].

ليو وآخرون. recently reported engineering of a polymerase to synthesize a newly described XNA, tPhoNA, with both sugar and backbone modifications [33]. Impressively, the polymerase engineering strategy consisted solely of successive introduction and evaluation of mutations at positions known to affect synthesis for other XNA substrates. Their success is a testament to the accumulating knowledge base in the field of polymerase engineering and the extraordinary ability of a small number of specific key mutations to confer an expanded substrate spectrum.

RNA polymerases have also been engineered to synthesize XNAs. It has been shown that T7 RNAP can transcribe content-expanded RNA from DNA containing the Ds-Pa UPB as well as further modified Pa bases [103]. Through a small screen of previously identified mutations, Kimoto et al. identified a T7 RNAP mutant that incorporates 2′-F uracil and cytidine triphosphates and shows improved incorporation of Pa nucleotides and their analogues in difficult sequence contexts [93]. Surprisingly, several bulky modifications of the Pa nucleotide designed to expand chemical diversity for aptamer and ribozyme selections appear to be even better substrates than the original Pa triphosphates. Similarly, a Tgo polymerase mutant previously evolved to synthesize HNA was recently shown to incorporate HNA nucleotides with various aromatic modifications on the uridine base [35]. Here too, some of the bulkier base modifications demonstrated superior incorporation.

Reverse transcription of XNAs

Identification of enzymes capable of reverse transcribing XNAs demonstrates the potential of these divergent chemistries as genetic materials and is crucial for in vitro selections [156]. Some XNAs can be reverse transcribed by natural polymerases (e.g., TNA and FANA by Bst polymerase [157,158,159]). Alternately, engineering approaches must be taken [79, 88]. A small number of mutations in Tgo polymerase yielded a reverse transcriptase with a generally expanded substrate spectrum that can reverse transcribe several XNAs to DNA [29, 78].

Analysis of XNAs and XNA polymerases

One difficulty in working with XNAs is that they are often incompatible with traditional methods of nucleic acid manipulation or analysis such as restriction enzymes and sequencing technologies. Thus, an important parallel effort to the development of XNAs and XNA polymerases is the development of tools to analyze them. For example, fidelity has not been evaluated in detail for many of the described XNA polymerases. A recent method for assaying fidelity reported finding that even relatively small and natural RNA modifications can significantly increase polymerase error rates [160]. Deep sequencing has also been used to investigate error profiles and polymerase read-through of templates with backbone modifications [161] and found that some commonly used isosteric modifications, such as phosphorothioates, caused significant copying errors. This fidelity data foreshadows an important limitation in enzymatic XNA synthesis that will likely need to be addressed as the field moves forward. On the other hand, the promiscuous behavior of polymerases has been leveraged to read and record the presence of epigenetic DNA and RNA modifications via misincorporation “signatures” at the modifications [162,163,164,165,166,167,168,169,170]. In addition, the first instance of direct sequencing of an XNA was recently reported FANA was sequenced using nanopore technology, albeit with relatively short read lengths [171].

An XNA particularly limited by a lack of tools is L-DNA. Such “mirror image” DNA provides both complete orthogonality in macromolecule-scale features and interactions, while maintaining identical properties to DNA at the chemical level. Thus, enzymatic synthesis of L-DNA requires mirror image polymerases made of D-amino acids. Zhu and colleagues first made the D-form of the smallest known polymerase, African Swine Fever Virus polymerase X, and used it to synthesize L-DNA, showing that the polymerase was strictly enantio-specific with no crossover inhibition from D-nucleotide triphosphates [102]. The group subsequently reported synthesis of a mutant of the larger thermostable Dpo4 polymerase with D-amino acids, which enabled PCR amplification of an L-DNA product [99, 100]. Klussmann and colleagues had also reported synthesis of a D-Dpo4 mutant [101], which was used to assemble gene-length L-DNA sequences. A mirror image ligase has also been reported [172]. Mirror image nucleic acids are of immense interest for therapeutics and are being actively pursued in research and clinical development [173]. However, their usage remains limited by the arduous process of synthesizing D-polymerases and the incompatibility of L-DNA with traditional nucleic acid manipulation tools.


شكر وتقدير

كلغ. is a Wellcome Trust senior investigator and works in the Gull lab. على سبيل المثال is a Royal Society University Research Fellow and works in the Gluenz lab. S.D. and R.W. are Sir Henry Wellcome Fellows. S.D.: initiated the project, pPOT development, long primer PCR optimization, T. بروسي microscopy examples, T. بروسي BSF and PCF transfection optimization, perl primer design tool planning and wrote the paper. J.D.S.: long and fusion PCR optimization, pLENTv2 development, T. بروسي microscopy examples, L. mexicana microscopy examples and wrote the paper. R.W.: Leishmania transfection and cloning, recombination rate, JavaScript primer design tool and wrote the paper. I.H.: wrote perl primer design tool. E.G.: pLENTv1 development and wrote the paper. كلغ. coordinated the study and wrote the paper. All authors gave final approval for publication.

Funding statement

K.G., S.D. and R.W. are funded by the Wellcome Trust and E.G. by the Royal Society.


دعم المعلومات

S1 Fig

(A) Scheme depicting the bicistronic lentiviral constructs for expressing SARS-CoV-2 N protein with C-terminal Flag tag. (B) Representative flow cytometry plots demonstrating efficient lentivirus transduction. Caco-2 cells were transduced with pLVX-N-Flag-IRES-mCherry or not transduced. Flow cytometric analysis was performed 4 d following transduction to quantify the frequencies of N-expressing cells. The flow cytometry result was representative of one of three independent experiments.

S2 Fig

(A) GFP expression in Caco-2-N cells electroporated with SARS-CoV-2 GFP/ΔN RNA. Caco-2-N cells were electroporated with 20 μg of SARS-CoV-2 GFP/ΔN RNA. From 21h-96h p.t., GFP expression in the cells was observed with microscopy. (B) GFP expression was quantified by flowcytometry at 96h post transfection of the RNA. This experiment was representative of three independent experiments.

S3 Fig

(A) RT-PCR products from P10 virus infected cell passage were cloned into pEASY-Blunt vector, and 12 colonies were randomly chosen for DNA sequences analysis. Multiple deletions were detected in the amplicon. (B) Categories of mapped reads from P1 and P10 virus infected Caco-2-N cells. (C) Canonical discontinuous transcription (top) that is mediated by TRS-L (TRS in the leader) and TRS-B (TRS in the body). Quantification of junction-reads from canonical discontinuous transcripts post P1 and P10 virus infection.

S4 Fig

(A) Flag tagged N protein was immunoprecipitated from Caco-2-N cells infected with recombinant SARS-CoV-2 GFP/ΔN trVLP using Flag antibody, and the proteins were analyzed on SDS-PAGE gel. The proteins were visualized by Coomassie blue staining. N, G3BP1 and G3BP2 were labelled. (B) Phosphorylated peptides of N protein derived from Caco-2-N cells. Caco-2-N cells in which N was C-terminal Flag-tagged were collected and cell lysates were immunoprecipitated with anti-Flag coupled beads. Phosphorylated peptides of the immunoprecipitates were analyzed by mass spectrometry.

S1 Table

S2 Table


Nonradioactive In Situ Hybridization

Brent M. Bany , David G. Simmons , in The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy , 2014

DNA Template Generation—Alternate PCR-Based Methods

DNA templates for in vitro transcription of your gene of interest can be generated containing T7, T3, or SP6 RNA polymerase-binding sites directly without cloning. This can be done by adding the RNA polymerase-binding site sequences to the ends of the PCR oligonucleotides ( Figures 2 and 3 ). This eliminates the cloning steps and prevents the presence of multiple cloning site sequences in the riboprobe.

الشكل 2 . ISH probe synthesis from PCR-derived template.

For each gene-specific template, set up one reaction using T7 RNA polymerase and a separate reaction using T3 RNA polymerase (or SP6 RNA polymerase if used) to generate the sense and antisense probes for your gene of interest. In this example, a transcription reaction using T7 RNA polymerase would produce the sense probe, while a reaction with T3 RNA polymerase would produce the antisense probe (assuming the reading frame of the DNA is from right to left).

Figure 3 . RNA polymerase promoter sequences.

Add desired promoter sequences to 5′ end of PCR primers.

Care must be taken to generate clean PCR products, and they should always be sequence verified (e.g., using RNA polymerase sequencing oligonucleotides). If the PCR reactions are very “clean” and produce only a single band, they can be isolated with PCR cleanup kits directly. Alternatively, the correct size amplicons can be gel purified for RNA probe synthesis. The amplicon template preparations can be easily quantified using a Nanodrop spectrophotometer at least 100 ng are used per in vitro riboprobe transcription.


الاستنتاجات

Collectively, CEL-Seq2 benefits from optimized primers, reagents, clean-up, and library preparation step. Together, these modifications greatly improve the quality of the data and make CEL-Seq2 more time- and cost-efficient. Furthermore, our Fluidigm C1-enabled cell-barcoding allows for a single library construction, instead of working individually to set up the library preparation for each cell. Our improvements will also be able to be implemented in the inDrop and Drop-Seq methods [15, 16].


Dispatch from the Sea of Japan: Tagging takes teamwork

The Conservation & Science team at the Monterey Bay Aquarium has worked for more than two decades to understand and recover bluefin tuna populations – particularly Pacific bluefin tuna, whose population has declined historically due to overfishing. A key piece of our efforts is tagging bluefin tuna in the wild so we can document their migrations across ocean basins. Much of our work takes place in the Eastern Pacific, but this month we’re partnering with Japanese colleagues to tag bluefin tuna in the Sea of Japan. Tuna Research and Conservation Center Research Technician Ethan Estess, working with Program Manager Chuck Farwell, is chronicling his experience in the field. This the first dispatch in his series.

Tags are laid out on a tatami mat, prepped and ready for use when the tagging team heads out to sea.

The alarm buzzes beside my head and, opening my eyes, I have no idea where I am.

I’m lying on the floor of a room covered wall-to-wall in woven straw mats, with rice paper windows and a table rising a foot off the ground. حق. اليابان. Sado Island in the Sea of Japan, where I’m sleeping on a traditional tatami mat. Yesterday’s cannery whistle is blowing back home at the Monterey Bay Aquarium at noon, but my 4 a.m. alarm tells me it’s time to get up and find some Pacific bluefin tuna.

One year ago, I sat in a third-floor office at the aquarium with my colleague Chuck Farwell and Dr. Ko Fujioka from Japan’s National Research Institute of Far Seas Fisheries as we went through the steps necessary to deploy a satellite tag on a bluefin tuna. We discussed the tag attachment system that anchors the small electronic device to the animal for up to a year at a time, as well as the process for programming the tag’s onboard computer to record the whereabouts and behaviors of these wide-ranging fish.

Pacific bluefin tuna migrate across the ocean, from spawning grounds off Japan to feeding grounds in the Eastern Pacific.

This exchange of techniques was the first step in a formal partnership between the Monterey Bay Aquarium and the Japanese government to support collaborative research between our institutions. Now we’ve met up again, on a small island between Japan and Korea, to tag large bluefin together.

The animals we’re here to study don’t respect national boundaries. Dr. Fujioka has tagged many small (about 6-pound) Pacific bluefin in Japan with electronic tags, and his data show that these young tunas swim 6,000 miles across the Pacific to grow up while feeding in the productive waters of the California Current. Our team at the Tuna Research and Conservation Center has focused on tagging 2- to 3-year-old (about 25-60 pound) bluefin off Southern California, and we’ve found that many swim back to their home waters off Japan.

It took me 12 hours and a load of jet fuel to get to Japan. Bluefin can swim au natural across the Pacific in under a month.

To sustainably manage bluefin stocks, you need to know how many tuna are out there, a challenging prospect for animals that call the entire North Pacific home. The best way to solve the puzzle is to use electronic tagging technologies to reveal migration routes, exchange rates, and catch rates between the Eastern and Western Pacific. Most importantly, we need to improve the understanding of bluefin spawning habits. These data then can feed into statistical models that determine what a sustainably fishing level for bluefin should be.

Bluefin tuna tagging team heads to the harbor for their first day at sea in Japan.

To reconstruct a complete picture of the natural history of the Pacific bluefin and to inform the management of the international fishery, an East-West research partnership is a must.

I rush downstairs from my hotel room and find Chuck, Dr. Fujioka, and a team of researchers from Kendai University waiting in the lobby. We set off down the quiet streets of the fishing village and jump in a van to meet our fishing boat. We head up the winding coastline of Sado Island, passing clusters of traditional Japanese homes and rice paddies. Twenty minutes later we reach a seemingly abandoned harbor and don our foul-weather gear, life jackets, hardhats and boots. We’re triple-checking our equipment when a group of 20 hard-hat-wearing fishermen arrive, and the dock erupts into a flurry of activity. We’re hustled onto a large barge and we’re out to sea.

The tagging team waits patiently on deck for their first opportunity to put a tracking tag on a Pacific bluefin tuna.

The Sado Island fishing cooperative we’re working with uses a large “set-net” to trap bluefin. Schools of tuna migrating along the coast are channeled via a complex series of net barriers into increasingly smaller net chambers. We’ll check the trap for bluefin each day for the next three weeks.

A second vessel arrives, and the crew of fishermen begins the arduous task of hauling in the football-field-sized net by hand, shrinking the size of the chamber with each hoist. I’m pacing the deck in anticipation, then look up as a call is raised: “MAGUROOOOO!” A fisherman has spotted a large bluefin in the trap!

It’s a tense atmosphere over a year of preparation has brought this team together for this moment, and everybody is hoping for success. Tunas are sensitive animals their eyes are easily damaged through improper handling, and excessive stress from capture can be fatal. Chuck has worked with tuna for 30 years at the aquarium, and around the lab we call him the “Tuna Whisperer.” He’s been training the Japanese team on tuna-handling practices, and we hope that with gentle treatment, good seawater irrigation of the tuna’s gills, and a quick surgical procedure, we will have the tagged bluefin back in the ocean in no time.

Skilled Sado Island fishermen wrap their net around a bluefin tuna before it’s brought aboard for tagging.

A large dip net attached to a crane swiftly scoops the tuna out of the water and hoists it over to the surgery pad, where Chuck and student Kota Sebe quickly place a seawater hose into the fish’s mouth, simultaneously sliding a cover over its eyes to calm it. Dr. Fujioka moves in and, finding the appropriate location and angle, anchors the electronic tag on the tuna’s back. دكتوراه. student Hiroyuki Yamane uses scissors to snip a small piece of fin for genetic tests and runs a measuring tape run along the length of the body: 145 centimeters. That translates to a 130-pound bluefin!

One minute later, the eye cover and hose are removed and with an ichi, ni, san (one, two, three), we hoist the tuna up and slide it over the rail. We watch it swim away into the Sea of Japan.

With high-fives all around, we’re excited to begin our cross-Pacific bluefin tagging collaboration on such a high note. This first tagged fish is roughly 5 years old, the exact age-class we want to learn more about. We must wait for eight months before the tag automatically detaches from the tuna and floats to the surface, sending back its stored data about the tuna’s travels, the ocean temperatures it favored and its swimming depth. This information will help us uncover the secrets of bluefin tuna spawning and inform sustainable management of this important species.

Stay tuned as we work together with our Japanese colleagues to put out more satellite tags in the coming weeks. Domo arigato gozaimasu! (Thank you very much!)

Fujioka, Ko, Masachika Masujima, and Andre M. Boustany. “Horizontal Movements of Pacific Bluefin Tuna.” Biology and Ecology of Bluefin Tuna (2015): 101.


Download and print this article for your personal scholarly, research, and educational use.

Buy a single issue of علم for just $15 USD.

علم

Vol 355, Issue 6325
10 February 2017

Article Tools

Please log in to add an alert for this article.

By Shixian Lin , Xiaoyu Yang , Shang Jia , Amy M. Weeks , Michael Hornsby , Peter S. Lee , Rita V. Nichiporuk , Anthony T. Iavarone , James A. Wells , F. Dean Toste , Christopher J. Chang

علم 10 Feb 2017 : 597-602

An oxaziridine reagent selectively modifies proteins at methionine amino acid side chains via S=N bond formation.


شاهد الفيديو: Valon Syla: Azem Vllasi ka informacione për veprimtaret e ilegales (شهر فبراير 2023).